白翠婷, 岳仁葉, 羅列高, 馬 楠

(蘇州大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)部, 蘇州 215123)

miRNA是一類內(nèi)源性的小分子RNA, 通常含有18～25個(gè)核苷酸序列, 在基因表達(dá)中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[1～3], 與生物體的發(fā)育、 分化、 增殖、 凋亡和疾病進(jìn)展等過程息息相關(guān)[4～6]. 不同種類miRNA的異常表達(dá)與不同的腫瘤類型有關(guān), 因此, 通常將其作為腫瘤生物標(biāo)志物, 對(duì)癌癥的早期篩查起到預(yù)測(cè)與診斷的作用[7,8]. 早期的檢測(cè)方法包括分子印跡法[9]和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[10,11]等, 近年來, 化學(xué)發(fā)光法[12]、 電化學(xué)發(fā)光[13]、 表面等離子體共振[14]、 比色法[15]及電化學(xué)方法[16]等得到了廣泛的研究和應(yīng)用. 本文將熒光檢測(cè)法、 化學(xué)發(fā)光法、 DNA鏈置換反應(yīng)(SDR)和細(xì)胞顯微成像技術(shù)結(jié)合, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)miRNA的高靈敏檢測(cè).

金納米顆粒(GNP)是一種尺寸可調(diào)的球形納米粒子[17], 在一定距離內(nèi)它與熒光分子存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效應(yīng)[18～20], 且消光系數(shù)高, 因此GNP通常作為熒光猝滅劑. 它還具有良好的穩(wěn)定性、 遷移率和生物相容性, 廣泛應(yīng)用于生物體腫瘤診斷中[17,21～24]. 熒光染料是一種有機(jī)熒光小分子, 其激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)具有特定范圍, 熒光效率較高、 性質(zhì)穩(wěn)定. GNP與熒光染料探針結(jié)合后用于腫瘤細(xì)胞已被廣泛報(bào)道, 如, 層狀雙氫氧化物修飾的金納米粒子(LDH-Au)與熒光染料(FITC)共同應(yīng)用于癌細(xì)胞光熱成像[25]; 金納米顆粒與具有聚集誘導(dǎo)激發(fā)性質(zhì)的熒光染料用于活體腫瘤的計(jì)算機(jī)斷層掃描成像[26]; 在金納米棒包覆的介孔硅表面修飾透明質(zhì)酸后, 裝載藥物并用FITC作為熒光探針靶向作用于腫瘤細(xì)胞, 實(shí)現(xiàn)化熱療一體化[27]; 利用與金納米粒子共軛形成的DNA/MnO2和熒光染料標(biāo)記底物鏈的納米組裝體, 通過鏈置換反應(yīng)及酶鏈的循環(huán)作用, 對(duì)癌細(xì)胞標(biāo)志物mRNA進(jìn)行特異性識(shí)別[28]. 常用的熒光染料有FAM, DAPI, Cy3, Cy5和FITC等, 本文采用FAM(激發(fā)波長(zhǎng)約480 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)約520 nm)和Cy5.5(激發(fā)波長(zhǎng)633 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)650～750 nm)進(jìn)行研究[29].

