王甜

（新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所 農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站 新疆烏魯木齊 830000）

1 前言

水產(chǎn)品生長環(huán)境復(fù)雜，為保證其質(zhì)量，水產(chǎn)品養(yǎng)殖者會(huì)在養(yǎng)殖過程中使用不同種類的獸藥，如消毒劑、抗生素、殺蟲劑等，部分水產(chǎn)品養(yǎng)殖者為追求市場利益還會(huì)使用激素類獸藥。長期使用獸藥會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)品中出現(xiàn)殘留獸藥累積，獸藥進(jìn)入人體后，會(huì)對人體健康造成危害，激素類獸藥還可能會(huì)對青少年的生長發(fā)育造成影響。在人們重視食品安全及國家重視環(huán)境污染的背景下，如何合理利用獸藥提升水產(chǎn)品質(zhì)量的同時(shí)控制其殘留量，是水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)當(dāng)重視的問題。

液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS）最早起源于20世紀(jì)70年代，但由于技術(shù)水平有限，并沒有在藥物殘留檢測行業(yè)中發(fā)揮作用。現(xiàn)代大氣壓離子化接口技術(shù)的出現(xiàn)使得該技術(shù)重新受到重視，基于大氣壓離子化技術(shù)的電噴霧離子化和電化學(xué)離子化技術(shù)在食品以及農(nóng)產(chǎn)品殘留藥物檢測工作中得到了非常廣泛的應(yīng)用[1]。

2 LC-MS在檢測水產(chǎn)品獸藥殘留中的應(yīng)用

2.1 用于不同組分獸藥的預(yù)處理

水產(chǎn)品中除了殘留的獸藥外，還包含蛋白質(zhì)、脂肪以及其他雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾，因此，需要先對實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行凈化，去除干擾實(shí)驗(yàn)的雜質(zhì)。液相色譜-質(zhì)譜儀中所采用的多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）可以在一定程度上提升檢測靈敏度，減少雜質(zhì)造成的干擾。同時(shí)，通過預(yù)處理技術(shù)，可以凈化待檢測的樣品，提升檢測精度。目前，實(shí)驗(yàn)中常用的處理喹乙醇類獸藥的凈化方式是利用乙酸乙酯進(jìn)行萃取后吹干，利用流動(dòng)相定容，再進(jìn)行檢測；處理孔雀石綠和結(jié)晶紫類獸藥時(shí)，常采用酸性氧化鋁去除其中的油脂，與使用氧化鋁及丙磺酸的方式相比，可有效縮短樣品的凈化時(shí)間；處理含諾氟沙星和環(huán)丙沙星類物質(zhì)的獸藥時(shí)，一般采用乙腈萃取，進(jìn)行蒸發(fā)濃縮后，再用高效液相色譜-質(zhì)譜儀的MRM監(jiān)測模式檢測；處理含蛋白質(zhì)較多的樣品時(shí)，常采用含氯化鈉以及正已烷的液相與固相進(jìn)行萃取，在處理蝦、蟹等含蛋白質(zhì)較多的水生生物時(shí)效果較好；在處理氯霉素時(shí)，可先采用乙酸乙酯提取，利用正已烷進(jìn)行脫脂凈化，與傳統(tǒng)的衍生化方式相比，用時(shí)短，效率高。

2.2 與QuEChERS處理法聯(lián)用

QuEChERS處理法是近年來出現(xiàn)的一種水產(chǎn)品樣品處理方式，因其具備快速（quick）、簡單（easy）、廉價(jià)（cheap）、有效（effective）、可靠（rugged）和安全（safe）等諸多優(yōu)勢而得名。此方法主要包含3個(gè)步驟:（1）將樣品用有機(jī)溶液萃取后，向其中加入氯化鈉，分離水相。（2）將水相分離后，剩余部分進(jìn)行離心，提取上清液中的有機(jī)相，向其中加入吸附劑，使用固液分離萃取法進(jìn)一步萃取以凈化樣品。（3）用儀器測定進(jìn)一步萃取后的上清液。

