劉秋婷 蘇妙貞 陳丹霞 蘇嘉妮 周 露

（廣東省食品檢驗(yàn)所 廣東廣州 510435）

1 前言

大腸桿菌O157:H7（簡(jiǎn)稱(chēng)O157:H7）是有周鞭毛且不產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陰性桿菌。1982年，O157:H7型腸出血性大腸桿菌食物中毒事件首次在美國(guó)發(fā)生，隨后該菌引起的食物安全問(wèn)題相繼在德國(guó)、美國(guó)、加拿大、日本、中國(guó)等地區(qū)出現(xiàn)，受到全球民眾的廣泛關(guān)注[1-3]。人類(lèi)食用O157:H7污染的食物后，最常見(jiàn)的癥狀是腹瀉，嚴(yán)重者會(huì)引起出血性腸炎、血小板減少性紫癜、溶血性貧血等致死率高的食源性疾病[4，5]。 O157:H7在低溫、強(qiáng)酸環(huán)境下容易存活，主要存在于牛肉、羊肉、豬肉、乳制品等食品中，可通過(guò)人與人接觸和飲水進(jìn)行傳播。因此，我國(guó)將其列為21世紀(jì)可能對(duì)中國(guó)人群公共衛(wèi)生健康有重大影響的12種病原微生物之一[6，7]。GB 4789.36—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)》[8]規(guī)定各種食品中不得檢出O157:H7。

為了加強(qiáng)食源性致病菌的檢測(cè)能力，提高實(shí)驗(yàn)室對(duì)O157:H7的檢驗(yàn)鑒定水平，廣東省食品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)室在2019年11月參加了英國(guó)食品分析實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量評(píng)估體系（FAPAS）組織的能力驗(yàn)證活動(dòng)，驗(yàn)證從牛肉中分離鑒定O157:H7的能力，為O157:H7的檢測(cè)提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品

英國(guó) FAPAS組織方提供了2份樣品，樣品編號(hào)為M247d11A和M247d11B。

2.1.2 培養(yǎng)基和試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）；改良 EC肉湯（mEC+n）；改良山梨醇麥康凱瓊脂（CT-SMAC）；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-MUG（MUG-LST）；三糖鐵瓊脂（TSI）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂；氧化酶試劑；革蘭氏染色液；大腸埃希菌O157:H7生化鑒定盒（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；大腸桿菌O157免疫磁珠分離檢測(cè)試劑盒（天津生物芯片技術(shù)有限公司）；CHRMAGAR O157顯色培養(yǎng)基（法國(guó)科瑪嘉公司）；革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡（GN卡）；VIDAS UP E.coli O157:H7試劑盒（法國(guó)梅里埃生物有限公司）；大腸埃希菌斷血清 O157；大腸埃希菌診斷血清H7（寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司）。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

大腸埃希菌 O157:H7（NCTC12900）；大腸埃希菌（ATCC25922）。

2.2 儀器

磁力架-樣品混合器（Dynal）均質(zhì)器（IUL）；生物安全柜（賽默飛世爾公司）；生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；顯微鏡（卡爾蔡司）；暗箱式四用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；VITEK 2compact全自動(dòng)微生物快速檢測(cè)分析系統(tǒng) （法國(guó)梅里埃公司）；VIDAS 30全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀（法國(guó)梅里埃公司）。

2.3 方法

參照英國(guó)FAPAS實(shí)驗(yàn)室提供的O157:H7的作業(yè)指導(dǎo)書(shū)進(jìn)行前處理和GB 4789.36—2016第二法免疫磁珠捕獲法進(jìn)行O157分離鑒定和生化血清鑒定，并借助VIDAS 30全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行初步快速篩選，同時(shí)以VITEK 2 compact全自動(dòng)微生物快速檢測(cè)分析系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.3.1 樣品處理

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行水化，在生物安全柜開(kāi)啟樣品瓶蓋，樣品M247d11A和M247d11B中各添加20 mL BPW進(jìn)行水化并輕輕翻轉(zhuǎn)樣品瓶幾次以充分混勻，將樣品在室溫下放置28～30 min，即可測(cè)試。