miRNA的實(shí)時(shí)成像是監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞行為變化的一種直觀方法, 但是由于miRNA在癌細(xì)胞中豐度低、 不同種類間序列相似程度大, 因此對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度與選擇性要求較高[30～32]. 為提高檢測(cè)靈敏度, 基于鏈取代反應(yīng)放大信號(hào)的方法得到廣泛研究. 如通過構(gòu)建核酸適配體/蛋白近距離結(jié)合的無酶納米傳感器, 利用鏈置換循環(huán)信號(hào)放大來測(cè)定復(fù)雜血清中的凝血酶[33]; 基于催化發(fā)夾組裝原理, 提出了聚多巴胺修飾的金納米花(DA-AuNF)與發(fā)夾DNA構(gòu)建的催化發(fā)夾組裝體系用于特異性識(shí)別miRNA, 進(jìn)行熒光成像與檢測(cè)[34]; 隨著催化循環(huán)體系研究的發(fā)展[35], 目前已提出利用DNA功能化的金納米顆粒傳感器對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行催化成像的手段[36], 并在此基礎(chǔ)上開展負(fù)載藥物靶向作用于癌細(xì)胞的研究[37], 以及基于以上方法構(gòu)建光控催化體系[38], 均實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)miRNA的高靈敏成像與檢測(cè). 然而, 這些方法仍存在背景熒光與無法定量的不足. 基于以上研究, 本文提出了一種將金納米粒子與2種熒光染料修飾的DNA組成納米組裝體(GDC)的方法, 在燃料Fuel DNA與催化Catalyst DNA的共同作用下, 發(fā)生光控的催化循環(huán)解組裝, 產(chǎn)生FAM和Cy5.5 2種熒光信號(hào), 以Cy5.5的熒光強(qiáng)度作為參比值, 用于標(biāo)定進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的GDC的含量, FAM熒光為催化解組裝后的熒光恢復(fù), 其強(qiáng)度用于標(biāo)定細(xì)胞內(nèi)miRNA含量, 根據(jù)兩者熒光強(qiáng)度的比值FLFAM/FLCy5.5, 可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miRNA含量的定量分析.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

三水合氯金酸(HAuCl4·3H2O, 純度99.9%)和3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基溴(MTT, 純度97.5%)均購自Sigma-Aldrich公司; 檸檬酸三鈉購自百靈威(北京)科技有限公司; NaOH, HAc, HNO3和HCl均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 二硫蘇糖醇(DTT, 純度98%)和6-巰基-1-己醇(MCH, 純度98%)購自阿拉丁試劑公司; 聚丙烯酰胺(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)40%, Bio-Rad公司); 瓊脂糖(Biowest公司); 脂質(zhì)體(Lipofectamine-2000, Invitrogen公司); 高糖(DMEM)、 胰蛋白酶/EDTA(Trypsin/EDTA, 0.25%)和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自Hyclone公司; 宮頸癌細(xì)胞(HeLa,中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心); 人胚腎表皮細(xì)胞(HEK-293, 武漢大學(xué)細(xì)胞資源中心); DNA1和DNA4購自Takara公司, 其余DNA從上海生工生物工程訂購, 具體序列見表1. 所用試劑均為分析純及以上級(jí)別. 實(shí)驗(yàn)所用超純水由Milli-Q Direct 8超純水系統(tǒng)制備(美國(guó)Millipore公司).

Table 1 DNA sequences*

Agilent 8543型紫外-可見分光光度計(jì)(美國(guó)Agilent公司); AvaSpec-ULS2048-USB2型熒光光譜儀(荷蘭Avantes公司); Tecnai G220 S-Twin 型透射電子顯微鏡(TEM, 美國(guó)FEI公司); DYCP-31DN 型瓊脂糖水平電泳儀(北京六一儀器廠); Mini-PROTRAN Tetra垂直電泳裝置(美國(guó)Bio-Rad公司); UVP GelDoc-It TM310型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司); Infinite M200 PRO 酶標(biāo)儀(美國(guó)TECAN公司); TCS SP5 Ⅱ型激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司); Zetasizer Nano ZS90型激光粒度儀(英國(guó) Malvern公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 金納米顆粒(GNP)的制備及表面DNA1的功能化修飾 參照He等[37]報(bào)道的檸檬酸三鈉還原法合成了水合粒徑為15.96 nm的GNP, 并用0.22 μm 針頭過濾器過濾, 于4 ℃下避光保存, 其最大吸收波長(zhǎng)λmax=520 nm, 對(duì)應(yīng)的摩爾消光系數(shù)為2.7×108L·mol-1·cm-1[39], 測(cè)得吸光度值后采用朗伯比爾定律(A=εbc)計(jì)算其濃度. pH=3時(shí)在GNP上修飾DNA1[39]. 在DNA1(SH-DNA, 100 μmol/L)溶液中按n(DNA1)∶n(TCEP)=1∶200加入20 mmol/L TCEP并活化2 h. 將濃縮的GNP(200 μL, 35 nmol/L)加入活化后的DNA1中, 混合均勻, 于37 ℃搖床上振蕩預(yù)反應(yīng)1 h后, 在劇烈攪拌下加入終濃度為15 mmol/L, pH=3的檸檬酸三鈉-鹽酸緩沖溶液, 在37 ℃搖床上振蕩反應(yīng)1 h后, 以12000 r/min轉(zhuǎn)速離心7 min, 分散于1×PBS緩沖液中并測(cè)試其紫外吸收光譜以計(jì)算濃度; 并用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、 透射電子顯微鏡(TEM)等表征其粒徑大小. 將樣品于4 ℃下保存?zhèn)溆?

