李淋雨 王曉英

摘?要?Tau蛋白（簡稱Tau）是一種參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的微管相關(guān)蛋白。Tau可經(jīng)歷構(gòu)象改變、異常mRNA剪接等，從微管解離，經(jīng)系列翻譯后修飾（Post-translational modification，PTM），自身形成病理性聚集，進(jìn)而造成神經(jīng)退行性病變，最終形成Tau病。研究Tau的病理過程，分析評估其PTM及定量檢測其濃度變化，對Tau病的早期診斷、跟蹤、預(yù)防和治療具有重要意義。本文對目前Tau的常規(guī)分析方法進(jìn)行了概述和比較，重點闡述光學(xué)、電化學(xué)生物傳感方法的最新研究進(jìn)展與相關(guān)應(yīng)用，對未來發(fā)展方向進(jìn)行了展望，為Tau蛋白的深入研究與應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞?Tau蛋白;Tau病;生物傳感器;翻譯后修飾;評述

1?引 言

Tau蛋白（簡稱Tau）是一種參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的微管相關(guān)蛋白，富集于神經(jīng)元軸突周圍，與微管蛋白結(jié)合形成微管，可穩(wěn)定微管并促進(jìn)軸突運輸[1]。Tau經(jīng)歷構(gòu)象改變、異常mRNA剪接等，從微管解離，經(jīng)系列翻譯后修飾（Post-translational modification，PTM），自身形成病理性聚集，進(jìn)而造成神經(jīng)退行性病變，最終形成Tau病[2，3]。在進(jìn)行性核上性麻痹、皮質(zhì)基底節(jié)變性、額顳癡呆等原發(fā)性Tau病以及C型Niemann-Pick病、阿爾茲海默?。ˋlzheimer disease，AD）等繼發(fā)性病中均可檢測到Tau的異常修飾、含量變化及病理沉積[4，5]。其中，由Tau異常聚集形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)（Neurofibrillary tangle，NFT）是AD的病理標(biāo)志之一[6]。研究Tau的病理過程，分析評估其PTM及定量檢測其濃度變化，對Tau病的早期診斷、跟蹤、預(yù)防和治療具有重要意義。目前，已有少量關(guān)于Tau的神經(jīng)成像技術(shù)的評述與報道。如Villemagne等[7]研究了示蹤劑的選擇，Hall等[8]研究了Tau與認(rèn)知障礙的相關(guān)性，Hammes等[9]研究了Tau在神經(jīng)退行性疾病中的病理性聚集。但是，并沒有全面反映近年來針對Tau的病理過程、分析檢測方法的最新研究進(jìn)展。基于Tau結(jié)構(gòu)的特殊性、PTM與聚集過程的復(fù)雜性等，對Tau的分析方法的靈敏度、高效性提出了更高的要求。本文對Tau的常規(guī)分析方法進(jìn)行了概述和比較，重點闡述了光學(xué)、電化學(xué)生物傳感方法的最新研究進(jìn)展與應(yīng)用，對其未來發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

2?Tau的結(jié)構(gòu)與形態(tài)

2.1?結(jié)構(gòu)

Tau由位于17染色體長臂的基因編碼，含16個外顯子，長352～441個氨基酸，分子量為45～65 kDa。Tau可分為N末端投射功能區(qū)（N端）、脯氨酸富集區(qū)、微管結(jié)合區(qū)（Microtubule-binding domain，MBD）和C末端功能區(qū)（C端）。其中，N端長度不確定，可插入由外顯子2（E2）、3（E3）控制的額外片段。脯氨酸富集區(qū)含大量磷酸化位點，而C端提供了部分磷酸化位點[10，11]。重復(fù)序列（R1-R4）位于MBD，其微管結(jié)合力最強并促進(jìn)微管自聚集[12，13]，同時也是雙螺旋細(xì)絲（Paired helical filament，PHF）的核心結(jié)構(gòu)。人類Tau因mRNA剪輯方式不同，表達(dá)出6種同工異構(gòu)體，即Tau352、381、383、410、412和441，其差異在于C端是否存在3或4個重復(fù)序列，N端是否存在有1或2個插入物[12]。外顯子10（E10）編碼R2片段，能保留E10且具有4個重復(fù)序列的Tau統(tǒng)稱為4RTau;不保留E10且只有3個重復(fù)序列的Tau統(tǒng)稱為3RTau[14]。成年人腦內(nèi)3RTau、4RTau表達(dá)量相當(dāng)，而成年老鼠只表達(dá)4RTau[15]。