2.3.2 增菌

以無(wú)菌操作將2份樣品分別加入225 mL改良EC肉湯中，用均質(zhì)器連續(xù)拍打1～2 min，在36℃條件下培養(yǎng)24 h。同時(shí)取陽(yáng)性對(duì)照菌NCTC12900大腸埃希菌O157:H7和陰性對(duì)照菌ATCC25922大腸埃希菌于225 mL改良EC肉湯中，在36℃條件下培養(yǎng)24 h，后續(xù)同步進(jìn)行選擇性分離與生化鑒定實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 免疫磁珠捕獲與分離

將1.5 mL滅菌離心管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號(hào)，在管中加入20 μL免疫磁珠，然后加入1 mL樣品增菌液，振蕩混勻后將離心管夾在混合器上，以12 r/min轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)混合10 min。取下離心管，放在磁力架的孔中，靜置3 min，磁珠被吸附在管壁上形成棕色聚集物，輕輕吸走管中上清液。加入1 mL洗脫緩沖液重懸磁珠，將離心管顛倒混合5～8次，再置于磁力架中，靜置3 min，吸走多余液體。重復(fù)洗滌一次，最后加入50 μL洗脫緩沖液重懸磁珠。各吸取25 μL免疫磁珠懸液至CT-SMAC平板和改良O157顯色瓊脂平板一側(cè)，然后用無(wú)菌涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半，再用接種環(huán)劃線接種平板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，在36℃±1℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察2種平板上的菌落特征。

2.3.4 VIDAS 30全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)檢測(cè)

依據(jù)VIDAS UP E.coli O157:H7試劑盒說(shuō)明書(shū)，取1 mL增菌后的改良EC肉湯，在100℃水浴中煮沸10 min。冷卻至室溫后，取0.5 mL增菌液至VIDAS大腸埃希菌O157試劑條的樣品孔中，按儀器操作規(guī)程進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.5 生化實(shí)驗(yàn)

挑取2.3.3得到的大腸埃希菌O157:H7可疑菌落接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行純化，36℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行生化鑒定和VITEK 2 Compact鑒定實(shí)驗(yàn)。

2.3.6 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)

對(duì)符合生化鑒定和VITEK 2 Compact鑒定結(jié)果的菌株進(jìn)行血清學(xué)鑒定。采用玻片凝集試驗(yàn)，在潔凈玻片上2個(gè)不同區(qū)域各滴1滴O157血清和H7血清，在另一干凈玻片加入1滴生理鹽水做對(duì)照，用接種環(huán)挑取菌落分別與血清和生理鹽水研磨混勻，輕輕搖動(dòng)玻片1min，對(duì)照黑背景觀察有無(wú)凝集現(xiàn)象。1min內(nèi)呈明顯凝集者為陽(yáng)性，呈均勻渾濁者為陰性。

3 結(jié)果與分析

3.1 免疫磁珠捕獲與分離結(jié)果

樣品M247d11A、M247d11B、陽(yáng)性對(duì)照大腸埃希菌O157:H7、陰性對(duì)照大腸埃希菌經(jīng)過(guò)免疫磁珠富集和平板劃線分離后，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

3.2 VIDAS 30全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)檢測(cè)和VITEK鑒定結(jié)果

使用VIDAS UP E.coli O157:H7試劑盒檢測(cè)后，樣品M247d11A為O157:H7陽(yáng)性，樣品M247d11B為O157:H7陰性。VITEK檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品M247d11A檢出O157:H7，樣品M247d11B未檢出，兩者的鑒定結(jié)果一致，詳見(jiàn)表2。

表1 免疫磁珠捕獲與分離結(jié)果

表2 VIDAS 30全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)檢測(cè)和VITEK鑒定結(jié)果

3.3 生化鑒定結(jié)果

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.36—2016進(jìn)行鑒定，可以判斷M247d11A檢出O157:H7，M247d11B未檢出O157:H7，詳見(jiàn)表 3。

表3 生化鑒定結(jié)果

3.4 血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

將M247d11A和M247d11B上的可疑菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)后，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.36—2016第二法中血清學(xué)試驗(yàn)要求用O157和H7診斷血清做玻片凝集試驗(yàn)，詳見(jiàn)表4。

