劉眾虎，徐 娜

(吉林化工學(xué)院 材料科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

利福平(RIF)對(duì)于治療肺結(jié)核和麻風(fēng)病是具有良好療效的藥物,它也能用于抵抗葡萄球菌、流感嗜血桿菌以及艾滋病相關(guān)性鳥型分支桿菌等病原體.由于其對(duì)于防止結(jié)核病具有重要作用.利福平分別對(duì)肺結(jié)核宿主細(xì)胞內(nèi)外結(jié)合分歧桿菌和對(duì)需氧革蘭陽(yáng)性菌具有明顯的殺菌及抗菌等重要作用，使其成為目前市場(chǎng)需求量最大的藥物之一.然而RIF還具有一定的毒副作用,它比其他防治結(jié)核病的藥物更易發(fā)生黃疸[1],這是由于其引起肝內(nèi)膽汁潴留、對(duì)肝細(xì)胞的毒副作用和過敏反應(yīng)引起的,此外RIF還會(huì)促使肺結(jié)核病灶癌變或使已存在的癌組織繁殖加速.

目前,國(guó)內(nèi)外已知的檢測(cè)RIF含量的方法包括電化學(xué)法[2]、高效液相色譜法[3-5]以及紫外分光光度法等,但這幾種傳統(tǒng)檢測(cè)RIF的方法都具有較為明顯的缺點(diǎn),如高效液相色譜法,在檢測(cè)RIF的過程中受液相試劑純度影響較大,液相試劑的靈敏度不高,穩(wěn)定性較差的缺點(diǎn)造成測(cè)量結(jié)果誤差較大,除此之外其他方法也存在操作繁瑣,耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn),因此建立一種快速,靈敏且準(zhǔn)確的選特異性檢測(cè)利福平的方法,具有非常重要的實(shí)際意義.

熒光碳點(diǎn)是一種新型熒光納米材料,具有無(wú)毒、良好的生物相容性等優(yōu)異性能,在生物標(biāo)記、生物成像、光催化及熒光探針等領(lǐng)域具有非常廣泛的應(yīng)用前景[6-9].碳點(diǎn)的合成方法有水熱法[10]、燃燒法、微波法等.其中水熱法具有操作簡(jiǎn)單、可控性強(qiáng)、可修飾等優(yōu)點(diǎn),有利于大量生產(chǎn).

使用聚乙烯亞胺通過水熱法合成PEI聚合物碳點(diǎn),將其作為熒光探針分子去檢測(cè)RIF,聚乙烯亞胺功能化碳量子點(diǎn)的氨基可以捕獲利福平分子,形成絡(luò)合物使其淬滅,并用該方法對(duì)于RIF的檢測(cè)限,線性范圍和選擇性等進(jìn)行初步討論.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

聚乙烯亞胺(PEI,M=10 000)購(gòu)買于阿拉丁公司,檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·5H2O)購(gòu)買于阿拉丁公司，其余實(shí)驗(yàn)試劑：氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、氯化鎂(MgCl)、氯化銅(CuCl2)、氯化鋅(ZnCl2)、硝酸鉀(KNO3)、碳酸鈉(NaCO3)、硫酸鈉(NaSO4)、磷酸鈉(NaPO4),均購(gòu)買于天津市永大化學(xué)試劑有限公司,氨基酸(Val、Met、Cys、Ile、Pro、Arg、Phe、Gly、Gln、Glu、Thr、Trp、Ser、Ala、Asp、Lys、Leu、Asn、Tyr、His)均取自北京鼎國(guó)長(zhǎng)勝生物科技有限公司(中國(guó)北京).所有試劑均為分析純.

熒光光譜采用 F97XP熒光分光光度計(jì)測(cè)定，波長(zhǎng)范圍:200～900 nm，波長(zhǎng)精準(zhǔn)度:±0．4 nm，(上海棱光)．紫外可見光譜用UV-2200雙單色器雙光束紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定，波長(zhǎng)范圍:190～1 100 nm，波長(zhǎng)精準(zhǔn)度:±0.25 nm，(北京瑞利儀器)．

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 PDs的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[11]稍加改進(jìn),將1 g的檸檬酸鈉和0.5 g的PEI(M=10 000)溶在25 mL的燒杯中,加入10 mL的水,攪拌均勻后,放入反應(yīng)釜中在160 ℃的情況下水熱8 h,所得的淡黃色溶液就是制備的聚乙烯亞胺聚合物點(diǎn)(PDs).

1.2.2 PDs對(duì)RIF的檢測(cè)

在對(duì)PDs的檢測(cè)時(shí),選取在總體積為2 mL的水中加入10 μL的PDs(250 μM),均勻混合后,分別加入不同濃度RIF(0.1、0.2、0.5、1、2、3、5、7.5、15、25、50 μM)，待孵育1 min之后，

固定激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，測(cè)試其熒光光譜.

1.2.3 PDs對(duì)于RIF的選擇性檢測(cè)

將PDs溶液(250 μM)溶在2 mL的水中,在其中分別加入同種濃度的不同陰陽(yáng)離子(如Na+、K+、Cl-、NO3-等各100 μM)及常見氨基酸(如Val、Met、Cys、Ile、Pro、Arg等各100 μM)孵育1 min后,測(cè)定PDs的選擇特異性.