2.2?形態(tài)

Tau單體結(jié)構(gòu)類似“回形針”，如圖1A所示。Tau可經(jīng)歷構(gòu)象改變、異常mRNA剪接等，脫離微管致微管解聚，并從惰性單體轉(zhuǎn)變?yōu)榭删奂摹胺N子”形式（病理性Tau）。病理性Tau經(jīng)C端-MBD，N端-C端相互作用，折疊形成Tau的低聚物[16]，如圖1B所示。病理性Tau以朊病毒樣形式沿突觸在神經(jīng)元間傳播，形成的低聚物經(jīng)系列PTM后，進(jìn)一步在神經(jīng)元中聚集，形成PHF [17]，如圖1C所示。

3?Tau的PTM

Tau的PTM種類包括磷酸化（Phosphorylation）、糖基化（Glycation）、硝化（Nitration）、泛素化（Ubiquitination）、乙酰化（Acetylation）、甲基化（Methylation）和脯氨酰異構(gòu)化（Prolyl-isomerization）等[18]。PTM可影響Tau的活性、結(jié)構(gòu)及與其它蛋白質(zhì)的相互作用。其中，磷酸化作為關(guān)鍵致病步驟而受到廣泛關(guān)注[19]。

3.1?磷酸化

磷酸化是在蛋白激酶（Protein kinases，PK）作用下將ATP的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到Tau氨基酸殘基上，形成磷酸化Tau（P-Tau）的過程。PK包括脯氨酸定向PK、非脯氨酸定向PK和酪氨酸蛋白PK [20，21]。去磷酸化是經(jīng)蛋白磷酸酶（Protein phosphatase，PP）去除P-Tau氨基酸殘基上的磷酸基團(tuán)的過程，PP主要包括PP1、PP2A、PP2B、PP2C、PP3和PP5[22]。其中，PP2A的去磷酸化效應(yīng)最強，在AD患者腦中的表達(dá)和活性均降低[23]。岡田酸（OA）可使PP1、PP2A失活引起氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)P-Tau[24]。Tau含85個磷酸化位點，其中包括45個絲氨酸（Ser）、35個蘇氨酸（Thr）和5個酪氨酸（Tyr）殘基。部分磷酸化位點也可發(fā)生去磷酸化，但其發(fā)生反應(yīng)所需PK、PP的種類與數(shù)量不同 [25，26]。

健康神經(jīng)元中，磷酸化與去磷酸化保持動態(tài)平衡。當(dāng)PP、PK調(diào)控失衡，磷酸化水平提高至正常的2～3倍，即引起過度磷酸化[27]，可使Tau因失去生物活性而不可溶、抗降解且易聚集，喪失穩(wěn)定微管的正常功能，并干擾和分解細(xì)胞骨架，最終影響軸突運輸機制，并促成突觸功能障礙和神經(jīng)變性[28，29]。此外，β-淀粉樣蛋白（Amyloid β-protein，Aβ）、異常糖基化的誘導(dǎo)也可促成過度磷酸化[30，31]。

