畢思琦　安建平　郝玉金　芮麟　李彤　韓月彭　由春香

摘要：本試驗將從‘嘎啦蘋果中克隆的MdCBF1轉(zhuǎn)化到‘王林蘋果愈傷組織和野生型擬南芥幼苗中，進行低溫冷處理，觀察并比較分析野生型與轉(zhuǎn)MdCBF1材料在成活率和表達量間的差異，以研究MdCBF1基因?qū)χ仓昕估湫缘挠绊?。結(jié)果顯示，低溫處理后，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織抗冷性更高，轉(zhuǎn)基因擬南芥成活率更高，抗冷性相關(guān)基因表達水平更高?？梢钥闯?，MdCBF1過表達能夠顯著提高植株的抗冷性，表明其在植物的冷脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。

關(guān)鍵詞：蘋果;MdCBF1;冷脅迫;抗冷性

中圖分類號：S661.103.4：Q786文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2020）04-0010-06

Abstract In order to explore the function of MdCBF1 in cold stress response at low temperature， we cloned the MdCBF1 gene from Gala apple （Malus×domestica） and transformed into Wanglin apple calli and wild Arabidopsis seedlings. After treated with low temperature， the changes in survival rate and gene expression levels were studied. The results showed that the cold tolerance of transgenic apple calli was higher than that of wild type; the survival rate and gene expression level of transgenic Arabidopsis seedlings were higher than those of wild type after low temperature treatment. In conclusion， the overexpression of MdCBF1 could significantly increase the cold tolerance of plants， which suggested that MdCBF1 play an important role in cold response of plant.

Keywords Apple;MdCBF1; Cold stress; Cold tolerance

低溫是一種重要的非生物脅迫，是影響植物生存和分布的重要因素之一。低溫會使活性氧生成，導致植物產(chǎn)生氧化損傷[1]，進而抑制植物的生長和發(fā)育，嚴重影響不耐寒作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]，使植物遭受嚴重的傷害甚至死亡。但是，植物在面對低溫脅迫時并不是完全被動的，它們能夠快速感知逆境，并通過信號傳遞主動適應(yīng)低溫環(huán)境[3]。植物已經(jīng)進化出了精確而有效的機制來感知和整合低溫信號[4]。目前的研究表明，有超過1 000個基因誘導的冷脅迫響應(yīng)，其中至少有170個基因編碼轉(zhuǎn)錄因子（TFs）[5]，包括MYB[4]、NAC[6]、bZIP和APETALA2/乙烯響應(yīng)因子（AP2/ERF）家族[7，8]。在這些冷誘導轉(zhuǎn)錄因子中，CBF轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)下游冷響應(yīng)基因中發(fā)揮著重要作用[9]。

植物中存在一個特殊的低溫響應(yīng)通路，由C重復(fù)序列結(jié)合因子/干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（C-repeat binding factor/dehydration-responsive element binding factor，CBF/DREB1）這一植物特有的轉(zhuǎn)錄因子所主導[10]，這類轉(zhuǎn)錄因子能與下游基因啟動子中的CRT/DRE（C-repeat/dehydration responsive element）順式作用元件相結(jié)合并激活下游抗逆基因的表達[11]，引起脯氨酸、可溶性糖、葉綠素含量的提高[12]，進而提高植物對低溫非生物逆境脅迫的抗性[13]。CBF基因在冷脅迫響應(yīng)中的調(diào)控已經(jīng)得到了廣泛的研究，KIN1、KIN2、RD29A和COR47等多種調(diào)節(jié)因子已被證明與CBF基因的轉(zhuǎn)錄相關(guān)[14，15]。CBF轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/EREBP（apet-la2/ehylene responsive element binding protein）類轉(zhuǎn)錄因子亞家族[16]，在高等植物中廣泛存在，目前已從擬南芥、黑麥、水稻[17-19]等多個物種中分離得到了CBF基因。而在蘋果中也已經(jīng)分離得到5個CBF轉(zhuǎn)錄因子，即MdCBF1、MdCBF2、MdCBF3、MdCBF4、MdCBF5[20]。