1.2.2 金納米顆粒-熒光染料DNA組裝體(GDC)的制備 向GNP-DNA1體系中按GNP/MCH摩爾比1∶1500 加入100 μmol/L MCH, 室溫下在搖床上振蕩1 h后, 以12000 r/min轉(zhuǎn)速離心7 min后測(cè)定并計(jì)算其濃度; 按GNP/DNA4摩爾比1∶60加入DNA4及終濃度分別為50和2.5 mmol/L的NaCl和MgCl2溶液, 于37 ℃水浴過夜, 以11000 r/min轉(zhuǎn)速離心洗滌3次除去游離的DNA4, 并測(cè)定其濃度.

向GNP-DNA1-DNA4體系中加入FAM修飾的DNA2和Cy5.5修飾的DNA3, GNP/DNA2和GNP/DNA3摩爾比均為1∶60. 在NaCl和MgCl2終濃度分別為50和2.5 mmol/L的條件下, 于37 ℃水浴加熱6 h, 以11000 r/min轉(zhuǎn)速離心洗滌3次后測(cè)定其濃度, 于4 ℃下保存?zhèn)溆?

1.2.3 GDC傳感器的催化循環(huán)解組裝響應(yīng) 不同C′/DNA4(L)的催化循環(huán)解組裝過程: 在含有5 nmol/L GNP的組裝體GDC體系中加入125 nmol/L的Fuel DNA(按C′/DNA4摩爾比分別為1, 0.5, 0.2, 0.1, 0.02, 0.01, 0.004和0, 對(duì)應(yīng)的濃度分別為125, 62.5, 25, 12.5, 6.25, 1.25, 0.125和0 nmol/L), 另加入終濃度分別為50和2.5 mmol/L的NaCl和MgCl2, 混合均勻后用紫外燈(302 nm, 6 W)照射300 s, 隨后置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)4 h. 以11000 r/min轉(zhuǎn)速離心7 min, 取上層清液測(cè)定其熒光強(qiáng)度; 將沉淀重新分散于20 μL 1×PBS緩沖液中, 用瓊脂糖凝膠電泳表征.

不同光照時(shí)間的催化循環(huán)解組裝過程: 設(shè)置5組含有5 nmol/L GNP的組裝體GDC, 向其中加入125 nmol/L Fuel DNA, 用紫外光(302 nm, 6 W)分別照射0, 25, 50, 75, 100, 150, 300, 600和1200 s, 隨后置于37 ℃水浴中加熱4 h. 樣品在11000 r/min轉(zhuǎn)速下離心7 min, 取上層清液測(cè)定其熒光強(qiáng)度; 將沉淀重分散于1×PBS緩沖液中, 用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行表征.

1.2.4 GDC上DNA數(shù)目的測(cè)定 配制一定濃度梯度(0, 20, 40, 60, 80和100 nmol/L)的FAM-DNA1溶液, 使用酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度值, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. 用FAM-DNA1代替DNA1, 采用1.2.1節(jié)方法對(duì)GNP進(jìn)行修飾后, 每100 μL FAM-DNA1-GNP(36.5 nmol/L)中加入80 μL DTT(10 mmol/L), 置于室溫?fù)u床上振蕩過夜, 待DTT將GNP上的FAM-DNA1完全取代后, 將樣品稀釋一定倍數(shù)并離心取上層清液, 測(cè)定其熒光強(qiáng)度(表S1, 見本文支持信息), 結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出GNP上修飾的DNA1數(shù)目. 采用相同方法測(cè)定了每個(gè)金納米顆粒上DNA2, DNA3和DNA4的數(shù)目.