3.2?其它PTM

糖基化經(jīng)非酶促反應(yīng)在氨基酸上修飾糖基，可使Tau降解受阻而發(fā)生聚集 [32]。硝化經(jīng)硝基（NO2）共價修飾Tyr殘基[33]，抑制Tau結(jié)合與穩(wěn)定微管的能力，使其更易聚集 [34]。人體外硝化位點包括Tyr18、Tyr29、Tyr197和Tyr394，但Tyr29和Tyr197硝化更易引起Tau聚集[35]。泛素化是在系列酶的作用下，將泛素修飾在C端MBD的賴氨酸（Lys）殘基上，并隨著PHF的增加而增多[36]。在AD患者PHF、腦脊液（Cerebrospinal fluid，CSF）中，泛素化Tau含量較高[37]。

乙酰化是經(jīng)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶在Lys殘基修飾乙?；?，可調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和能量代謝，并誘導(dǎo)P-Tau[38]。甲基化是通過在Lys和精氨酸殘基上引入甲基，可影響Tau與微管結(jié)合及Tau同工異構(gòu)體間的相互作用[39]。甲基化位點多分布于MBD，可促進(jìn)磷酸化，并與乙?；⒎核鼗却嬖诟偁幾饔肹40]。脯氨酰異構(gòu)化于Thr231重排二硫鍵，使Tau從順式構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榉词綐?gòu)象[41]。反式構(gòu)象的Tau不與微管結(jié)合，經(jīng)聚集形成PHF[42];肽基-脯氨酰順/反異構(gòu)酶可使其轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖綐?gòu)象，恢復(fù)與微管結(jié)合力，并促進(jìn)PP2A去磷酸化[43]。

目前，磷酸化作為調(diào)控AD的關(guān)鍵步驟而受到廣泛關(guān)注。正常情況下，磷酸化和去磷酸化分別負(fù)、正調(diào)控Tau與微管的親和力，且二者保持動態(tài)平衡[44]。病理情況下，Tau過度磷酸化形成P-Tau，因與微管結(jié)合力減小而脫離微管，致微管解聚、神經(jīng)元發(fā)生變性和死亡，最終誘導(dǎo)AD[45];同時，易自我聚集的P-Tau在某些PTM影響下，經(jīng)歷形態(tài)改變，發(fā)生聚集，并最終形成NFT[20]，上述兩種途徑同時發(fā)生則進(jìn)一步加快了AD的病理進(jìn)程（圖2）。

4?Tau的常規(guī)分析方法

Tau的常規(guī)分析方法主要包括神經(jīng)成像、免疫檢測和質(zhì)譜（Mass spectrometry，MS）等技術(shù)。其中，神經(jīng)成像技術(shù)可用于研究Tau的病理成像，免疫檢測方法用于血漿或CSF中Tau或P-Tau的分析，質(zhì)譜技術(shù)則主要用于研究Tau的PTM。

4.1?神經(jīng)成像

神經(jīng)成像泛指能夠直接或間接對腦部的功能、結(jié)構(gòu)和藥理學(xué)特性進(jìn)行成像的技術(shù)，可捕捉腦部Tau的形態(tài)改變，利于臨床研究和診斷，包括正電子發(fā)射斷層掃描（Positron emission computed tomography，PET）、單光子發(fā)射計算機化斷層顯像（Single-photon emission computed tomography，SPECT）和磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）等。PET經(jīng)放射性示蹤劑標(biāo)記抗體，對細(xì)胞表面抗原進(jìn)行掃描顯像，為無創(chuàng)方法[46]。Tau與示蹤劑標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合后，經(jīng)PET顯示分布情況，示蹤劑保留的形貌與預(yù)期病理階段對應(yīng)，且Tau的沉積模式與代謝減退之間存在密切關(guān)系[47]。目前，18F-AV-T807和18F-AV-1451是Tau常用的示蹤劑[48，49]，但因示蹤劑的半衰期較短（18F：110 min），使PET檢測Tau的應(yīng)用受限[50]。

SPECT是以單光子放射性核素標(biāo)記藥物作為顯像劑，通過掃描病人體內(nèi)放射性標(biāo)記藥物發(fā)射的γ射線的成像技術(shù)。 苯基二芐基苯并噻唑（PDB）是常用藥物，小鼠的生物分布實驗表明，PDB衍生物在大腦中呈持續(xù)放射性水平，目前尚不適用于人體NFT成像[51]。