表4 血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

本次能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)先用BPW肉湯進(jìn)行水化，再加入改良EC肉湯進(jìn)行前增菌，這樣可以激活樣品中目標(biāo)菌的生物學(xué)特性[9]，避免出現(xiàn)假陰性，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。由于O157:H7編碼的β-葡萄糖醛酸酶無(wú)活性，不能分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷產(chǎn)生熒光，樣品M247d11A觀察到的MUGLST為無(wú)熒光現(xiàn)象，結(jié)果表現(xiàn)為陰性，這對(duì)區(qū)分各種大腸桿菌具有重要作用。O157在顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)淡紫色，而其他桿菌呈現(xiàn)無(wú)色或被抑制，其抗干擾能力和特異性均比較強(qiáng)，在24 h內(nèi)即可觀察菌落形態(tài)，減少產(chǎn)生假陽(yáng)性菌的機(jī)率[10]。而在CT-SMAC平板中，由于O157:H7不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇，故在平板上為圓形，無(wú)色，中心呈現(xiàn)灰褐色的菌落。日常檢驗(yàn)中可以根據(jù)O157:H7的這幾個(gè)主要生物學(xué)特征，初步判定可疑菌，再結(jié)合后續(xù)生化實(shí)驗(yàn)，更好地作出判斷。

免疫磁珠捕獲法是利用磁珠表面的O157特異性抗體來(lái)捕獲樣品中的表面抗原，磁珠在磁場(chǎng)作用下，被吸附沉淀，與樣品中的其他物質(zhì)快速分離，從而達(dá)到分離O157:H7的目的[11]。實(shí)驗(yàn)增菌后，先利用免疫磁珠進(jìn)行捕獲，再結(jié)合選擇性分離培養(yǎng)，這樣可以減少樣品殘?jiān)推渌竽c桿菌屬等雜菌的干擾，從而達(dá)到在成分復(fù)雜的食品中富集到目標(biāo)菌的目的[12]。該方法與常規(guī)檢驗(yàn)方法相比，能準(zhǔn)確、迅速地分離樣品中的目標(biāo)菌，但也存在影響檢測(cè)結(jié)果的因素，如樣品存在其他雜菌的污染、磁珠表面抗體的特異性、磁珠捕獲時(shí)間長(zhǎng)短等，而且其價(jià)格較高，不能被廣泛運(yùn)用到量大的檢測(cè)工作中。

在2種快速鑒定方法中，VIDAS 30能快速篩選出待測(cè)增菌液中的目標(biāo)菌，減少檢測(cè)時(shí)間，提高效率，但也會(huì)有漏檢的情況出現(xiàn)，所以得出陽(yáng)性結(jié)果后還要做進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。VITEK 2 Compact能對(duì)分離出的可疑菌落進(jìn)行比較準(zhǔn)確的生化鑒定，但可疑菌落的選擇和菌液的純度對(duì)該方法有一定的影響。因此，在檢測(cè)工作中，可在國(guó)標(biāo)法的基礎(chǔ)上將VIDAS 30和VITEK 2 Compact相結(jié)合，快速篩查出目標(biāo)菌，再按傳統(tǒng)細(xì)菌生化試驗(yàn)和血清學(xué)進(jìn)行下一步驗(yàn)證，使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。免疫磁珠分離技術(shù)具有強(qiáng)特異性、高敏感性以及快速篩選等特點(diǎn)[13]，目前，該方法可與PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)[14]、膠體金免疫層析技術(shù)[15]、紅外光譜技術(shù)[16]等各種高靈敏檢測(cè)方法結(jié)合，對(duì)O157:H7進(jìn)行分離鑒定，高效完成檢測(cè)任務(wù)，提高食源性致病菌的檢出率。

能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則對(duì)參加者的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，是一種有效的外部質(zhì)量控制手段[17]。參加O157:H7國(guó)際性能力驗(yàn)證，不僅可以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室自身的檢驗(yàn)?zāi)芰?，也可以提升?shí)驗(yàn)室在食源性致病菌方面的檢測(cè)技術(shù)水平，對(duì)完善實(shí)驗(yàn)室管理體系文件起到積極作用。通過(guò)驗(yàn)證能夠了解技術(shù)上的不足及存在的問(wèn)題，采取正確的改進(jìn)措施，更好地完成今后的檢測(cè)工作。