1.2.5 GDC的細(xì)胞應(yīng)用 細(xì)胞培養(yǎng): 將宮頸癌細(xì)胞(HeLa)和人胚腎上皮細(xì)胞(HEK-293)置于25 cm2的培養(yǎng)瓶中, 培養(yǎng)基成分為50 mL DMEM+5 mL 胎牛血清(FBS)+0.5 mL青霉素-鏈霉素雙抗, 置于含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

固定細(xì)胞成像: 將HeLa細(xì)胞或HEK-293細(xì)胞按每孔1×104個(gè)接種在8孔腔室孔板中, 置于培養(yǎng)箱中孵育24 h, 加入甲醇反應(yīng)30 min, 用1×PBS緩沖液清洗, 再加入100 μL含250 nmol/L Fuel DNA和5 nmol/L GDC的DMEM培養(yǎng)基, 于37 ℃培養(yǎng)2 h后用紫外光照射樣品孔300 s, 繼續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)4 h, 無紫外光照射的樣品作為對(duì)照組. 用1×PBS緩沖液緩慢清洗2次后, 使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞成像, 激發(fā)光波長(zhǎng)分別設(shè)置為450～490和600～650 nm.

活細(xì)胞中的熒光成像: 使用8孔腔室孔板, 每孔中加入100 μL含HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)基, 待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后, 用1×PBS緩沖液清洗. 在細(xì)胞中加入100 μL DMEM培養(yǎng)基, 包含5 nmol/L GDC, 0.3 μL脂質(zhì)體Lipofectamine-2000和1 μL 25 μmol/L的Fuel DNA, 于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h. 用1×PBS緩沖液清洗后, 分別用紫外光照射0, 30, 60, 120, 300和600 s, 于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 用1×PBS緩沖液清洗2次后進(jìn)行熒光成像.

1.2.6 GDC的特異性與穩(wěn)定性表征 在GDC的催化循環(huán)解組裝過程中, 分別將C′替換為C′(mis-1), C′(mis-2)和C′(mis-3), 其它條件均不變, 驗(yàn)證了GDC的特異性. 將GDC分散于不同pH值(4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0和10.0)和不同NaCl濃度(0, 100, 250, 500, 750和1000 mmol/L)的溶液中; 加入終濃度為50 U/L的DNase Ⅰ, 125 nmol/L Fuel DNA和125 nmol/L catalyst DNA(C′), 分別進(jìn)行外加紫外光照射和不加紫外光照射處理后, 均置于37 ℃反應(yīng)12 h, 測(cè)定其熒光恢復(fù)值.

1.2.7 GDC的細(xì)胞毒性測(cè)定 紫外光對(duì)細(xì)胞存活率的影響: 使用紫外光(302 nm, 6 W)分別對(duì)細(xì)胞照射0, 120, 300, 600和1200 s, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h后, 再向每個(gè)孔中加入20 μL 5 mg/L MTT, 培養(yǎng)4 h后移除溶液并加入100 μL DMSO, 使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的吸收值, 設(shè)置吸收波長(zhǎng)為490 nm.

GDC的細(xì)胞毒性測(cè)定: 分別在如下條件下培養(yǎng)細(xì)胞: 加入GDC培養(yǎng)8 h; 加入5 nmol/L GDC培養(yǎng)4 h后, 用紫外光照射300 s, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h; 加入GDC和Fuel DNA培養(yǎng)4 h后, 用紫外光照射300 s, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h. 將培養(yǎng)基孵育的細(xì)胞及用Triton X-2000處理的細(xì)胞分別作為正對(duì)照和負(fù)對(duì)照, 經(jīng)MTT和DMSO處理后, 用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的吸收值.