MRI經(jīng)體外高頻磁場對靜磁場中的人體施加某特定頻率的射頻脈沖，激發(fā)人體內(nèi)水和脂肪的氫質(zhì)子而引起磁共振現(xiàn)象，并通過獲得的電磁信號重建人體信息。多參數(shù)MRI、高分辨率結(jié)構(gòu)MRI等對評估Tau病理改變意義重大[52，53]。

4.2?免疫檢測方法

免疫檢測基于抗原-抗體的特異性結(jié)合，包括酶聯(lián)免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB）、基于納米粒子的免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Nanoparticles-immuno polymerase chain reaction，Nano-iPCR）和免疫磁減量（Immunomagnetic reduction，IMR）等。

ELISA是目前應(yīng)用最廣泛的方法之一。Arai等[54]采用ELISA證明AD患者的CSF-Tau（（95.6±105.3） pg/mL） 顯著高于正常人（（32.7±43.2）pg/mL），靈敏度為93.8%，特異性為75%，提示可經(jīng)CSF-Tau預(yù)測AD。Kohnken等[55]利用夾心ELISA測定AD患者CSF-P-Tau的截斷值為10.1 ng/mL，靈敏度為85%，特異性為97%，總體準(zhǔn)確度為91%。與CSF-Tau相比，CSF-P-Tau因與AD進(jìn)程高度相關(guān)而更受關(guān)注。

WB又稱免疫印跡，是將蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳分離后，通過抗原-抗體的特異性結(jié)合完成檢測。WB操作簡單，可直接對抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記，廣泛用于定量檢測Tau和P-Tau[56]。Rthlisberger等[57]采用WB獲得AD患者唾液中P-Tau和總Tau的比值（P-Tau/T-Tau），與正常人相比（0.96），75%的AD患者P-Tau/T-Tau可升高至1.00，該方法靈敏度為73%，特異性為50%。唾液與血漿、CSF相比，因無創(chuàng)、易得等優(yōu)點廣受關(guān)注。但是，WB因敏感性和特異性不足，尚無法直接用于臨床測試。

Nano-iPCR是經(jīng)納米粒子放大信號，結(jié)合免疫PCR檢測的技術(shù)。Stegurov等[58]采用Nano-iPCR定量檢測Tau，經(jīng)PCR板孔內(nèi)的抗體捕獲Tau形成抗原-抗體復(fù)合物后，結(jié)合金納米粒子（AuNPs）標(biāo)記的二抗，形成雙抗夾心復(fù)合物，經(jīng)免疫PCR檢測。Tau的檢出限（Limit of detection，LOD）為5 pg/mL，線性范圍為10～10000 pg/mL，回收率為89%～113%，明顯優(yōu)于ELISA的分析性能（LOD為140 pg/mL;線性范圍75～600 pg/mL）。

IMR是通過測量靶蛋白與磁性納米顆粒（Magnetic nanoparticles，MNPs）結(jié)合導(dǎo)致檢測體系中分散的MNPs混合頻率降低的百分比來測定靶分子。Chiu等[59]應(yīng)用標(biāo)記MNPs的抗體捕獲Tau，隨著Tau含量增高，分散的MNPs形成團(tuán)簇，使檢測體系中分散的MNPs混合頻率降低，基于IMR信號值的變化定量檢測Tau。結(jié)果顯示，早期AD組血漿的Tau為（53.9±11.7） pg/mL，明顯高于健康老年組（（15.6±6.9）pg/mL）和輕度認(rèn)知障礙組（（33.2±5.4）pg/mL），提示經(jīng)測量血漿Tau可預(yù)測AD。

4.3?質(zhì)譜技術(shù)

