張露灝, 曹書(shū)婷, 劉江波, 左小磊, 王麗華,樊春海1,, 李 江

(1. 中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所, 中國(guó)科學(xué)院微觀界面物理與探測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201800;2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049;3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究院, 附屬仁濟(jì)醫(yī)院, 上海 200240;4. 中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院, 張江實(shí)驗(yàn)室, 同步輻射光源, 上海 201204)

生物體內(nèi)環(huán)境被脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)高度區(qū)隔化成細(xì)胞、 細(xì)胞器與囊泡等限域空間. 這些空間內(nèi)往往具有多種生物分子形成的擁擠效應(yīng), 與外部環(huán)境存在較大差異, 依靠膜上通道進(jìn)行有選擇性的物質(zhì)交換[1]. 同時(shí), 細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、 信號(hào)傳遞等功能, 也依賴于膜結(jié)構(gòu)(如囊泡)的運(yùn)輸[2,3]. 因此, 細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)通常受到膜結(jié)構(gòu)的精確時(shí)空調(diào)控, 可以遠(yuǎn)離熱力學(xué)平衡態(tài), 與試管中均相稀溶液條件下熱力學(xué)控制的化學(xué)反應(yīng)存在很大不同[4]. 在試管反應(yīng)中已被驗(yàn)證有效的診斷探針、 治療藥物等通常無(wú)法在活細(xì)胞中發(fā)揮理想的功能. 近年來(lái), 對(duì)于膜結(jié)構(gòu)的化學(xué)與生物學(xué)研究成為熱點(diǎn)方向, 對(duì)細(xì)胞成像、 診斷、 治療以及構(gòu)建納米機(jī)器人與人工細(xì)胞等應(yīng)用領(lǐng)域具有重要意義. 然而, 如何在納米尺度對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確的控制與測(cè)量分析, 仍然是膜生物學(xué)研究的一大挑戰(zhàn).

脂質(zhì)和脫氧核糖核酸(DNA)是2類重要的生物大分子, 多種生物結(jié)構(gòu)均基于脂質(zhì)或者DNA構(gòu)成. 真核細(xì)胞在產(chǎn)生數(shù)千種不同的脂質(zhì)方面投入了大量資源, 要用到5%的基因來(lái)合成所有這些脂質(zhì)[5]. 大部分天然脂質(zhì)含有疏水的尾部和親水的頭部. 疏水相互作用驅(qū)動(dòng)脂質(zhì)自組裝形成超分子結(jié)構(gòu), 如脂質(zhì)雙分子層、 脂質(zhì)體及膠束[6]. 脂質(zhì)體可以模擬細(xì)胞, 研究蛋白質(zhì)在生理環(huán)境中構(gòu)象和活性的變化[7]. 另外, DNA自組裝具有完全不同的化學(xué)基礎(chǔ), 氫鍵在DNA形成雙鏈的過(guò)程中起重要作用. 高度精確的堿基配對(duì)原則使DNA能自組裝形成特定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)[8～10]. 如特定DNA雙鏈的形成, 保證遺傳信息在跨代傳遞過(guò)程中具有高保守性. 值得一提的是, 在不同氫鍵疏水和靜電相互作用的介導(dǎo)下, 一類被稱為適配體(Aptamer)的單鏈DNA也能選擇性地與離子、 小分子或蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合[11]. 然而, 單獨(dú)的脂質(zhì)或單獨(dú)的DNA結(jié)構(gòu)功能仍然非常有限. 對(duì)于脂質(zhì)而言, 疏水性的脂質(zhì)在水相中的聚集在尺寸、 形貌和單分散性等方面難以得到精確控制, 無(wú)法用于量化的細(xì)胞研究[12]. 此外, 脂質(zhì)分子中存在的官能團(tuán)相當(dāng)有限, 進(jìn)一步限制了其在生物分析和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[13]. 而對(duì)于DNA來(lái)說(shuō), 負(fù)電性的DNA分子難以錨定于或者跨越同樣帶負(fù)電的質(zhì)膜[14].

脂質(zhì)和DNA在自然界中發(fā)揮著相互獨(dú)立的作用. 然而, 通過(guò)共價(jià)連接的方法, 研究者能將疏水分子和DNA連接起來(lái)[15,16]. 研究[17]表明, 疏水化合物(如卟啉和烷烴)與DNA鏈連接后, 可將DNA鏈錨定在細(xì)胞膜上. 同時(shí), 脂質(zhì)分子(如生育酚、 膽固醇及磷脂等)呈現(xiàn)出更優(yōu)越的膜錨定能力. 這種現(xiàn)象可能是由于這些分子與細(xì)胞膜脂雙分子層的親和力更高, 具有更強(qiáng)的相互作用所致[18]. 脂質(zhì)和脂質(zhì)-DNA還可以構(gòu)建二維的擴(kuò)散反應(yīng)平臺(tái), 在二維平面上研究并控制分子間的相互作用, 如酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[19]. 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)所呈現(xiàn)的新穎特征包括: 高度可控和可編程的DNA自組裝, 可用于微調(diào)脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)和結(jié)合模式; DNA易修飾上各種功能基序, 如熒光基團(tuán)、 猝滅基團(tuán)、 小分子藥物、 交聯(lián)劑和光活化基團(tuán), 能進(jìn)一步功能化調(diào)控脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu), 可用于生物分析和生物調(diào)節(jié); 脂質(zhì)修飾有利于脂膜募集DNA, 可使DNA跨越細(xì)胞膜或簡(jiǎn)單地錨定在質(zhì)膜表面. 因此, 脂質(zhì)修飾的DNA器件均能有效應(yīng)用于細(xì)胞膜生物學(xué)方面的研究.