2 結(jié)果與討論

2.1 PDs的表征

如圖1(a)所示,是聚合物點(diǎn)的紫外可見吸收光譜圖,在紫外波長(zhǎng)為300～350 nm之間出現(xiàn)了一個(gè)較為明顯的吸收峰,在400～500 nm之間并沒與出現(xiàn)新的吸收峰,這說明溶液中不存在較大的納米顆粒,所以推測(cè)形成了聚乙烯亞胺聚合物點(diǎn).由圖1(b)的熒光光譜表征可知,聚合物點(diǎn)的最大激發(fā)光譜和發(fā)射光譜分別為350 nm和440 nm,兩者之間存在較大的斯托克斯位移,這使得PDs的發(fā)射光譜不受其激發(fā)波長(zhǎng)的影響,說明該聚合物點(diǎn)具有良好的抗干擾性,可以作為性能良好的熒光探針.

Wavelength/nm(a)聚合物點(diǎn)的紫外可見吸收光譜

Wavelength/nm(b)聚合物點(diǎn)的激發(fā)光譜(350 nm)和發(fā)射光譜(440 nm)圖1 聚合物點(diǎn)(a)吸收及(b)熒光光譜圖

2.2 PDs對(duì)RIF的檢測(cè)性能分析

由圖2可以看出,未加入PDs時(shí),溶液中的熒光強(qiáng)度較高,在加入PDs之后,熒光強(qiáng)度下降,這就說明該聚合物點(diǎn)具有使熒光淬滅的能力,在孵育時(shí)間為1～10 min的過程中,每隔1 min取一個(gè)樣進(jìn)行對(duì)比檢測(cè),發(fā)現(xiàn)孵育1 min和10 min的結(jié)果相同,這就說明在孵育1 min之后熒光強(qiáng)度就已經(jīng)趨于穩(wěn)定，可以進(jìn)行檢測(cè),也體現(xiàn)出了PDs具有快速檢測(cè)的能力.

Wavelength/nm圖2 加入PDs后的響應(yīng)時(shí)間圖

Wavelength/nm(a)聚合物點(diǎn)溶液中加入不同濃度的RIF后的熒光強(qiáng)度圖

CRIF/μM(b)不同濃度的RIF之后熒光強(qiáng)度關(guān)系圖圖3 圖3熒光響應(yīng)圖

在一定濃度的PDs中加入不同濃度的RIF溶液,(0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、5、7.5、15、25、50 μM),待孵育1 min之后放入熒光光度計(jì)進(jìn)行分析,如圖3(a)所示,在425nm為波長(zhǎng)的熒光光譜中,在未加入RIF溶液時(shí),PDs熒光強(qiáng)度較強(qiáng),隨著RIF濃度的增加，熒光強(qiáng)度隨之減弱,由此我們可以得出RIF有著使PDs熒光猝滅的能力.圖3(b)是加入RIF前后的熒光強(qiáng)度差值與利福平濃度的關(guān)系圖,,其線性范圍是0～7.5 μM，檢測(cè)限為0.1 μmol/L.

2.3 PDs對(duì)RIF的選擇性

(a)聚合物點(diǎn)中加入常見陰陽(yáng)離子前后的熒光比率圖

(b)常見氨基酸熒光檢測(cè)前后對(duì)比圖圖4 抗干擾檢測(cè)

2.4 檢測(cè)機(jī)理研究

檢測(cè)機(jī)理研究見圖5.

Wavelength/nm圖5 PEI(黑色),RIF(紅色),PEI-RIF復(fù)合物(藍(lán)色)的紫外可見吸收光譜圖

對(duì)PDs對(duì)RIF的檢測(cè)機(jī)理行進(jìn)了研究，圖5是PEI、RIF、PEI-PDs的紫外可見吸收光譜圖,可以看出,PDS在紫外可見光下沒有明顯吸收峰,在PDs中加入RIF之后吸收峰出現(xiàn)了明顯變化,可能兩者之間形成了新的官能團(tuán),這些吸收光譜的明顯變化表明在利福平檢測(cè)過程中形成了一種非熒光基態(tài)復(fù)合物，最終導(dǎo)致PDs的熒光猝滅.

3 結(jié) 論

以檸檬酸鈉和聚乙烯亞胺為原料,通過水熱法合成了具備良好穩(wěn)定性的氨基聚合物點(diǎn)(PDs)熒光材料,可對(duì)利福平進(jìn)行特異性檢測(cè).利福平可以與PDs形成一種非熒光基態(tài)復(fù)合物,從而使PDs熒光淬滅.在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后,開發(fā)了一種優(yōu)異的熒光傳感系統(tǒng),用于檢測(cè)利福平.PDs是基于熒光的傳感系統(tǒng)具有快速檢測(cè),靈敏度高,選擇性好,線性響應(yīng)范圍寬,成本低等優(yōu)點(diǎn),在檢測(cè)利福平方面具有廣闊的應(yīng)用前景.