MS技術(shù)具有靈敏度高、樣品用量少、可同時進(jìn)行分離和鑒定等優(yōu)勢，多用于研究Tau的PTM。Min等[60]采用MS技術(shù)研究了Tau的乙?；C實其直接導(dǎo)致P-Tau積累并調(diào)節(jié)PP和PK活性;干擾乙?；芍苯佑绊懥姿峄M(jìn)程。Thomas等[61]分析了Tau的甲基化和泛素化，證實甲基化Lys分布于N端和MBD，在Lys254位點與泛素化競爭底物，與乙?；?、磷酸化等PTM共同調(diào)節(jié)Tau的功能。研究表明，小鼠和人的Tau序列具有高度相似性，如小鼠Tau430的序列與人類Tau441相比，有89%相同、92%相似[15]。Morris等[62]研究野生型小鼠和人淀粉樣前體蛋白小鼠內(nèi)源性Tau430的PTM，證實兩種類型小鼠的Tau430具有類似的PTM，同一Lys位點存在乙?；⒎核鼗图谆母偁?發(fā)生磷酸化的位點多在MBD附近，且因MBD存在高密度的帶正電荷Lys殘基，更易發(fā)生乙酰化和甲基化。目前，MS被廣泛應(yīng)用于研究Tau的PTM，但其維護(hù)成本高、操作復(fù)雜。

目前，Tau的常規(guī)分析方法在安全性、靈敏度及檢測成本等方面仍存在不足，開發(fā)更加高效、經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確的分析方法對Tau病的預(yù)防、干預(yù)和治療具有重要意義。

5?生物傳感方法

目前，應(yīng)用于Tau分析檢測研究的生物傳感方法主要包括光學(xué)和電化學(xué)生物傳感方法。

5.1?光學(xué)生物傳感方法

基于輸出的特征光學(xué)信號，檢測Tau的光學(xué)生物傳感方法包括表面等離子共振（Surface plasmon resonance，SPR）、局部表面等離子共振（Localized surface plasmon resonance，LSPR）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）和表面增強拉曼散射（Surface-enhanced raman scattering，SERS）等。

SPR是金屬介質(zhì)表面的自由電子吸收入射光的能量后發(fā)生共振的現(xiàn)象。目標(biāo)分子結(jié)合金屬介質(zhì)表面吸附生物分子后，引起折射率改變，進(jìn)而造成共振光譜的移動，可據(jù)此實現(xiàn)對目標(biāo)分子的定量檢測 [63]。Lisi等[64]基于SPR平臺，采用抗體捕獲Tau，設(shè)計了直接檢測、無標(biāo)記三明治夾心及標(biāo)記三明治夾心3種定量檢測Tau模式，如圖3所示。檢測Tau的線性范圍分別為7～250 nmol/L、2～25 nmol/L和125～1000 nmol/L，LOD分別為15、2和0.125 nmol/L。

適配體是經(jīng)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)篩選得到的人工合成的單鏈核酸序列，可直接與靶分子（金屬離子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞和微生物等）結(jié)合，與抗體相比，其批次間差異小，穩(wěn)定性和特異性更佳[65]。Kim等基于SPR平臺聯(lián)用抗體-適配體檢測Tau381 [66]，并同時檢測Tau381與α-1抗胰蛋白酶（Antitrypsin，AAT）[67]。如圖4所示，在SPR傳感片表面固定適配體，捕獲靶標(biāo)物并結(jié)合抗體，形成類三明治復(fù)合物。該方法檢測Tau381的LOD為10 fmol/L，線性范圍為2～80 pmol/L，并用于同時檢測人血漿樣品AAT和Tau，顯示了臨床應(yīng)用的潛力。