本文將討論脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)、 結(jié)構(gòu)和生物應(yīng)用, 并聚焦其在活細(xì)胞膜上的功能; 綜述了近年來(lái)脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)在細(xì)胞膜納米孔形成、 細(xì)胞膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分析以及細(xì)胞間相互作用調(diào)控和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等方面的應(yīng)用; 還探討了脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)目前面臨的一些挑戰(zhàn)和未來(lái)的應(yīng)用.

1 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)用于構(gòu)建膜孔結(jié)構(gòu)

納米孔是指含有納米尺寸空心孔道的結(jié)構(gòu). 天然納米孔通常由1組蛋白質(zhì)構(gòu)成, 用于細(xì)胞膜上的分子運(yùn)輸. 這種基于蛋白質(zhì)或肽的納米孔也被廣泛用于體外DNA測(cè)序和單分子研究[20～22]. 與合成的固態(tài)納米孔相比, 這些天然納米孔具有結(jié)構(gòu)可再生、 骨架穩(wěn)定和生物相容性好的優(yōu)勢(shì)[21]. 但蛋白質(zhì)納米孔的從頭設(shè)計(jì)存在巨大的挑戰(zhàn). 此外, 蛋白質(zhì)納米孔的直徑(通常小于5 nm)和形狀通常很難任意定制或改變. 因此, 大多數(shù)蛋白質(zhì)納米孔的目標(biāo)選擇性和功能性均不易被調(diào)節(jié).

為了更好地控制納米孔的大小和形狀, 最近研究者們構(gòu)建了一系列基于DNA結(jié)構(gòu)的新型納米孔. 如前文所述, DNA可以通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)原則精確且可預(yù)測(cè)性地自組裝. 利用DNA構(gòu)建不同大小和形狀的納米結(jié)構(gòu)(包括納米孔)是一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的過(guò)程[23,24]. 然而, 如何讓這些由親水材料合成的納米孔在生物膜上發(fā)揮作用仍然存在挑戰(zhàn). 促進(jìn)這些合成DNA納米孔插入膜的一種方法是將納米孔與疏水基序結(jié)合, 如膽固醇[23]、 卟啉[25]和其它疏水連接物[26], 形成脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu).

脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備可以在固相DNA合成之前(預(yù)合成)或之后(后合成)進(jìn)行. 預(yù)合成策略包括合成脂質(zhì)磷酰胺以及在DNA合成過(guò)程中將其插入到所需的寡核苷酸序列[27]. 在后合成策略中, 首先需要在DNA鏈中插入可以進(jìn)一步用于脂質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)性官能團(tuán)[28,29]. 這2種方法均被廣泛應(yīng)用于合成脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu). 其中, 預(yù)合成策略用到的磷酰胺可有效結(jié)合DNA, 并能很好地控制脂質(zhì)修飾的數(shù)量和位置, 得到了廣泛應(yīng)用. 幾種常用的脂質(zhì)磷酰胺類化合物現(xiàn)已上市, 這也說(shuō)明可以根據(jù)設(shè)計(jì)的DNA序列定制目標(biāo)脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu). 已有如人工細(xì)胞膜納米孔的制備等成熟的化學(xué)策略被應(yīng)用于脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)在生物領(lǐng)域[30]. 這些新型膜錨定于DNA納米孔, 被應(yīng)用于促進(jìn)跨膜分子流動(dòng)[31]、 藥物遞送[32]或生物傳感[33～35]等領(lǐng)域.

Simmel等[36]和Gothelf等[37]受天然通道蛋白α-溶血素[38]的啟發(fā), 構(gòu)建了第一個(gè)完全由DNA構(gòu)成的納米孔, 并通過(guò)膽固醇側(cè)鏈將其錨定到合成脂膜上, 使其可以在脂膜上發(fā)揮作用[圖1(A)]. 該納米孔通道通過(guò)DNA折紙術(shù)自組裝而成, 其結(jié)構(gòu)由穿透并跨越脂質(zhì)膜的莖和黏附在膜順式面的筒狀結(jié)構(gòu)的蓋2個(gè)模塊組成. 桶狀結(jié)構(gòu)通過(guò)其順式面的26個(gè)膽固醇基序黏附在膜上. 莖從筒的中心突出, 是由6個(gè)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)域組成的中空管狀結(jié)構(gòu). 中間的管狀結(jié)構(gòu)作為跨膜通道, 內(nèi)徑為2 nm, 長(zhǎng)度為42 nm, 貫穿整個(gè)莖和桶. 通過(guò)改變通道的構(gòu)型, 能實(shí)現(xiàn)不同的門(mén)控行為. 通過(guò)測(cè)量單個(gè)納米孔的電流擾動(dòng), 該人工膜通道可用于檢測(cè)單個(gè)DNA分子的轉(zhuǎn)移. 考慮到由天然帶負(fù)電的磷酸二酯鍵骨架構(gòu)成的納米筒會(huì)破壞原位脂雙層的結(jié)構(gòu), Howorka等[26]模擬具有疏水表面的膜蛋白, 在六螺旋DNA納米筒結(jié)構(gòu)上設(shè)計(jì)了長(zhǎng)度為2.2 nm的由硫代磷酸脂(PPT)構(gòu)成的疏水帶[圖1(B)]. 這種DNA納米桶高約15 nm, 外直徑5.5 nm, 內(nèi)直徑2 nm. 該疏水帶能消除磷酸鹽陰離子的負(fù)電荷, 減少對(duì)質(zhì)膜的擾動(dòng). 通過(guò)使用更大和更疏水的基序取代烷基, 科研人員進(jìn)一步優(yōu)化了這些DNA納米孔的錨定效率, 并減少疏水基序的使用數(shù)量[39]. 如Howorka等[40]通過(guò)2個(gè)卟啉標(biāo)記, 構(gòu)建了雙功能化學(xué)標(biāo)記的納米通道[圖1(C)], 實(shí)現(xiàn)對(duì)納米孔插入脂膜行為的觀測(cè). 他們[41]進(jìn)一步優(yōu)化疏水標(biāo)記通過(guò)膽固醇標(biāo)記的納米孔[圖1(D)]開(kāi)發(fā)出能夠智能調(diào)節(jié)小分子跨膜運(yùn)輸?shù)慕Y(jié)構(gòu). 這種基于配體, 能被選擇性打開(kāi)或關(guān)閉的納米孔結(jié)構(gòu), 可應(yīng)用于生物傳感或基于邏輯的藥物遞送. 該研究組[25]還發(fā)現(xiàn), 將納米孔修飾到腫瘤細(xì)胞膜上, 可以通過(guò)改變細(xì)胞運(yùn)輸系統(tǒng)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性, 從而殺死腫瘤細(xì)胞. 這為實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療提供了新思路.