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)原理如Scheme 1(A)所示. 首先在金納米顆粒上修飾DNA1, 然后依次與DNA4, DNA2和DNA3組裝成GDC傳感器, 由于FAM和Cy5.5熒光分子與GNP的距離不同, 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)程度也不同, FAM分子的熒光被GNP猝滅, Cy5.5與GNP之間不發(fā)生FRET. 紫外光(UV)作為光控開光, 在其照射下DNA4上的光敏基團(tuán)被打開, 末端核苷酸掉落, 釋放DNA3, 同時(shí)裸露出作用位點(diǎn)Toehold1, catalyst DNA(C′)自發(fā)與Toehold1結(jié)合, 置換掉DNA2, 導(dǎo)致FAM熒光信號(hào)恢復(fù), 同時(shí)裸露出Toehold2, Fuel(F)再與Toehold2結(jié)合, 置換出C′, 在此過程中, C′不斷被釋放且繼續(xù)參與到下一次循環(huán)反應(yīng)中, 起到循環(huán)放大的作用. 具體堿基序列與作用位點(diǎn)見Scheme 1(B).

Scheme 1 Schematic illustration of dual-color GDC sensor for quantitative analysis of microRNA(A) Photo-activated and miRNA-catalyzed disassemble of DNA2, DNA3 with GNP through two-step DNA strand displacement reactions(SDR); (B) DNA sequences for GDC and chemical structure of the photocleavage group(PC-linker).

2.2 金納米顆粒與熒光染料DNA組裝過程的表征

用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)合成的GNP及GNP-DNA1進(jìn)行了表征. 如圖1(A)所示, 未修飾的GNP的紫外最大吸收峰位于519 nm, 經(jīng)DNA1修飾后, 特征吸收峰紅移至523 nm處, 這是因?yàn)樵贕NP表面修飾DNA1后, 其共軛結(jié)構(gòu)增多, 因此紫外吸收發(fā)生紅移[40,41]. 用TEM對(duì)GNP-DNA1的形貌與分散性進(jìn)行了表征[圖1(B)], 可見GNP粒徑均一, 分散性均勻, 使用Image J軟件對(duì)任意100個(gè)金納米顆粒進(jìn)行尺寸統(tǒng)計(jì), 其平均粒徑為17.2 nm. 圖1(C)為納米顆粒的水合粒徑表征結(jié)果, GNP, GNP-DNA1, GNP-DNA1-DNA4, GNP-DNA1-DNA4-DNA2和GNP-DNA1-DNA4-DNA2-DNA3(GDC)的水合粒徑分別為13.54, 21.04, 28.21, 32.67和37.84 nm, 呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì), 符合理論設(shè)計(jì).

Fig.1 Absorbtion spectra of GNP(a) and GNP-DNA1(b)(A), low-magnification TEMimage of GNP-DNA1(B) and dynamic light scattering measurements(C)

通過二硫蘇糖醇取代反應(yīng), 測(cè)定了各DNA(DNA1, DNA2, DNA3和DNA4)的熒光數(shù)值, 結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線[圖S1(A)～(D), 見本文支持信息]得出每個(gè)金納米顆粒上 DNA1, DNA2, DNA3和DNA4的數(shù)目分別為39, 18, 19和25條.

2.3 GDC納米傳感器的可行性

該傳感器以302 nm的紫外光作為啟動(dòng)開關(guān), 因此需要評(píng)估紫外光照剪切DNA的靈敏度. 以DNA4作為研究對(duì)象, 光照時(shí)間分別為0, 30, 60, 90, 120, 300, 600和1200 s, 然后用6.8%的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)對(duì)樣品進(jìn)行電泳和染色, 成像結(jié)果如圖2(A)所示, 可見DNA4經(jīng)紫外光照射后會(huì)迅速斷開, 使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)其條帶灰度值[圖2(B)], 在300 s時(shí)剪切率已達(dá)到92.7%.

