劉 虹, 鄒國均, 孫新園, 歐陽健明

(1. 暨南大學生物礦化與結石病防治研究所, 廣州 510632;2. 廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院, 廣州 510230)

腎結石在全球的發(fā)病率約為10%, 且其復發(fā)率高[1]. 腎結石的主要成分為草酸鈣(CaOx), 并主要以一水草酸鈣(COM)和二水草酸鈣(COD)的形式存在. 腎結石的形成涉及CaOx晶體的成核、 生長、 聚集以及滯留等過程[2,3]. 腎上皮細胞(REC)損傷是引起腎結石形成的主要因素之一[4]. REC損傷會導致細胞表面帶負電的黏附分子(如透明質酸和骨橋蛋白等)的過量表達[5], 這些變化不僅為尿晶體的成核、 生長提供了有效位點(如通過吸附Ca2+離子)[6], 而且增強了細胞膜與尿晶體的黏附(如黏附表面帶正電荷的COM晶體)[7], 從而增加腎結石形成的風險.

前期研究[8]表明, 結石患者尿液中的CaOx晶體多數(shù)為尺寸較大的聚集體, 并且?guī)в屑怃J的棱角; 而健康對照者尿液中的微晶則為眾多的小尺寸圓鈍顆粒, 且聚集體較少. 尿液中鈣和草酸濃度的變化, 即草酸/鈣(Ox/Ca)摩爾比會影響CaOx晶體的生長和聚集. 與正常人相比, 腎結石患者尿液中的草酸鹽濃度更高[9].

草酸鹽也是造成晶體聚集的最重要因素[10]. Bretherton等[11]研究表明, CaOx成核和生長速率隨著草酸濃度的增加而增大, 并導致形成的晶體數(shù)目增多, 尺寸變大. Jung等[12]的研究也表明, CaOx過飽和溶液中Ox/Ca摩爾比的改變可顯著影響晶體結晶, 過量的鈣有利于COD晶體的生成, 過量的草酸有利于COM晶體的生成.

同時, 研究[13,14]證實, 攝入足夠的鈣可以結合體內更多的草酸鹽, 從而減少尿草酸鹽的排泄, 限制CaOx結石的生長. 尿液中尿石鹽(如CaOx等)的過飽和是誘發(fā)結石形成的最初動力. CaOx的相對過飽和度(RS)是影響CaOx晶體結晶的最重要因素. Borghi等[15]研究表明, CaOx的RS降低能夠減少CaOx的自發(fā)成核, 即降低CaOx的RS能夠抑制CaOx結晶. 在RS=30時形成的晶體數(shù)量比RS=10時顯著增加, 而RS>50時則形成尺寸較大的聚集體[16].

本文在保持CaOx的RS恒定的情況下, 研究了溶液中Ox/Ca摩爾比變化對CaOx結晶的影響以及形成的晶體對腎上皮細胞的毒性差異, 以期為抑制腎結石的形成提供新啟示.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

人腎近端小管上皮細胞(HK-2)(中國科學院上海細胞庫); DMEM培養(yǎng)基、 胎牛血清和胰酶(美國Gibco公司); 青霉素和鏈霉素(北京普博生物技術有限公司); 草酸鈉(Na2C2O4, 純度99.7%)、 二水合氯化鈣(CaCl2·2H2O, 純度99.7%)和4%多聚甲醛(純度99.7%)均購自廣州化學試劑廠; 細胞增殖毒性檢測試劑盒(CCK-8)、 活性氧(ROS)檢測試劑盒、 吖啶橙(AO)、 線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、 微絲綠色熒光探針(Actin-Tracker Green)、 羊血清、 骨橋蛋白一抗和FITC二抗均購自上海碧云天生物技術有限公司.

D/MAX 2400型X射線粉末衍射儀(日本理學公司); Optima 2000DV型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(美國Perkin Elmer公司); Beckman Coulter型流式細胞儀(美國Gallios公司); LSM510 Meta Duo Scan型激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司); XL-30型環(huán)境掃描電子顯微鏡(SEM, 荷蘭Phillps公司); Safire2型酶標儀(瑞士Tecan公司); Leica DMRA2型倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司).

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

HK-2細胞培養(yǎng)在37 ℃, 5%CO2且飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行, 待細胞達到80%匯合后用胰酶消化, 吹打分散成單細胞懸液. 將細胞懸液(密度為1.0×105cells/mL)接種于相應規(guī)格的培養(yǎng)板中, 加入含10%(體積分數(shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育24 h, 吸除上層清液, 用PBS緩沖液洗滌2次, 改用無血清DMEM培養(yǎng)液孵育12 h, 使細胞同步化.