Fig.1 Nanopores constructed by lipid-DNA conjugates(A) Self-assembled cholesterol-modified DNA nanopores[37], copyright 2019, American Chemical Society; (B) hydrophobic belts used to construct nanopores[26], copyright 2013, American Chemical Society; (C) porphyrin-modified DNA nanopores[40], copyright 2013, Wiley-VCH; (D) three-cholesterol-modified DNA nanopores[41], copyright 2018, Springer Nature; (E) DNA nanopores constructed from DNA tile structures[42], copyright 2015, American Chemical Society.

G?pfrich等[42]使用DNA瓦片(DNA tile)的方法, 構(gòu)建了由4條11 nm長(zhǎng)的DNA雙鏈組成的相對(duì)簡(jiǎn)單的納米孔[圖1(E)]. 該結(jié)構(gòu)產(chǎn)率高, 其通道寬度從2 nm減小到0.8 nm, 達(dá)到離子通道的典型內(nèi)徑. 該研究組[43]進(jìn)一步研制了更為簡(jiǎn)化的跨膜結(jié)構(gòu). 該結(jié)構(gòu)為修飾有疏水分子的DNA雙鏈, 其能在缺乏內(nèi)部物理通道的情況下提供可直接穿過(guò)脂質(zhì)膜的離子通道. 這種簡(jiǎn)單設(shè)計(jì)呈現(xiàn)了新的以DNA為基礎(chǔ)的膜孔的設(shè)計(jì)途徑, 為生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的發(fā)展開(kāi)辟了廣闊前景.

總之, 基于DNA的納米孔相比于更早出現(xiàn)的基于天然蛋白的納米孔在性能上各有優(yōu)劣. 用于構(gòu)造蛋白納米孔的蛋白是經(jīng)過(guò)千萬(wàn)年自然進(jìn)化篩選出來(lái)的, 并且都經(jīng)過(guò)了合理優(yōu)化, 在DNA測(cè)序等方面有不可替代的優(yōu)勢(shì)[4]. 然而, 蛋白質(zhì)具有免疫原性, 從而限制了其在治療方面的應(yīng)用. 同時(shí), 利用非天然氨基酸構(gòu)建蛋白納米孔具有很大難度[44]. 最重要的是, 很少有蛋白納米孔的尺寸超過(guò)5 nm, 且蛋白孔很難進(jìn)行可編程的大幅度變構(gòu)[45], 這些弊端均極大地限制了蛋白納米孔的應(yīng)用范圍. 基于DNA的可編程性和可尋址性, DNA構(gòu)建的納米孔可以很好地避免蛋白孔的上述弊端, 表現(xiàn)出更大的自由度. 如, 相比于氨基酸, 核苷酸的尺寸更大, 并且可以通過(guò)沃森-克里克堿基互補(bǔ)配對(duì)原則組裝成更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)、 實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)的鏈長(zhǎng), 這使得DNA納米孔的尺寸可以達(dá)到幾十納米[46,47], 克服了蛋白和多肽的限制. 同時(shí), DNA納米孔的編程是精確可控的. 已有特定的軟件可以通過(guò)序列設(shè)計(jì)對(duì)DNA納米孔的形貌與尺寸進(jìn)行精確的控制[24], 使DNA雙鏈形成的柱體自由擴(kuò)展, 并且通過(guò)交聯(lián)方式實(shí)現(xiàn)雙鏈間的平行排列, 從而形成筒狀納米孔. 除了平行雙鏈之外, 還有曲率的雙鏈[22,48]及鏈之間形成特定角度的多面線框結(jié)構(gòu)[49,50]可用于構(gòu)建更豐富的幾何圖形, 這使得DNA納米孔有了更多可能的形狀. 脂質(zhì)或其它疏水基團(tuán)修飾的DNA納米膜孔通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化, 可以應(yīng)用于開(kāi)發(fā)生物傳感器、 調(diào)節(jié)膜滲透性和運(yùn)輸特定藥物等方面. 這些納米膜孔甚至可以用于單分子測(cè)序以及原位活細(xì)胞膜檢測(cè)等領(lǐng)域.

盡管如此, DNA納米孔的發(fā)展仍然面臨一些亟待解決的問(wèn)題. 未來(lái)DNA納米孔的設(shè)計(jì)應(yīng)該考慮到DNA孔比蛋白孔更加疏松, DNA壁有離子泄露的可能[51,52], 這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)構(gòu)建更厚的孔壁來(lái)解決. 另外, DNA納米孔的帶電密度可以達(dá)到每平方納米1個(gè)負(fù)電荷, 這不利于納米孔插入同樣帶負(fù)電的磷脂膜, 此問(wèn)題可以通過(guò)化學(xué)修飾磷酸骨架[26]或者用中性肽核酸代替[53]來(lái)解決. 同時(shí), 通過(guò)合成化學(xué)可以擴(kuò)展DNA納米孔的化學(xué)多樣性[54], 但因?yàn)橐纬呻p鏈, 所以對(duì)DNA的化學(xué)修飾受到很多限制. 未來(lái)優(yōu)化DNA納米孔的結(jié)構(gòu)和功能均需要考慮上述問(wèn)題.