隨后, 對(duì)GDC組裝與催化循環(huán)解組裝過程進(jìn)行了表征. 結(jié)果[圖2(C)]表明, 首先GNP-DNA1逐步連接DNA4, DNA2和DNA3, 然后在不同條件下進(jìn)行催化循環(huán)解組裝. 條帶1至4是逐漸上移的, 說明隨著DNA組裝過程的進(jìn)行金納米顆粒上的DNA數(shù)量增多, 其粒徑變大, 遷移率減小. 結(jié)合圖1(B), 可證實(shí)GDC組裝過程符合理論設(shè)計(jì).

在圖2(C)中, 條帶5 與9表明體系中含有F和C′, 而不經(jīng)紫外光照射時(shí)組裝體不會(huì)解散. 比較條帶6, 9和10可見, 在只有紫外光照射條件下不會(huì)發(fā)生催化循環(huán); 而當(dāng)紫外光照射和F同時(shí)存在時(shí), 即使只加入0.1×C′, 解組裝也比較充分; 僅有F或者C′存在時(shí)(條帶7, 8和11), 解組裝反應(yīng)也不能發(fā)生. 條帶12中無DNA3參與組裝時(shí), Toehold1未被覆蓋, 因此不需紫外光照射即可發(fā)生解組裝. 以上結(jié)果證實(shí), 一個(gè)完整的GDC傳感器需在UV, F和C′三者共存的條件下才能發(fā)生催化循環(huán)反應(yīng).

Fig.2 Characterization of photocleavage DNA4 with UV irradiation(302 nm, 6 W)(A) Native PAGE of DNA4 with different UV irradiation time; (B) fraction of photocleaved products with different UV irradiation time; (C) agarose Gel Electrophoresis characterization of GNP assembly with DNA1, DNA4, DNA2 and DNA3, and the catalytic disassembly of GDC in the present or absence of UV irradiation, catalyst DNA(C′) and Fuel DNA. Line 1: GNP-DNA1; line 2: GNP-DNA1+DNA4; lane 3: GNP-DNA1+DNA4+DNA2; lane 4: GNP-DNA1+DNA4+DNA2+DNA3(GDC); lane 5: GDC+1×F+1×C′; lane 6: GDC+hv; lane 7: GDC+ hv+1×F; lane 8: GDC+ hv+1×C′; lane 9: GDC+ hv+1×F+1×C′; lane 10: GDC+hv+1×F+0.1×C′; lane 11: GDC+ hv+0.1×C′; lane 12: GNP-DNA1+DNA4+DNA2+1×F+0.1×C′.

2.4 不同紫外光照時(shí)間對(duì)催化解組裝的影響

通過瓊脂糖凝膠電泳分析和測(cè)定對(duì)應(yīng)的上層清液的熒光強(qiáng)度值, 探究了不同紫外光照時(shí)間對(duì)催化循環(huán)解組裝程度的影響. 隨著UV照射時(shí)間的增加, 條帶遷移率逐漸增大[圖3(A)], 這是由于UV照射時(shí)間的增加使光剪切率增大, 解組裝程度也變大, 因而隨著GDC釋放的FAM熒光染料的增多, 其整體尺寸減小, 說明催化循環(huán)解組裝越來越充分, 對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)[圖3(B)]. 當(dāng)光照時(shí)間為300 s時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值, 繼續(xù)增加紫外光照時(shí)間至600或1200 s, 熒光強(qiáng)度稍微降低, 原因是長(zhǎng)時(shí)間的紫外光照對(duì)熒光分子存在光漂白效應(yīng). 本文通過測(cè)定細(xì)胞存活率來考察UV對(duì)細(xì)胞活性的影響[圖S2(A), 見本文支持信息]. 以UV作用0 s的樣品為對(duì)照組, 其細(xì)胞存活率為100%; 光照5 min時(shí), 細(xì)胞存活率為89.65%; 光照20 min后, 存活率仍可達(dá)85.17%, 表明UV對(duì)細(xì)胞活性影響較小.