蘋果（Malus×domestica）是世界范圍內(nèi)最重要的水果作物之一，但是蘋果品質(zhì)和產(chǎn)量也容易受到低溫的不良影響[21]。因此，研究蘋果的低溫響應(yīng)機理，提高蘋果植株對低溫的適應(yīng)性是十分必要的。先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，[WTBX]MdDREB1[WTBZ]過表達能夠增強植物對低溫的耐受性[22]。鑒于CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫中的重要性，為深入研究蘋果抗冷調(diào)控基因，本研究將克隆自‘嘎啦蘋果的MdCBF1基因轉(zhuǎn)化到‘王林蘋果愈傷組織和擬南芥中，初步探究MdCBF1表達對蘋果和擬南芥抗冷性的影響，這將為研究植物低溫冷脅迫響應(yīng)過程提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗于2018年6月—2019年5月在山東農(nóng)業(yè)大學作物生物學國家重點實驗室進行。

1.1 試驗材料

試驗所用植物材料有‘嘎拉（Royal Gala）幼苗，‘王林（Orin）蘋果愈傷組織以及野生型擬南芥幼苗（Col-0）。從‘嘎拉蘋果幼苗中提取cDNA用來克隆MdCBF1基因，‘王林蘋果愈傷組織和擬南芥幼苗用來進行遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2 試驗方法

1.2.1 CBF蛋白序列獲得和進化樹分析 擬南芥（Arabidopsis thaliana）CBF基因及其蛋白序列來自TAIR數(shù)據(jù)庫（http：//www.arabidopsis.org），蘋果CBF基因及其蛋白序列來自Apple GFDB數(shù)據(jù)庫（http：//gfdb.sdau.edu.cn/）。使用DNAMAN軟件進行蛋白序列比對，使用MEGA軟件進行進化樹分析。

1.2.2 載體構(gòu)建 根據(jù)之前已經(jīng)報道的MdCBF1序列設(shè)計引物MdCBF1-F/R，以‘嘎拉蘋果幼苗的cDNA為模板進行PCR擴增。之后將MdCBF1開放閱讀框插入到轉(zhuǎn)化后的pCAMBIA1300載體中，構(gòu)造過表達載體MdCBF1-pCAMBIA1300。

1.2.3 獲得轉(zhuǎn)基因愈傷和擬南芥幼苗 將生長16 d的野生型蘋果愈傷組織與攜帶MdCBF1-pCAMBIA1300的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)20 min，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS + 0.5 mg·L-1?IAA+1.5 mg·L-1 6-BA）上共培養(yǎng)1 d。用無菌水沖洗蘋果愈傷組織三次，然后轉(zhuǎn)移到添加300 mg·L-1羧芐青霉素和40 mg·L-1潮霉素的選擇性培養(yǎng)基中進行轉(zhuǎn)基因篩選。采用浸花法[23]轉(zhuǎn)化野生型擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥。

1.2.4 冷脅迫處理 將培養(yǎng)8 d的野生型和轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織在4℃條件下冷處理10 d，觀察蘋果愈傷組織的生長情況，并測定其鮮重。

生長10天的擬南芥幼苗在進行4℃低溫馴化處理3 d后，將幼苗在-4℃條件下培養(yǎng)0.5 h;然后使幼苗在22℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)3 d。觀察擬南芥植株的抗凍性，并統(tǒng)計其存活率[24]。

1.2.5 定量PCR分析 使用PlusReagent試劑盒（Tiangen，北京）提取RNA，使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara，大連）試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。采用ABI7500型qRT-PCR系統(tǒng)進行定量PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 CBF蛋白序列比對和進化樹分析

進化樹分析表明，MdCBF1基因與其他CBF基因的親緣關(guān)系均較近，尤其與AtCBF1親緣關(guān)系更近（圖1 A）。蛋白序列比對結(jié)果表明，AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3、MdCBF1、MdCBF2、MdCBF3、MdCBF4和MdCBF5蛋白序列均含有保守的AP2結(jié)構(gòu)域，符合AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子亞家族的特征（圖1 B）。

2.2 MdCBF1在‘王林蘋果愈傷組織中的表達情況

對野生型和轉(zhuǎn)MdCBF1基因蘋果愈傷組織進行4℃低溫處理10 d，并以未進行低溫處理的野生型和轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織作對照，結(jié)果（圖2）顯示，在正常環(huán)境下，野生型和轉(zhuǎn)?MdCBF1基因蘋果愈傷組織形態(tài)上沒有明顯差別，鮮重差異也不顯著;而4℃低溫處理后，轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織（MdCBF1-L1和MdCBF1-L2）的體積明顯大于野生型蘋果愈傷組織（WT），鮮重顯著高于野生型。經(jīng)實時熒光定量PCR檢測（圖2C），轉(zhuǎn)MdCBF1基因蘋果愈傷組織內(nèi)抗冷性相關(guān)基因