2 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)用于調(diào)控細(xì)胞團(tuán)聚

組織和器官通常由一群功能不同但互補(bǔ)的細(xì)胞組成. 這些在組織空間中高度有序、 相互作用的細(xì)胞, 是控制細(xì)胞簇在體內(nèi)功能的重要影響因素[55]. 通常認(rèn)為, 三維組織中的細(xì)胞行為與二維培養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)胞行為有很大差異[56]. 考慮到獲取真實(shí)組織樣本具有難度, 為了更好地理解和預(yù)測(cè)體內(nèi)細(xì)胞行為, 在體外構(gòu)建結(jié)構(gòu)合適的三維細(xì)胞聚集體具有重要意義[57]. 雖然科研人員在控制細(xì)胞團(tuán)聚方面取得了一定進(jìn)展, 但在形成預(yù)定義的三維細(xì)胞團(tuán)簇方面仍然面臨著挑戰(zhàn), 特別是針對(duì)不同類型的細(xì)胞所形成的細(xì)胞團(tuán)簇[58]. 而脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)可用于調(diào)控細(xì)胞團(tuán)聚, 在構(gòu)建三維細(xì)胞團(tuán)簇方面具有良好的應(yīng)用前景.

脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)能夠精確調(diào)控不同細(xì)胞的接觸和排列方式. 基于DNA序列的互補(bǔ)性, 利用細(xì)胞膜錨定DNA, 能將細(xì)胞固定在玻璃表面上的特定位置[59]或特定類型的細(xì)胞旁邊. Teramura等[60]將聚乙二醇(PEG)-磷脂修飾的DNA錨定到細(xì)胞膜表面, 通過(guò)調(diào)節(jié)互補(bǔ)DNA鏈, 進(jìn)一步將細(xì)胞附著至其它細(xì)胞或基質(zhì)表面[圖2(A)]. 因此, 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)可簡(jiǎn)單有效地實(shí)現(xiàn)2種特定類型細(xì)胞的黏附. 該研究組[61]進(jìn)一步通過(guò)脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞連接的方法研究了細(xì)胞侵入過(guò)程, 發(fā)現(xiàn)在人急性白血病細(xì)胞(CCRF-CEM)、 人正常乳腺上皮細(xì)胞(MCF-10A)、 人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人胚腎細(xì)胞(HEK293)細(xì)胞系中, DNA雜交能介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用. 有趣的是, 形成細(xì)胞-細(xì)胞結(jié)合物后, 正常的MCF-10A細(xì)胞可以被腫瘤細(xì)胞MCF-7內(nèi)化. 他們還發(fā)現(xiàn), DNA介導(dǎo)的細(xì)胞連接并未導(dǎo)致這些細(xì)胞的入侵, 相反, 入侵主要是由E-鈣黏蛋白介導(dǎo)的相互作用引起的. 因此, 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)對(duì)研究細(xì)胞間的相互作用具有重要意義.

Fig.2 Lipid-DNA conjugates regulate cell aggregation(A) Control of cell attachment through lipid-DNA conjugates[60], copyright 2010, Elsevier; (B) lipid modified DNA aptamer mediated cell targeting[63], copyright 2013, Wiley-VCH; (C) programming cellular Interactions by three cholesterol modified DNA nanoplatform[64], copyright 2019, American Chemical Society.

Todhunter等[55,62]利用類似的細(xì)胞連接策略構(gòu)建了三維微型組織. 首先, 將脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)修飾在細(xì)胞上; 隨后, 使這些細(xì)胞流過(guò)一個(gè)修飾有互補(bǔ)DNA鏈的基底, 導(dǎo)致細(xì)胞被基底捕獲. 經(jīng)過(guò)多次捕獲和洗滌循環(huán), 可以形成三維微組織. 通過(guò)加入DNA酶, 能有效降解這些微組織, 得到分散的單個(gè)細(xì)胞. 并且微組織的大小、 形狀、 組成和異質(zhì)性可以通過(guò)改變DNA的序列和加入細(xì)胞的順序、 種類進(jìn)行控制. 利用這種方法, 甚至可以構(gòu)建厘米尺度的三維組織.

除了互補(bǔ)DNA介導(dǎo)的細(xì)胞相互作用外, 適配體也可用于調(diào)控細(xì)胞間的相互作用. 適配體是一類有特定二級(jí)結(jié)構(gòu)的單鏈DNA或核糖核酸(RNA), 能夠特異性地識(shí)別包括細(xì)胞膜蛋白在內(nèi)的多種靶點(diǎn). Tan等[63]通過(guò)適配體調(diào)控腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞的相互作用, 實(shí)現(xiàn)了免疫治療[圖2(B)]; 并通過(guò)脂質(zhì)將能夠靶向白血病細(xì)胞膜蛋白的適配體修飾在免疫效應(yīng)細(xì)胞膜上, 經(jīng)適配體修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞可以選擇性地識(shí)別目標(biāo)白血病細(xì)胞. 通過(guò)這種方法, 分化抗原8陽(yáng)性(CD8+)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞經(jīng)修飾后可以在不同細(xì)胞的混合體系中特異性地識(shí)別并殺死目標(biāo)淋巴細(xì)胞瘤. 隨著新核酸適配體的開(kāi)發(fā), 這些脂質(zhì)-適配體復(fù)合結(jié)構(gòu)在細(xì)胞治療中可能得到更廣泛的應(yīng)用.

目前, 大部分脂質(zhì)-線性DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)面臨著在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定性較差、 易被細(xì)胞內(nèi)化的問(wèn)題. Tan等[64]設(shè)計(jì)了膽固醇-DNA四面體復(fù)合探針, 顯著提高了探針在膜表面的穩(wěn)定性[圖2(C)]. 通過(guò)在四面體DNA的3個(gè)端點(diǎn)修飾膽固醇來(lái)錨定細(xì)胞膜, 而另1個(gè)端點(diǎn)伸出一段DNA單鏈用來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用. 與單個(gè)膽固醇直接錨定的線性DNA相比, 這種四面體探針有多個(gè)脂錨定位點(diǎn), 顯示出更高的膜錨定穩(wěn)定性(約100倍)和更高的目標(biāo)可達(dá)性(約2.5倍), 可以更有效地研究細(xì)胞間相互作用.