將實驗模型分為如下4組. (1) 正常對照組: 吸除培養(yǎng)液, 用PBS緩沖液洗滌細胞2次后, 加入無血清的DMEM培養(yǎng)液; (2) 損傷對照組: 參照文獻[17]方法用2.8 mmol/L草酸損傷HK-2細胞3.5 h后, 加入無血清的DMEM培養(yǎng)液; (3) 正常晶體組: 在固定CaOx的RS=9.27條件下[18], 改變Ox/Ca摩爾比分別為0.25, 1和4 , 得到3種CaOx過飽和溶液, 在正常HK-2細胞表面誘導晶體生長12 h; (4) 損傷晶體組: 將HK-2細胞用2.8 mmol/L的草酸損傷3.5 h后, 吸除上層清液, 用PBS緩沖液洗滌2次, 然后分別加入上述3種CaOx過飽和溶液, 誘導晶體生長12 h.

1.3 CCK-8法檢測細胞活力

細胞分組同1.2節(jié). 將濃度為1.0×105cells/mL的HK-2細胞按100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板中, 孵育24 h后吸除培養(yǎng)液, 每孔加入100 μL細胞培養(yǎng)液和10 μL CCK-8試劑, 避光孵育1.5 h. 用酶標儀在450 nm處測量吸光度(A), 用下式求得細胞活力(Cell viability, %):

式中:A(treatment group)為實驗組的吸光度值;A(control group)為正常對照組的吸光度值.

1.4 細胞內活性氧(ROS)水平檢測

細胞種板密度和實驗分組與1.2節(jié)相同, 達到作用時間后吸除上層清液, 用PBS緩沖液清洗2次, 加入500 μL用無血清培養(yǎng)液稀釋的DCFH-DA. 置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min, 再用PBS緩沖液清洗3次, 以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA, 用熒光顯微鏡觀察ROS水平, 并通過酶標儀檢測其熒光強度.

1.5 溶酶體完整性檢測

熒光定性觀察: 將濃度為1.0×105cells/mL的HK-2細胞按1 mL/孔接種于12孔培養(yǎng)板中, 孵育24 h后, 加入300 μL用DMEM配制的5 μg/mL的吖啶橙(AO)染色15 min. 實驗分組與1.2節(jié)相同. 吸除上層清液, 用PBS緩沖液洗滌2次, 通過熒光顯微鏡觀察細胞內紅色和綠色熒光強度.

熒光定量檢測: 將濃度為1.0×105cells/mL的HK-2細胞按100 μL/孔接種于96孔板中, AO染色及細胞處理步驟同上. 達到作用時間后, 用酶標儀檢測紅色和綠色熒光強度. 激發(fā)波長為485 nm, 反射波長分別為530 nm(綠色, 細胞質中AO)和620 nm(紅色, 溶酶體中AO). 溶酶體的完整性=紅光強度/綠光強度; 處理組溶酶體的完整性=(紅光強度/綠光強度)/對照組溶酶體的完整性.

1.6 細胞表面骨橋蛋白(OPN)表達檢測

細胞種板密度和實驗分組與1.2節(jié)相同. 達到孵育時間后, 吸除上層清液, 用PBS緩沖液洗滌細胞3次, 每次5 min; 加入4%多聚甲醛固定10 min, 再用PBS緩沖液洗滌3次, 每次3 min; 加入羊血清封閉20 min, 加入骨橋蛋白一抗(1∶100), 于4 ℃過夜. 用PBS緩沖液洗滌3次, 避光滴加FITC二抗(1∶100), 于37 ℃孵育30 min后, 用PBS緩沖液洗滌3次, 最后用DAPI染色并封片, 通過激光共聚焦顯微鏡觀察OPN表達情況. 細胞核呈藍色, 表達的OPN呈綠色.

1.7 共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架

細胞種板密度和實驗分組與1.2節(jié)相同. 達到孵育時間后, 吸除上層清液, 用PBS緩沖液洗滌細胞2次, 加入4%(體積分數(shù))多聚甲醛于室溫下固定細胞20 min, 用含0.1%(體積分數(shù)) Triton X-100的PBS緩沖液洗滌2次, 每次5 min. 用含0.1%(體積分數(shù)) Triton X-100的PBS緩沖液按照體積比1∶100的比例稀釋 Actin-Tracker Green. 每孔加入500 μL稀釋的Actin-tracker Green, 室溫下避光孵育60 min. 孵育后用含0.1%(體積分數(shù)) Triton X-100的PBS緩沖液洗滌2次, 每次約5 min. 通過激光共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架的變化.