QuEChERS處理法在農(nóng)產(chǎn)品及乳制品的獸藥檢測殘留中應(yīng)用較為廣泛，但在水產(chǎn)品的獸藥殘留檢測中很少應(yīng)用。有研究表明，將該方法用于水產(chǎn)品殘留獸藥檢測，回收率約為58%～133%，證明此方法能夠較好地應(yīng)用于水產(chǎn)品殘留獸藥的檢測中。在應(yīng)用QuEChERS法檢測魚肉中的殘留獸藥試驗(yàn)時(shí)，可與高效液相色譜-質(zhì)譜儀的MRM模式聯(lián)用，一次性可檢測30余種抗生素以及激素類獸藥[2]。

3 液相色譜儀檢測水產(chǎn)品中殘留獸藥組分

為檢測高效液相色譜-質(zhì)譜儀在水產(chǎn)品中殘留獸藥的檢測效果，本文在新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所進(jìn)行檢測試驗(yàn)，測定水產(chǎn)品中常見的30種獸藥，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對實(shí)驗(yàn)方式進(jìn)行優(yōu)化。

3.1 儀器與試劑

儀器:高效液相色譜儀（Ultimate3000）；三重四級桿質(zhì)譜儀（TSQ Quantum access MAX）；超純水凈水器（Millipore）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA RV10）；高速離心機(jī)（eppendorf）；混勻器（FLUKO）。

試劑:13種磺胺類標(biāo)準(zhǔn)溶液、14種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L，ANPEL公司）；孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品、隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品、甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.Ehrenstorfer）；乙腈、甲醇(純度≥99.9%）（CNW公司）；吸附劑。

不同種類的獸藥需要使用不同的定量方式檢測?？兹甘G使用乙腈定容[3]；而磺胺類獸藥則應(yīng)當(dāng)使用甲醇定容。制備定容檢測液時(shí)，應(yīng)在4℃條件下進(jìn)行，選取25 mL容量瓶，稱取待測溶液0.25 mL，根據(jù)獸藥的性質(zhì)選擇合適的定容試劑，將其配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。其中，孔雀石綠的待檢測溶液為0.5mL，喹諾酮類為1mL，甲基睪酮為0.1mL，上述3種獸藥的質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、0.1 mg/L。

3.2 處理方式

配制定容溶液完畢后，對其進(jìn)行離心處理，選用50 mL離心管，加入樣品2 g，乙腈3 mL，0.1 mol/L緩沖液2 mL，離心時(shí)間為5 min。離心后收集離心管中的上清液，加入1 g氯化鈉，200 μL乙酸，再次進(jìn)行離心，時(shí)間為5 min。離心后收集上清液，在其中加入100mg C18 和 100mg氨基（Classic NH2-），離心 5min。收集上清液，在其中加入1 mL甲醇、1 mL 0.1%甲酸溶液，進(jìn)行定容與過濾操作，此時(shí)待檢測的溶液制作完成，利用高效液相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。

3.3 色譜條件

色譜柱采用Hypersil GOLD柱，A相柱中甲醇與甲酸各0.1%，B相柱中甲酸為0.1%，儀器柱溫為30℃，進(jìn)樣量為 10 μL。

3.4 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜儀檢測方式為電噴霧正離子，毛細(xì)管電壓為3 kV，離子源溫度110℃，脫溶劑溫度380℃，流量550 L/h，反吹氣流量50 L/h。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

4.1 儀器條件

4.1.1 質(zhì)譜條件

采用電噴霧正離子工作方式，可將標(biāo)準(zhǔn)溶液中的獸藥組分有效離子化，并將其中的成分進(jìn)行掃描與分析，得出離子化組分的最佳碰撞值，從而使檢測結(jié)果更加精準(zhǔn)。

4.1.2 梯度洗脫條件

洗脫的目的是將不同組分的獸藥分離，以便后期對其混合組分進(jìn)行檢測，本實(shí)驗(yàn)采用的洗脫劑有2種，一種是0.1%的甲醇-甲酸溶液，另一種是乙腈和0.1%甲酸溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用0.1%的甲醇-甲酸溶液的洗脫效果更好。

為取得最好的藥物分離效果，在進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)后，得出獸藥的總離子流圖，從圖中可以得出最佳藥物分離效果所用的洗脫條件，詳見圖1。