LSPR是電介質(zhì)包圍的金屬納米結(jié)構(gòu)中的自由電子在局部表面發(fā)生共振產(chǎn)生的光學(xué)現(xiàn)象，受金屬納米顆粒的種類、形狀以及大小的影響 [68]。Vestergaard等[69]基于多點定位的LSPR芯片檢測Tau，LSPR芯片經(jīng)活化、固定Tau抗體，并進(jìn)一步捕獲Tau后，引起LSPR芯片表面厚度的增加，通過測定吸光度的變化實現(xiàn)測定。該方法可檢測低至10 pg/mL的CSF-Tau，低于臨床區(qū)分AD患者與正常人的CSF-Tau的臨界值（195 pg/mL）。Kim等[70]基于LSPR平臺，利用不同類型的AuNPs偶聯(lián)抗體，同時完成多靶標(biāo)的準(zhǔn)確分離和鑒定。球形AuNPs （直徑50 nm）、長寬比分別為1.6、3.6的短棒、長棒狀A(yù)uNPs偶聯(lián)抗體，分別用于捕獲Tau、Aβ1-40和Aβ1-42，然后采用光譜儀檢測。結(jié)果顯示，Tau、Aβ1-40和Aβ1-42的LOD分別為23.6、34.9和26 fmol/L，可在10～108 fmol/L的濃度范圍對AD生物標(biāo)志物進(jìn)行同時快速檢測。因血漿中存在多種AD生物標(biāo)志物（Tau、Aβ1-40、Aβ1-42）干擾Tau的檢測，Kim等[71]聯(lián)用長寬比為367的長棒桿AuNPs和鹽酸胍，提高靶向Tau的能力。鹽酸胍可破壞Tau與其它蛋白質(zhì)分子間氫鍵，減弱疏水作用，減少其折疊和聚集，從而提高對Tau的捕獲量，該方法檢測Tau的LOD為100 fmol/L，線性范圍102～108 fmol/L。測定人血漿中Tau的含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）為1.98%～3.60%，回收率為94.43%～102.27%。

SERS與納米金屬材料聯(lián)用可增強拉曼信號并提高信噪比[72]。Zengin等[73]利用MNPs復(fù)合物固定的抗體捕獲Tau，與AuNPs標(biāo)記的二抗結(jié)合，形成三明治復(fù)合物后，定量檢測Tau，如圖5A所示。該方法無需純化即可快速檢測Tau，LOD低至25 fmol/L，線性范圍為25 fmol/L～500 nmol/L。

FRET是基于兩個分別作為能量供體與能量受體的熒光基團(tuán)距離處于1.0～10.0 nm之間時，供體的能量向受體轉(zhuǎn)移而引起的現(xiàn)象[74]。Kjaergaard等[75]利用FRET研究了Tau的聚集，如圖5B所示，分別用FRET供體和受體標(biāo)記等量Tau。 Tau發(fā)生聚集時，供體和受體標(biāo)記的Tau距離縮小，發(fā)生FRET，產(chǎn)生熒光響應(yīng)信號。該方法測定Tau低聚物的LOD為4.25 nmol/L，線性范圍37～104 nmol/L。

因光學(xué)傳感具有靈敏度高、成本低、穩(wěn)定性好和抗電磁干擾能力強等優(yōu)點，針對Tau的光學(xué)傳感研究具有巨大發(fā)展?jié)撃堋?/p>

5.2?電化學(xué)生物傳感方法

電化學(xué)生物傳感方法[76]因具有響應(yīng)速度快、成本低、靈敏度高和易于微型化等特點，受到廣泛關(guān)注。目前Tau的電化學(xué)生物傳感研究包括病理學(xué)監(jiān)測和定量檢測，常用的電化學(xué)檢測技術(shù)包括循環(huán)伏安法（Cyclic voltammetry，CV）、電化學(xué)阻抗譜（Electrochemical impedance spectroscopy，EIS）、方波伏安法（Square wave voltammetry，SWV）和差分脈沖伏安法（Differential pulse voltammetry，DPV）等。