（MdCBF1、MdRD29A、MdKIN1、MdCOR1）的表達水平顯著高于野生型蘋果愈傷組織，表明過表達MdCBF1能夠顯著提高抗冷性相關(guān)基因的表達，提高轉(zhuǎn)基因愈傷組織的低溫抗性。

2.3 MdCBF1表達對擬南芥幼苗抗冷性的影響

為了進一步驗證過表達MdCBF1對完整植株抗冷性的影響，對野生型及轉(zhuǎn)MdCBF1基因擬南芥幼苗進行低溫處理，并以未做低溫處理的野生型和轉(zhuǎn)?MdCBF1基因擬南芥幼苗作對照?？梢钥闯?，在正常環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥幼苗表現(xiàn)沒有明顯差別;而在低溫環(huán)境下，相比于野生型擬南芥的幾乎全部死亡，轉(zhuǎn)基因幼苗仍有大面積存活，轉(zhuǎn)基因幼苗（MdCBF1#1、#2和#3）的存活率顯著高于野生型（WT），達到40%～50%，而野生型擬南芥幼苗的存活率只有10%左右（圖3A、B）。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖3C）顯示，轉(zhuǎn)MdCBF1基因擬南芥幼苗內(nèi)抗冷性相關(guān)基因（AtCBF1、AtRD29A、AtKIN1、AtCOR47）表達水平顯著高于野生型，表明過表達MdCBF1明顯促進了擬南芥幼苗體內(nèi)抗冷性相關(guān)基因的表達，提高了其抗冷性。

3 討論與結(jié)論

在植物中，冷脅迫響應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，涉及許多冷響應(yīng)基因，如KIN1、RD29A、COR47[25]等，這些基因被不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。CBF轉(zhuǎn)錄因子作為一類關(guān)鍵的冷調(diào)節(jié)因子，直接調(diào)控冷響應(yīng)基因的表達[5]。CBF信號通路在植物的冷脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，植物已經(jīng)進化出精確的機制來傳導這一信號通路[4]。除了CBF冷響應(yīng)通路外，一些研究也發(fā)現(xiàn)，在冷響應(yīng)中也存在不依賴于CBF的冷響應(yīng)通路，這些不依賴于CBF的冷響應(yīng)通路也在冷脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著不可忽視的作用[14]。在CBF冷響應(yīng)通路中，冷信號激活耐冷基因COLD1的表達進而激活I(lǐng)CE1蛋白，而ICE1-CBF轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應(yīng)在植物的冷適應(yīng)過程中起著重要作用，ICE1蛋白結(jié)合CBF轉(zhuǎn)錄因子促進其表達;CBF轉(zhuǎn)錄因子還可與COR基因啟動子中的順式元件結(jié)合并激活其表達[26]。這些研究都表明，CBF基因在參與植物逆境應(yīng)答、提高植物抗逆性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本試驗中，過表達MdCBF1基因后，轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織和擬南芥幼苗中的AtCBF1、AtRD29A、AtKIN1、AtCOR47等與抗冷性相關(guān)基因的表達水平顯著升高，這表明MdCBF1能夠直接調(diào)控這些基因的表達，很可能是通過調(diào)控這些基因的表達水平來參與植物低溫冷脅迫響應(yīng)過程的，這與前人的一些研究結(jié)果[14]相吻合。

CBF轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子亞家族[16]，本試驗結(jié)果顯示MdCBF1蛋白序列中也含有保守的AP2結(jié)構(gòu)域，也證明了這一點。在擬南芥CBF家族中，AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3三個CBF基因受到低溫的誘導表達[27]，同時又調(diào)控著下游眾多冷調(diào)節(jié)（cold-regulated，COR）基因的表達，它們構(gòu)成了一個龐大的?CBF 調(diào)節(jié)組，在擬南芥低溫響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用[28]。在本研究中，MdCBF1基因與AtCBF1基因親緣關(guān)系最近，表明MdCBF1基因與AtCBF1基因的功能類似;而后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果也表明MdCBF1基因過表達顯著提高了‘王林蘋果愈傷和擬南芥幼苗的抗冷性，有效證明了MdCBF1基因在低溫響應(yīng)中同樣起著不可忽視的作用。

綜上所述，MdCBF1基因是蘋果中的關(guān)鍵抗冷調(diào)控基因，其對于蘋果抗冷性有著積極的影響，這為以后更深入地研究植物低溫冷脅迫響應(yīng)機制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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