雖然脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)所構(gòu)建的細(xì)胞團(tuán)簇與真實(shí)的組織或器官仍然有很大差別, 但脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)在精確調(diào)控某種細(xì)胞或幾種不同類型細(xì)胞的組裝方面具有巨大潛力, 為調(diào)控和研究細(xì)胞間相互作用奠定了基礎(chǔ).

3 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)用于分析細(xì)胞膜動(dòng)態(tài)

脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)可用來(lái)測(cè)量細(xì)胞膜表面某種物質(zhì)的信號(hào)事件. Tan等[65]開(kāi)發(fā)了基于脂質(zhì)DNA核酸酶的熒光傳感器, 用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞外微環(huán)境中的金屬離子水平. DNA核酸酶是一類能催化某些化學(xué)反應(yīng)的DNA鏈, 大多數(shù)DNA核酸酶的功能可以被不同的金屬離子選擇性地調(diào)節(jié). 脂質(zhì)修飾的DNA核酸酶探針能夠錨定在細(xì)胞膜外側(cè). 當(dāng)環(huán)境中缺乏目標(biāo)金屬離子時(shí), 由于DNA探針是完整的, 熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)接近, 導(dǎo)致熒光保持猝滅的狀態(tài). 當(dāng)加入目標(biāo)金屬離子后, DNA核酸酶迅速將底物寡核苷酸鏈切割成2個(gè)片段, 導(dǎo)致熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分離, 從而激活熒光信號(hào). 因此, 通過(guò)細(xì)胞膜表面的熒光信號(hào), 可以檢測(cè)該區(qū)域的金屬離子. 考慮到適配體和DNA核酸酶的種類繁多, 可通過(guò)類似的脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)研究多種分子在細(xì)胞微環(huán)境中的分布以及細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn).

Feng等[66]設(shè)計(jì)了脂質(zhì)修飾的DNA鳥(niǎo)嘌呤(G)四聯(lián)體傳感器, 用作測(cè)量細(xì)胞膜中信號(hào)分子的比率型探針[圖3(A)]. 根據(jù)設(shè)計(jì), 能與目標(biāo)特異性結(jié)合的有機(jī)輔因子可以通過(guò)疏水相互作用嵌入到G四聯(lián)體層中. 輔因子與DNA末端熒光基團(tuán)之間的共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)信號(hào)可用于檢測(cè)特定目標(biāo). 特定目標(biāo)與其輔因子之間的化學(xué)反應(yīng)將導(dǎo)致FRET信號(hào)的變化. 基于上述原理, 構(gòu)建了用于二氧化硫衍生物和一氧化氮的傳感器, 可精準(zhǔn)和快速檢測(cè)細(xì)胞膜微環(huán)境中的這些信號(hào)分子.

Fig.3 Lipid-DNA conjugates for cell membrane analysis(A) Probing signaling molecules in the cellular membrane microenvironment[66], copyright 2019, Wiley-VCH; (B) phosphorylated lipid-DNA selectively anchors on cell membranes with high alkaline phosphatase expression[67], copyright 2019, Springer Nature.

脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)已成為構(gòu)建錨定細(xì)胞膜的核酸探針的強(qiáng)有力手段. 然而, 在實(shí)踐中傳統(tǒng)的脂質(zhì)-DNA復(fù)合體不能區(qū)分不同組分的細(xì)胞膜. Tan等[67]報(bào)道了磷酸化的脂質(zhì)-DNA復(fù)合體用于堿性磷酸酶(ALP)依賴性細(xì)胞膜黏附[圖3(B)]. 在缺乏ALP的情況下, 復(fù)合體與細(xì)胞膜的相互作用較弱; 而在ALP高表達(dá)時(shí), 磷酸化的脂質(zhì)通過(guò)去磷酸化作用使疏水性增強(qiáng), 從而能夠與細(xì)胞相互作用. 該設(shè)計(jì)增強(qiáng)了脂質(zhì)錨定對(duì)細(xì)胞膜的選擇性, 對(duì)優(yōu)化脂質(zhì)-DNA復(fù)合型探針有重要的指導(dǎo)作用.

脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)還可以用于研究細(xì)胞膜組分, 包括脂質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的生物物理相互作用. 細(xì)胞膜上發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 是通過(guò)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)之間的相互作用介導(dǎo)的. 脂質(zhì)介導(dǎo)的膜信號(hào)在炎癥、 癌癥、 代謝、 心血管和退行性疾病中均發(fā)揮著重要作用[68]. Aksimentiev等[69]設(shè)計(jì)了基于DNA的合成酶, 該結(jié)構(gòu)插入生物膜后導(dǎo)致生物膜的脂分子以107個(gè)/秒的速度翻轉(zhuǎn), 比生物酶催化的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)速率高出3個(gè)數(shù)量級(jí). 此外, 該研究還證明了DNA合成酶可以控制人類細(xì)胞膜的組成, 這為調(diào)控膜相互作用的DNA系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用開(kāi)辟了新途徑.

然而, 細(xì)胞膜上脂質(zhì)或者脂蛋白之間相互作用的時(shí)間尺度通常在微秒或者毫秒級(jí)范圍內(nèi). 因此, 如何直接對(duì)這些短暫的膜脂蛋白或脂質(zhì)間的相互作用進(jìn)行成像面臨著巨大挑戰(zhàn)[70,71]. FRET成像被廣泛用于直接測(cè)定膜-蛋白質(zhì)相互作用的研究中. 然而, 在細(xì)胞膜脂質(zhì)-脂質(zhì)或者脂質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究過(guò)程中, 無(wú)法檢測(cè)到足夠的FRET信號(hào). 超分辨顯微鏡和單分子追蹤技術(shù)也被用于研究單個(gè)脂質(zhì)或蛋白質(zhì)分子間的相互作用. 然而, 這些方法能提供的關(guān)于膜組分動(dòng)態(tài)相互作用的信息相當(dāng)有限[4].