5.2.1?Tau的病理學(xué)監(jiān)測?（1）針對P-Tau的研究?目前對P-Tau的電化學(xué)研究報道較少，尚無直接檢測P-Tau的報道。如Martic等[77]研究了5'-γ-二茂鐵基三磷酸腺苷（Fc-ATP）與糖原合成激酶3-β（GSK-3β）、PKA、肉瘤相關(guān)激酶（Src）對P-Tau的催化作用，測定了其最大反應(yīng)速度（Vmax）和在1/2Vmax的底物濃度（KM）。在金電極表面固定Tau，在Fc-ATP與PK的作用下發(fā)生磷酸化。Fc-ATP中負(fù)電荷的γ-磷酸基從ATP轉(zhuǎn)移到Ser、Thr或Tyr殘基引起電流密度改變，可用于檢測Fc-ATP濃度，線性范圍為5～200 μmol/L，LOD為2 μmol/L。濃度依賴性實驗結(jié)果顯示，GSK-3β、Src和PKA的KM值分別為（11±0.5） μmol/L、（7±0.5） μmol/L和（13±0.5） μmol/L，Vmax為 （（0.010～0.025）±0.005） μA/（cm2 min）。因不同PK作用的磷酸化位點存在差異，Rains等[78]進(jìn)一步監(jiān)測了Fc-ATP與多種PK（Gsk-3β、 Src、 Abl、 Fyn和TTBK等）對P-Tau的催化作用，結(jié)果顯示，多種PK聯(lián)用后對P-Tau的催化作用大于單一PK，且PK的種類和磷酸化順序?qū)au膜的電化學(xué)特性影響不同。

Jahnke等[79]基于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）和微電極測量平臺研究了P-Tau。在環(huán)狀培養(yǎng)容器固定細(xì)胞后，施加交流電壓并記錄Rct，結(jié)果顯示，SH-SY5Y經(jīng)OA處理后，在10 h內(nèi)Rct降至28%±19%，提示OA具有誘導(dǎo)P-Tau的作用;在OA處理前，將SH-SY5Y與Tau激酶抑制劑SRN預(yù)孵育1 h后，在前8 h內(nèi)，Rct無顯著變化，10 h后降低至24%±7%，表明SRN對OA誘導(dǎo)P-Tau的阻礙作用。（2） Tau-蛋白質(zhì)相互作用?為了監(jiān)測Tau之間的相互作用，分析其早期錯誤折疊，Esteves-Villanueva等[80]采用EIS監(jiān)測固定于Au電極上的Tau在孵育前后的電化學(xué)阻抗信號變化。Tau-Tau相互作用時，帶正電的Tau與檢測液中的氧化還原探針Fe（CN）63/4發(fā)生靜電作用，使電荷轉(zhuǎn)移電阻（Rct）從（2.9±0.6） kΩ降到（0.3±0.61） kΩ，Tau溶液濃度在0.2～1.0 μmol/L時，與Rct變化值呈線性關(guān)系，其濃度低至0.2 μmol/L時，仍可觀察到Tau-Tau相互作用。（3）Tau-金屬離子相互作用?大腦中高濃度的金屬離子使Tau金屬化，因此廣受關(guān)注。在Cu2+與非磷酸化的Tau（n-Tau）和P-Tau相互作用的研究中[81]，將n-Tau和P-Tau分別置于不同pH值和濃度的Cu2+溶液中孵育，經(jīng)CV檢測，結(jié)果顯示，在中性（pH 7.4）條件下，n-Tau和P-Tau與Cu2+的結(jié)合程度相似;pH值過高或過低時，通過影響P-Tau結(jié)構(gòu)而阻礙其結(jié)合Cu2+。此外，Cu2+和Zn2+可競爭性結(jié)合P-Tau，P-Tau與Zn2+優(yōu)先結(jié)合形成絡(luò)合物后，阻礙Cu2+與P-Tau結(jié)合。