2.5 C′/L摩爾比對(duì)催化解組裝的影響

通過瓊脂糖凝膠電泳分析探究了不同C′/L摩爾比對(duì)GDC組裝體催化解組裝的影響. 如圖4(A)所示, 在加入1×F與UV照射5 min條件下, GDC的解組裝程度與C′的濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān), 當(dāng)僅有微量C′存在時(shí)即可發(fā)生解組裝, 并隨著C′/L摩爾比的增大, 解組裝越來越充分, 條帶遷移率逐漸增大, 對(duì)應(yīng)的條帶向下遷移更明顯. 產(chǎn)生該結(jié)果的原因是, 隨著C′濃度的增大, GDC解組裝程度變大, 組裝體上FAM的釋放量增多, 其對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)[圖4(B)], 因此組裝體尺寸逐漸減小而使得遷移率增大. 當(dāng)C′/L摩爾比均為1時(shí), UV照射對(duì)解組裝體系的影響見圖4(C), 只有在UV照射5 min的條件下, 組裝體才有較強(qiáng)的熒光恢復(fù). 根據(jù)C′/L對(duì)應(yīng)的FAM熒光強(qiáng)度恢復(fù)值的線性曲線[圖4(D)], 計(jì)算得出該傳感器的檢出限為23.1 pmol/L(3σ/k,σ為空白值標(biāo)準(zhǔn)偏差,k為斜率).

Fig.4 Agarose gel electrophoresis characterization of disassembled products with different C′/DNA4 molar ratios(A) and photoluminescence spectra of released FAM-DNA2 with different C′/DNA4 molar ratios(B), photoluminescence spectra of GNP-DNA sensor for C′ detection with or without UV irradiation(C) and calibration curve for quantitative analysis of miRNA(D)(A) a. GDC+1×F+1×C′(NO UV); b. GDC+1×F+1×C′(UV 5 min); c. GDC+1×F+0.5×C′(UV 5 min); d. GDC+1×F+0.2×C′(UV 5 min); e. GDC+1×F+0.1×C′(UV 5 min); f. GDC+1×F+0.02×C′(UV 5 min); g. GDC+1×F+0.01×C′(UV 5 min); h. GDC+1×F+0.004×C′(UV 5 min); i. GDC+1×F+0×C′(UV 5 min).

2.6 GDC傳感器的特異性與穩(wěn)定性

將不加miRNA的GDC樣品作為空白對(duì)照組, 其余樣品中分別加入C′(等同于miRNA-21序列)及其變異序列(見表1, 即分別有1, 2和3個(gè)堿基錯(cuò)配), 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳與熒光光譜表征. 圖5中條帶1～5樣品分別為GDC+C′(miRNA-21), GDC+mis-1, GDC+mis-2, GDC+mis-3和GDC(對(duì)照組). 結(jié)果表明, 含堿基錯(cuò)配序列的DNA條帶的遷移率與對(duì)照組無差別, 均不能誘導(dǎo)GDC的解組裝, 而只有加入C′的實(shí)驗(yàn)組中GDC才能發(fā)生明顯的解組裝, 遷移率增大, 驗(yàn)證了該傳感器的高度特異性. 圖S3(見本文支持信息)示出了對(duì)GDC分別在不同pH條件[圖S3(A)]、 不同NaCl濃度[圖S3(B)]及脫氧核糖核酸酶DNase Ⅰ[圖S3(C)]作用下的紫外吸收光譜及熒光光譜圖, 結(jié)果表明, GDC在不同pH條件、 不同鹽粒子或含酶環(huán)境中均具有良好的穩(wěn)定性, 為細(xì)胞成像應(yīng)用提供了可行性.

Fig.5 Specificity evaluation of GDC sensor(A) Agarose gel electrophoresis of catalytic DNA C′ and three mutation sequences[C′(mis-1), C′(mis-2) and C′(mis-3)] containing one, two, three mismatches respectively. The sample without catalyst DNA is used as the control. All samples are irradiated with UV light in the presence of Fuel DNA; (B) corresponding photoluminescence spectra of the above-mentioned samples.