利用脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu), Bian等[72]嚴(yán)格控制2層磷脂分子層之間的距離, 研究了脂質(zhì)在磷脂膜間穿梭的最小距離. 此外, Tan等[73]開(kāi)發(fā)了一種能監(jiān)測(cè)活細(xì)胞膜上脂質(zhì)瞬時(shí)相互作用的方法. 利用立足點(diǎn)(Toehold)介導(dǎo)的DNA鏈置換反應(yīng), 誘導(dǎo)DNA探針(W)從錨定DNA鏈S2轉(zhuǎn)移到錨定DNA鏈S1. 鏈置換反應(yīng)的速率與2條錨定鏈在膜上相互作用的速率成正比. 將錨定DNA鏈S1和S2與目標(biāo)脂質(zhì)相結(jié)合, 就能通過(guò)DNA探針監(jiān)測(cè)細(xì)胞膜鏈置換反應(yīng)的方法, 來(lái)量化膜脂質(zhì)相互作用的速率. 為了監(jiān)測(cè)膜上DNA鏈置換反應(yīng), 作者用熒光基團(tuán)標(biāo)記了DNA探針(W), 用猝滅基團(tuán)標(biāo)記了錨定鏈S1. 根據(jù)時(shí)間依賴性的細(xì)胞膜熒光信號(hào)的變化, 可以推算出膜脂質(zhì)相互作用的速率. 利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀, 通過(guò)這些DNA探針檢測(cè)不同的信號(hào)事件, 可以研究各種膜成分相互作用的關(guān)系.

總之, DNA鏈與天然細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)合所形成的脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)可以極大地促進(jìn)人們對(duì)健康或疾病模型中細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)知. 細(xì)胞膜組分的相互作用與細(xì)胞的許多功能相關(guān), 包括T細(xì)胞和B細(xì)胞信號(hào)通路的激活[74]. 事實(shí)上, 通過(guò)這些脂質(zhì)-DNA探針, 借助DNA間的相互作用, 可以進(jìn)一步研究一些重要細(xì)胞膜組分間的相互作用, 這是通過(guò)其它方法很難完成的. 此外, 對(duì)細(xì)胞膜表面物質(zhì)的監(jiān)控, 對(duì)于研究疾病或者腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展等也具有重大意義.

4 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)用于研究細(xì)胞膜機(jī)械生物學(xué)

脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)可用于研究細(xì)胞膜的形變. 細(xì)胞膜的形變對(duì)于細(xì)胞的內(nèi)化、 增殖、 分化及遷移等均具有重大意義[75]. 如, 在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑中, 三腳架型的網(wǎng)格蛋白交聯(lián)導(dǎo)致膜的內(nèi)陷可引發(fā)內(nèi)吞過(guò)程. Schwille等[76]構(gòu)建了能夠重塑脂膜形狀的DNA支架[圖4(A)]. 這種支架結(jié)構(gòu)基于具有不同平面的2種三維DNA折紙結(jié)構(gòu), 均能夠附著在膜上. 同時(shí)添加這2種結(jié)構(gòu)時(shí), 會(huì)發(fā)生平面多聚現(xiàn)象. DNA折紙單體能橫向結(jié)合相鄰單體, 在脂質(zhì)體上呈現(xiàn)共定位、 共擴(kuò)散的性質(zhì). 在高表面折紙密度的狀態(tài)下, 這些結(jié)構(gòu)聚集形成支架, 從而促進(jìn)了廣泛的平面變形. 類似亞基自組裝機(jī)制, 被認(rèn)為是引發(fā)Bin-Amphiphysin-Rvs(BAR)樣區(qū)域, 或者其它支架蛋白, 甚至病毒蛋白相關(guān)的膜變形的原因. 作者的工作主要集中在模擬生物膜支架蛋白寡聚化驅(qū)動(dòng)膜變形的步驟, 這對(duì)支架蛋白的理化性質(zhì)具有重要意義. 此外, Zhang等[77]通過(guò)構(gòu)建不同形貌的DNA支架, 將脂質(zhì)膜折疊成任意形狀. 通過(guò)改變DNA結(jié)構(gòu), 設(shè)計(jì)分子形狀和尺寸與支架蛋白類似的脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu), 將有利于更深入地理解這些重要的細(xì)胞膜過(guò)程[78].

Fig.4 Lipid-DNA conjugates for studying mechanobiology(A) Lipid modified DNA origami nanoparticles to scaffold and deform lipid membrane [76], copyright 2015, Wiley-VCH; (B) lipid modified DNA-based membrane molecular probes for intercellular tensile forces visualization[95], copyright 2017, American Chemical Society.

脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)也可用于研究細(xì)胞連接處的生物物理信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo). 細(xì)胞通過(guò)各種化學(xué)、 電和機(jī)械信號(hào), 與其它細(xì)胞或者周圍環(huán)境進(jìn)行交流. 細(xì)胞連接處產(chǎn)生的機(jī)械力對(duì)許多細(xì)胞集體行為有著深遠(yuǎn)影響, 包括組織擴(kuò)張、 拉伸、 遷移、 增殖和分化[79～83]. 目前, 在測(cè)量細(xì)胞和基質(zhì)之間張力方面已經(jīng)取得了重大突破, 研究者已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種測(cè)量方法, 包括膠原晶格凝膠[84]、 組織柱[85]、 微柱[86]、 牽引力顯微鏡[87]和分子力傳感器[88～90]. 然而, 對(duì)于細(xì)胞間張力的研究仍然面臨著挑戰(zhàn). 目前, 細(xì)胞間張力只能基于細(xì)胞基質(zhì)張力數(shù)據(jù)[91,92]或使用基于FRET的分子張力探針[93,94]通過(guò)數(shù)學(xué)推導(dǎo)來(lái)測(cè)量. 從細(xì)胞基質(zhì)張力推導(dǎo)細(xì)胞間作用力的方法, 過(guò)程復(fù)雜且只適用于單層細(xì)胞, 并且缺乏連接處配體-受體相互作用的信息. 基于熒光蛋白的FRET傳感器通常不敏感, 張力檢測(cè)范圍有限, 與宿主細(xì)胞的生物相容性不佳.