Ahmadi等[82]研究了Tau、P-Tau與Fe2+、Fe3+的相互作用。在金電極表面固定Tau，分別置于含F(xiàn)e2+和Fe3+的溶液中孵育。與Tau-Fe3+相比，在Tau-Fe2+中檢測到明顯降低的Rct和增大的電流密度，提示Fe2+更易結(jié)合Tau。經(jīng)圓二色光譜測量Tau的二級結(jié)構(gòu)（α螺旋，225 nm）變化的峰強度，在Fe2+溶注中該峰強度在前3 h內(nèi)穩(wěn)定增長，在24 h后恢復(fù)到225 nm處的峰強度;在Fe3+中該峰強度緩慢增強，在24 h后仍未恢復(fù)到225 nm處的峰強度，證實Fe2+、Fe3+可引起Tau構(gòu)象改變，但Fe2+對Tau構(gòu)象的影響是迅速、可逆的，F(xiàn)e3+對Tau構(gòu)象的影響是緩慢、不可逆的。經(jīng)DPV測量P-Tau與Fe2+、Fe3+在不同PK作用下電流強度的變化顯示，Tyr位點顯著影響P-Tau、Fe2+相互作用，而Ser、Thr位點顯著影響P-Tau與Fe3+相互作用。

5.2.2?Tau的定量檢測?目前，電化學(xué)定量檢測Tau的研究報道較少。Derkus等[83]構(gòu)建了雙抗夾心型電化學(xué)生物傳感器，同時檢測髓鞘堿性蛋白（Myelin basic protein，MBP）和Tau。絲網(wǎng)印刷碳電極經(jīng)氧化石墨烯和聚酰胺-胺樹枝狀大分子修飾后，固定MBP和Tau的抗體，二抗分別綴合CdS和PbS，經(jīng)DPV和EIS檢測Cd2+和Pb2+的電化學(xué)信號。MBP和Tau的LOD分別為0.30和0.15 nmol/l，線性范圍分別為0.50～500 nmol/L和0.25～250 nmol/L。檢測人工CSF中MBP、Tau的回收率分別為96.3%～111.1%和99.1%～111.1%，顯示該傳感器具有較好的臨床應(yīng)用潛力。

Wang等[84]構(gòu)建了含4個金微帶電極的電化學(xué)生物傳感器檢測Tau，如圖6A所示，包括1個工作電極（WE）、1個對電極（CE）和2個參比電極（RE）。工作電極表面修飾自組裝單層膜并固定Tau抗體，Tau-抗體特異性結(jié)合引起電化學(xué)信號變化，實現(xiàn)Tau的檢測，方法的LOD為10?14 mol/L，線性范圍為10?14～10?7 mol/L，靈敏度明顯優(yōu)于ELISA，可檢測人血清中低至0.03 pmol/L的Tau。

結(jié)合適配體的高親和力與AuNPs可放大信號的優(yōu)勢，Shui等[85]基于電化學(xué)生物傳感方法聯(lián)用抗體-適配體測定Tau，如圖6B所示，金電極上固定的抗體捕獲Tau后，與半胱胺、AuNPs和適配體結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)一步放大電化學(xué)信號。檢測Tau的LOD為0.42 pmol/L，線性范圍為0.5～100 pmol/L，人血清樣本中Tau的回收率為97.1%～102.0%，RSD為4.80%～5.75%，顯示其對復(fù)雜的實際樣品具有良好的檢測效果。

6?結(jié)論與展望

本文介紹了Tau的結(jié)構(gòu)與形態(tài)、主要的翻譯和修飾過程以及常規(guī)分析方法，綜述了通過光學(xué)、電化學(xué)生物傳感方法檢測Tau的與最新研究與應(yīng)用進(jìn)展。因Tau結(jié)構(gòu)的特殊性、PTM與聚集過程的復(fù)雜性，提高研究方法的靈敏度、選擇性以及多樣性仍然是當(dāng)前的研究重點。未來的研究將集中于應(yīng)用新型納米材料提高靈敏度、開發(fā)新型識別元件提高選擇性以及提高方法的實用性方面。因檢測Tau與P-Tau對Tau病早期診斷、跟蹤、預(yù)防和治療具有重要意義，拓展多樣性研究并進(jìn)一步促進(jìn)其實用性，將是未來研究的重要方向。

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