2.7 細(xì)胞熒光成像

探究了不同UV時(shí)間對(duì)活的HeLa細(xì)胞熒光恢復(fù)強(qiáng)度的影響. 如圖6所示, 隨著UV照射時(shí)間的增加, GDC的解組裝會(huì)更加充分, FAM熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng), 由于Cy5.5熒光染料與GNP之間不存在FRET效應(yīng), 因此其熒光強(qiáng)度保持不變. 由圖S2(B)(見本文支持信息)所示柱狀圖可見, 分別加入到GDC, GDC+UV和GDC+Fuel+UV體系中的細(xì)胞的存活率差異很小, 表明這些體系對(duì)活細(xì)胞的影響較小, 其中在GDC+Fuel+UV體系中細(xì)胞存活率仍能達(dá)到88.46%.

Fig.6 Photocontrolled catalytic imaging of FAM and Cy5.5 fluorescence dyesin living HeLa cells with different UV irradiation time

圖S4(A)(見本文支持信息)是加入Fuel與不加入Fuel條件下獲得的固定細(xì)胞成像圖. 對(duì)HeLa與HEK-293均用UV照射5 min, 在HeLa細(xì)胞中, 不加入Fuel時(shí)FAM熒光基本沒有恢復(fù), 只有在Fuel存在時(shí)才出現(xiàn)明顯的綠色熒光; 而HEK-293細(xì)胞中不表達(dá)miRNA-21, 即使加入Fuel也未產(chǎn)生熒光恢復(fù), 說明GDC對(duì)miRNA-21具有高特異性. 在圖S4(B)(見本文支持信息)所示固定HeLa細(xì)胞中, 當(dāng)有Fuel存在時(shí), 對(duì)使用或不用紫外光照射的細(xì)胞成像進(jìn)行對(duì)照, 可見不使用紫外光照射時(shí)不能實(shí)現(xiàn)FAM的熒光成像, 說明了UV照射的必要性.

2.8 HeLa細(xì)胞中miRNA含量的定量計(jì)算

根據(jù)表2數(shù)據(jù)繪制了FLFAM/FLCy5.5比值與對(duì)應(yīng)的C′/L摩爾比的線性方程(見圖7), 使用Image J軟件對(duì)細(xì)胞熒光成像圖進(jìn)行FAM與Cy 5.5熒光強(qiáng)度的測(cè)定, 然后將兩者平均熒光強(qiáng)度的比值代入方程, 經(jīng)定量計(jì)算得到HeLa細(xì)胞中miRNA的平均含量為0.0236 nmol/L.

Table 2 FL intensity of FAM and Cy 5.5

Fig.7 Standard curve of FLFAM, 520 nm/FLCy 5.5, 714 nm vs.C′/L molar ratios

綜上所述, 利用金納米顆粒與熒光染料FAM和Cy5.5修飾的DNA自組裝, 構(gòu)建了一種光控的雙色熒光納米傳感器. 在紫外光(UV)、 Fuel DNA和Catalyst DNA(C′)共同作用下, 實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的催化放大, 并應(yīng)用于癌細(xì)胞成像中. 與無光敏基團(tuán)修飾的單色熒光標(biāo)記傳感器相比, 該體系可實(shí)現(xiàn)對(duì)傳感器在時(shí)間和空間上的控制; 根據(jù)2種熒光強(qiáng)度的比值對(duì)細(xì)胞內(nèi)miRNA含量進(jìn)行定量分析, 不僅避免了常規(guī)檢測(cè)方法中背景信號(hào)的干擾, 而且通過循環(huán)催化作用顯著降低了檢出限. 該納米傳感器有望應(yīng)用于不同種類miRNA的定量分析, 在活體檢測(cè)、 癌癥篩查與診斷治療等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值. 同時(shí), 紫外光不僅會(huì)對(duì)熒光染料造成一定程度的光漂白, 還會(huì)對(duì)活體中正常組織細(xì)胞造成光損傷, 因此在后續(xù)研究中, 可將紫外光替換為長(zhǎng)波長(zhǎng)光(如近紅外光), 或者采用與其它光轉(zhuǎn)換納米材料結(jié)合的方法, 共同促進(jìn)此類方法的發(fā)展進(jìn)步及應(yīng)用.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20200026.