基于脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu), You等[95]開(kāi)發(fā)了DNA膜張力探針, 用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞連接處的張力[圖4(B)]. 該探針由3條DNA鏈構(gòu)建而成: 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的膽固醇修飾的錨定鏈、 膽固醇和猝滅基團(tuán)雙修飾的錨定鏈、 配體和熒光基團(tuán)雙修飾的互補(bǔ)鏈. 正常情況下, 具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的鏈將熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)拉近, 導(dǎo)致熒光猝滅. 一旦受體-配體結(jié)合, 且鏈上的張力超過(guò)DNA發(fā)夾的閾值, 發(fā)夾結(jié)構(gòu)會(huì)被拉開(kāi), 熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分離, 導(dǎo)致熒光信號(hào)增強(qiáng). 這些DNA張力探針被用來(lái)研究2種機(jī)械力敏感的跨膜蛋白: 整合素蛋白和E-鈣黏蛋白. 通過(guò)簡(jiǎn)單地改變探針修飾的配體, 同一個(gè)DNA探針可以對(duì)由不同配體-受體對(duì)介導(dǎo)的細(xì)胞間張力進(jìn)行成像. 當(dāng)然, 整合素蛋白和E-鈣黏蛋白誘導(dǎo)的張力在細(xì)胞連接處均可被觀察到. 結(jié)果表明, 3種整合素介導(dǎo)的邊界, 即大表面、 小表面和絲狀偽足黏連間的細(xì)胞間張力模式有很大不同. 這說(shuō)明脂質(zhì)-DNA探針可能有助于研究群體細(xì)胞系統(tǒng)中細(xì)胞間張力的異質(zhì)性. 脂質(zhì)-DNA探針用于細(xì)胞間張力研究的優(yōu)勢(shì), 首先體現(xiàn)在DNA探針作用力的閾值可以通過(guò)序列和雙鏈的長(zhǎng)度進(jìn)行精確調(diào)控[96,97]; 此外, 這些探針功能的實(shí)現(xiàn)只需與細(xì)胞孵育, 不需要克隆或轉(zhuǎn)染. 并且, 與基因編碼的FRET傳感器相比, 使用化學(xué)熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)顯著提高了探針的靈敏度. 通過(guò)這些DNA探針, 能可視化和量化二維、 三維細(xì)胞間的張力或收縮力. 這些脂質(zhì)-DNA探針有潛力廣泛應(yīng)用于細(xì)胞間機(jī)械力的研究.

5 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)用于研究藥物遞送

兩親性納米組裝體, 如膠束和脂質(zhì)體, 在實(shí)現(xiàn)藥物分子的細(xì)胞傳遞中受到了廣泛關(guān)注. 這些納米組裝體[98]具有體積小、 裝載量大、 生物相容性好、 體外和體內(nèi)穩(wěn)定性好的特點(diǎn)[99,100]. 近年來(lái), 研究者制備了由單鏈DNA親水冠與脂質(zhì)或聚合物疏水核[101]組成的新型功能性膠束. 根據(jù)親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)的比例, 這些兩親性分子可以自組裝成不同的結(jié)構(gòu), 如球形或納米棒狀的膠束結(jié)構(gòu)[102]. 這些新型的脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)可用于研究藥物遞送和物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸.

Liu等[27]利用脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu), 制備了尺寸分布窄、 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的球形膠束. 這種膠束結(jié)構(gòu)的臨界膠束濃度小于10 nmol/L, 這保證了該膠束結(jié)構(gòu)能夠順利形成. 此外, 該膠束結(jié)構(gòu)還具有良好的細(xì)胞穿透性. 該研究組[103]進(jìn)一步將脂質(zhì)與胞嘧啶-p-鳥(niǎo)嘌呤(CpG)DNA結(jié)合, 證實(shí)這種脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)能有效錨定在體內(nèi)細(xì)胞的細(xì)胞膜上, 從而實(shí)現(xiàn)治療性DNA在腫瘤部位的富集[圖5(A)]. 類似的腫瘤治療策略還可以擴(kuò)展到其它功能性治療核酸, 如免疫刺激性RNA、 小干擾RNA(siRNA)或適配體. 該研究組的后續(xù)研究[104]表明, 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)可以與小鼠體內(nèi)的內(nèi)源性白蛋白緊密結(jié)合. 因此, 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)可以作為分子疫苗, 有效地在淋巴細(xì)胞附近富集, 使其在增強(qiáng)T細(xì)胞啟動(dòng)和腫瘤殺傷性能方面提升30倍.

Fig.5 Lipid-DNA conjugates for cargo deliveries(A) Lipid modified DNA for in vivo cell modification and localized immunotherapy[103], copyright 2011, Wiley-VCH; (B) membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability[37], copyright 2019, American Chemical Society.