4.2 定容溶液的選擇

本實(shí)驗(yàn)選取5種比例的0.1%的甲醇-甲酸溶液進(jìn)行測試，測試結(jié)果表明，0.1%的甲醇-甲酸的比例為 1∶9 時(shí)檢測效果最好，1∶1 時(shí)檢測效果最差，1∶9 的0.1%的甲醇-甲酸溶液是檢測水產(chǎn)品中獸藥的最佳溶劑。

圖1 獸藥最優(yōu)洗脫條件的總離子流圖

4.3 樣品預(yù)處理的優(yōu)化

4.3.1 提取溶劑

樣品中獸藥的提取是檢測工作的難點(diǎn)，不同溶劑對不同種類獸藥的回收能力不同，這對檢測結(jié)果有直接影響[4]。對于孔雀石綠、喹諾酮類和磺胺類獸藥，可以選擇乙腈作為提取溶劑。采用濃度為5%的醋酸乙腈提取時(shí)，孔雀石綠和喹諾酮類獸藥組分的提取效率在30%左右，而當(dāng)使用0.1 mol/L的緩沖溶液作為提取劑時(shí)，可有效提升孔雀石綠以及喹諾酮類獸藥的提取效率，但磺胺類以及甲基睪酮的提取效率卻降低。因此，在本次實(shí)驗(yàn)中，為均衡各種組分的獸藥的提取效率，提取溶劑選擇5%醋酸乙腈和0.1 mol/L緩沖液的混合溶液。

4.3.2 凈化

合適的吸附劑用量對凈化樣品中的雜質(zhì)有較好的效果，若吸附劑使用過量，樣品中的獸藥會(huì)被吸附，影響檢測結(jié)果[5]。本實(shí)驗(yàn)對吸附劑的最佳使用量進(jìn)行研究，當(dāng)吸附劑用量為50 mg時(shí)，樣品中仍殘留有較多雜質(zhì)，吸附效果較差；當(dāng)吸附劑用量為100 mg時(shí)，樣品中的雜質(zhì)含量非常少，且沒有獸藥被吸附；當(dāng)吸附劑用量為200 mg時(shí)，樣品中沒有雜質(zhì)，但吸附劑中存在部分獸藥。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇100 mg的C18和Classic作為吸附劑。

4.4 檢測效果

為驗(yàn)證檢測效果，本文按照上述優(yōu)化方案處理樣品并進(jìn)行檢測試驗(yàn)。采用5%醋酸乙腈和0.1 mol/L緩沖液作為提取劑，加入C18和Classic各100 mg，作為吸附劑分散樣品中的雜質(zhì)，在離心完成后，選取上清液，采用1∶9的0.1%的甲醇-甲酸溶液1 mL定容。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30種受檢測的獸藥中有29種樣品的線性關(guān)系較好，對這29種樣品進(jìn)一步測定，在每一組實(shí)驗(yàn)中選擇淡水魚、淡水蝦、淡水蟹等生活中常見的水產(chǎn)品作為樣品，得出其在定量檢測限（LOQ）、20 μg/kg和50 μg/kg 3個(gè)指標(biāo)下的回收率。經(jīng)檢測，29種獸藥在常見水產(chǎn)品中的平均回收率為72.53%，最高回收率達(dá)94.3%，這一回收率滿足LC-MS對樣品回收率的要求。

5 結(jié)論

LC-MS是一種檢測藥物殘留的先進(jìn)技術(shù)，本文對LC-MS在水產(chǎn)品殘留獸藥檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了研究。由于水產(chǎn)品中含有大量雜質(zhì)，應(yīng)當(dāng)先對含有多種組分的獸藥樣品進(jìn)行凈化。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，對30種水產(chǎn)品中常見的獸藥進(jìn)行了檢測實(shí)驗(yàn)，并依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對樣品凈化方式進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件為電噴霧正離子工作方式；梯度洗脫條件為0.1%的甲醇-甲酸溶液；定容溶液為1∶9的0.1%的甲醇-甲酸溶液；樣品提取溶劑為5%醋酸-乙腈和0.1mol/L緩沖液的混合溶液；選用100mg的C18和Classic N作為吸附劑。