1.8 流式細胞儀檢測線粒體膜電位(Δψm)的變化

細胞種板密度和實驗分組與1.2節(jié)相同. 達到孵育時間后, 吸除上層清液, 用PBS緩沖液洗滌細胞2次, 用0.25%胰酶消化, 吹打細胞, 離心(1000 r/min)5 min, 吸除上層清液, 用PBS緩沖液洗滌, 重新離心, 得到細胞沉淀. 加入500 μL PBS緩沖液重懸, 充分混勻后移入EP管中, 經(jīng)JC-1染色后用流式細胞儀檢測Δψm的變化.

1.9 流式細胞儀檢測磷酯酰絲氨酸(PS)外翻量

細胞種板密度和實驗分組與1.2節(jié)相同. 達到孵育時間后, 用胰酶消化, 吹打細胞使細胞懸浮, 離心(1000 r/min) 5 min, 吸除上層清液, 用PBS緩沖液洗滌, 重新離心, 得到細胞沉淀. 加入Annexin-V-FITC染料, 于4 ℃避光孵育30 min, 通過流式細胞儀檢測PS外翻量.

1.10 ICP檢測形成的CaOx晶體量

實驗分組如下: (A) 正常細胞誘導晶體生長組: 在不經(jīng)任何處理的正常細胞中加入CaOx過飽和溶液, 誘導晶體生長12 h; (B) 損傷細胞誘導晶體生長組: 用2.8 mmol/L草酸損傷細胞3.5 h后, 吸出培養(yǎng)基, 用PBS緩沖液洗滌2次后加入CaOx過飽和溶液, 誘導晶體生長12 h. 經(jīng)胰酶消化后, 收集細胞和形成的晶體; 加入4.0 mL濃HNO3和1.0 mL HClO4混合溶液硝化至澄清后, 再加熱至冒煙, 蒸發(fā)至近干時停止加熱, 利用余熱將殘液蒸干, 冷卻, 加入3 mL 2%的HNO3稀釋溶解, 利用ICP測定Ca2+離子的濃度, 然后換算成CaOx晶體的質量. 對照組采用如上硝化方法處理, 以用于扣除細胞內本身存在的Ca2+.

1.11 CaOx晶體的XRD分析

種板密度和實驗分組與1.10節(jié)相同, 待晶體生長12 h后, 吸除培養(yǎng)液, 于60 ℃恒溫烘干, 對干燥后樣品進行XRD分析.

1.12 細胞和CaOx晶體的SEM表征

種板密度和實驗分組與1.10節(jié)相同, 待晶體生長12 h后, 吸除培養(yǎng)液, 進行SEM制樣. 加入2.5%(體積分數(shù))戊二醛固定24 h, 再用1% OsO4將細胞固定, 經(jīng)體積分數(shù)為30%, 50%, 70%, 90%和100%的乙醇梯度脫水后, 進行CO2臨界點干燥, 噴金包被后利用SEM觀察.

1.13 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 Ox/Ca摩爾比對細胞活力的影響

在固定CaOx的RS=9.27的條件下, 改變Ox/Ca摩爾比分別為4, 1和0.25(表1), 分別在正常

Table 1 Composition and labeling of CaOx supersaturated solution with different Ox/Ca molar ratios

HK-2細胞和2.8 mmol/L草酸損傷的HK-2細胞表面誘導CaOx晶體生長12 h, 細胞活力變化如圖1所示. 與正常HK-2細胞的活力(100%)相比, 草酸損傷細胞的活力降低到66.27%. 各組加入CaOx過飽和溶液后, 細胞活力均進一步降低, 其中正常組降低至75.21%～93.77%, 損傷組降低至41.20%～59.99%. 這說明 CaOx 過飽和溶液會對細胞產(chǎn)生損傷, 而且隨著過飽和溶液中 Ox/Ca 摩爾比增大, 細胞的活力降低、 損傷加重.

Fig.1 Cell viability of HK-2 cells before and after injury with CaOx supersaturated solutions with various Ox/Ca molar ratiosAction time: 12 h; ** P<0.01, * P<0.05 vs. normal blank group.