Gothelf等[37]和Shih等[105]受病毒的啟發(fā)構(gòu)建了膜包被DNA納米結(jié)構(gòu), 實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)的核酸運(yùn)輸[圖5(B)]. 這種納米結(jié)構(gòu)包含1個(gè)DNA納米八面體內(nèi)層和1個(gè)脂質(zhì)DNA外層. 這種直接在DNA外組裝脂質(zhì)雙層的納米結(jié)構(gòu), 可以保護(hù)核酸免受體內(nèi)核酸酶的降解. 此外, 這種由脂質(zhì)和DNA組成的納米組裝體, 其免疫反應(yīng)活性降低了2個(gè)數(shù)量級(jí), 藥代動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性提高了17倍. 上述研究結(jié)果表明, 這些體內(nèi)穩(wěn)定的脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)有可能成為強(qiáng)大的物質(zhì)遞送平臺(tái). 同樣, 模擬天然的物質(zhì)遞送體系, Sun等[106]構(gòu)建了表面修飾DNA的脂質(zhì)體. 利用DNA編碼的膜融合策略, 實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞的胞內(nèi)蛋白遞送. 該方法能規(guī)避內(nèi)吞途徑, 使蛋白在細(xì)胞質(zhì)中仍能保持活性.

總之, 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)在作為藥物遞送和生物成像的平臺(tái)方面展現(xiàn)出巨大潛力. 這些納米組裝體具有結(jié)構(gòu)可調(diào)、 生物穩(wěn)定性和生物相容性好的特點(diǎn). 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)的大小和形狀可以精確控制, 這是優(yōu)化藥物傳遞效率的關(guān)鍵特征. 這些脂質(zhì)DNA納米組裝體可被用作小分子、 蛋白質(zhì)和核酸在細(xì)胞內(nèi)和體內(nèi)傳遞的載體. 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)在血液循環(huán)中具有穩(wěn)定性高、 副作用或免疫反應(yīng)小的特征. 因此, 該結(jié)構(gòu)作為功能強(qiáng)大的遞送載體, 不僅適用于核酸藥物, 也可能用于2種或2種以上藥物(包括疏水性和親水性藥物)的聯(lián)合遞送.

6 總結(jié)與展望

細(xì)胞膜不僅具有屏障功能, 還在調(diào)節(jié)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳導(dǎo)中起到關(guān)鍵作用. 本文綜述了脂質(zhì)-脫氧核糖核酸(DNA)復(fù)合結(jié)構(gòu)在膜生理和細(xì)胞功能調(diào)控方面的研究進(jìn)展. 受細(xì)胞膜中各類脂蛋白的啟發(fā), 研究人員構(gòu)建了具有兩親性的脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu). 這種脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)在與細(xì)胞簡(jiǎn)單地孵育后, 便展現(xiàn)出獨(dú)特的細(xì)胞膜錨定的特性. 因此, 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)可廣泛應(yīng)用于人工膜通道的構(gòu)建、 細(xì)胞膜上物質(zhì)變化的檢測(cè)、 膜組分相互作用的動(dòng)態(tài)分析、 細(xì)胞間作用力的研究、 細(xì)胞膜形狀調(diào)控和藥物遞送等領(lǐng)域. 然而, 對(duì)這些脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜相互作用的機(jī)制仍缺乏系統(tǒng)性的認(rèn)知. 不同的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)、 疏水性和不飽和程度如何影響結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜的相互作用目前尚不明確. 同時(shí), 哪些因素決定這些脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)的膜錨定動(dòng)力學(xué)、 效率和持續(xù)時(shí)間有待進(jìn)一步研究.

提高脂質(zhì)-DNA復(fù)合物膜錨定的持續(xù)性是目前該結(jié)構(gòu)應(yīng)用于細(xì)胞膜研究面臨的另一個(gè)挑戰(zhàn). 錨定在細(xì)胞膜上的脂質(zhì)-DNA復(fù)合物, 大多數(shù)會(huì)在2～4 h內(nèi)失效[107]. 這些膜錨定的結(jié)構(gòu)最終會(huì)被細(xì)胞攝取, 從而失去作為膜探針的功能. 因此, 明確這些攝取過(guò)程的機(jī)制非常重要. 通過(guò)抑制攝取過(guò)程, 便能延長(zhǎng)這些膜錨定結(jié)構(gòu)在細(xì)胞膜上的停留時(shí)間. You等[107]研究了一組脂質(zhì)-DNA探針錨定細(xì)胞膜的動(dòng)態(tài)過(guò)程. 結(jié)果表明, 脂質(zhì)-DNA探針的膜插入率和脫離率與其疏水性密切相關(guān), 大多數(shù)插入細(xì)胞膜的探針為單體形式, 而不是聚集物. 該研究還表明, 脂質(zhì)-DNA探針與膜的脫離有2種形式, 即通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞或直接流出細(xì)胞膜進(jìn)入溶液中. 因此, 當(dāng)溶液中存在過(guò)量的探針或存在胞吞抑制劑時(shí), 探針可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜的長(zhǎng)期修飾, 基于此, 他們首次將脂質(zhì)DNA探針的膜保留時(shí)間提高到24 h以上. 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)在細(xì)胞膜表面停留時(shí)間的延長(zhǎng), 將對(duì)細(xì)胞遷移或傷口愈合等生物學(xué)現(xiàn)象的研究非常有益.

總之, 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)自首次構(gòu)建以來(lái), 在較短的時(shí)間內(nèi)便展現(xiàn)出顯著的細(xì)胞膜研究方面的潛力. 由脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)構(gòu)建的納米膜孔可以用于研究物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、 單顆粒追蹤等. 錨定在細(xì)胞膜表面的脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)不僅可以檢測(cè)某種物質(zhì)在細(xì)胞膜表面的動(dòng)態(tài)變化, 還可以用于研究細(xì)胞膜上各種組分的相互作用. 此外, 這些結(jié)構(gòu)在細(xì)胞膜的重塑、 藥物遞送、 細(xì)胞團(tuán)簇的構(gòu)建方面均有很好應(yīng)用. 未來(lái)幾年, 隨著DNA納米技術(shù)的不斷進(jìn)步和人類對(duì)細(xì)胞膜研究的不斷深入, 脂質(zhì)-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)在膜生物學(xué)研究中將會(huì)有更為重要的進(jìn)展.