2.2 Ox/Ca摩爾比對細胞內ROS水平的影響

如圖2(A)所示, 正常組細胞綠色熒光較弱, 表明細胞內ROS水平很低. 加入不同Ox/Ca摩爾比的CaOx過飽和溶液后, 細胞的ROS水平均升高, 在固定RS=9.27的條件下, Ox/Ca 摩爾比為4∶1時 ROS水平升高得最為明顯.

Fig.2 Intracellular ROS level of HK-2 cells before and after injury with CaOx supersaturatedsolutions with various Ox/Ca molar ratios (A) Fluorescence microscopy images of ROS; (B) quantitative fluorescence intensity.Action time: 12 h; ** p<0.01, * p<0.05 vs. normal blank group.

如圖2(B)所示, 損傷對照組的綠色熒光比正常組顯著增強, 即產(chǎn)生了大量的ROS. 在損傷組中加入不同Ox/Ca摩爾比的CaOx過飽和溶液后, 其ROS水平進一步升高, 且隨著Ox/Ca摩爾比的增大逐漸升高.

2.3 Ox/Ca摩爾比對溶酶體完整性的影響

正常細胞溶酶體的結構完整, 紅色熒光和綠色熒光疊加呈現(xiàn)橘紅色. 而當溶酶體的完整結構遭到破壞時, 紅色熒光強度降低. 因此, 可以通過測定紅色/綠色熒光的強度比判定溶酶體的損傷程度.

如圖3(A)所示, 無論是正常細胞組還是損傷細胞組, 加入CaOx過飽和溶液后均導致橘紅色熒光不同程度的降低, 且隨著溶液中Ox/Ca摩爾比增大, 橘紅色熒光進一步降低, 表明細胞的溶酶完整性進一步遭到破壞[圖3(B)], 細胞損傷程度加大.

Fig.3 Lysosomal integrity observation of HK-2 cells before and after injury with CaOx supersaturatedsolution with various Ox/Ca molar ratios (A) Fluorescence microscopy images; (B) quantitative fluorescence intensity. Action time: 12 h; ** P<0.01, * P<0.05 vs. normal blank group.

2.4 Ox/Ca摩爾比對細胞表面OPN表達量的影響

細胞表面骨橋蛋白(OPN)是一種帶負電的非膠原性骨基質蛋白, 當腎上皮細胞被損傷后, 會引起OPN的明顯上調. 正常細胞周圍僅存在少量的綠色熒光[圖4(A)], 而損傷細胞周圍出現(xiàn)顯著的綠色熒光, 表明損傷細胞表面的OPN表達量顯著增加. 在正常組或損傷組細胞中加入CaOx過飽和溶液后, OPN表達量均隨溶液中Ox/Ca摩爾比的增大而進一步增加[圖4(B)].

Fig.4 OPN expression of HK-2 cells before and after injury with CaOx supersaturatedsolutions with various Ox/Ca molar ratios (A) Fluorescence microscopy images; (B) quantitative results of OPN expression. Nucleus: blue;OPN: green. Action time: 12 h; ** P<0.01, * P<0.05 vs. normal blank group.

2.5 Ox/Ca摩爾比對細胞骨架的影響

肌動蛋白纖維是構成細胞骨架的重要蛋白纖維. 采用微絲綠色熒光探針對HK-2細胞的肌動蛋白染色, 觀察了細胞骨架的變化. 由圖5可見, 正常組細胞的骨架完整, 細胞肌動蛋白微絲井然有序, 清晰可見; 而損傷組細胞的骨架有序性降低, 肌動蛋白微絲分布紊亂, 細胞微絲變模糊. 無論是正常組還是損傷組細胞, 加入CaOx過飽和溶液后, 細胞肌動蛋白微絲均變得紊亂, 細胞骨架被破壞, 且隨著Ox/Ca摩爾比增加破壞程度加劇. 當Ox/Ca摩爾比為4時, 在正常細胞表面生成了四角雙錐形狀的COD晶體; 而在損傷細胞表面則生成了六角菱形的COM晶體.

Fig.5 Confocal observation images of cytoskeleton in HK-2 cells before and after injurywith CaOx supersaturated solutions with various Ox/Ca molar ratios Actin: green; nuclei: blue; action time: 12 h.

2.6 Ox/Ca摩爾比對線粒體膜電位(Δψm)的影響

細胞內Δψm的變化反映了細胞內線粒體的損傷程度. Δψm下降的程度越大, 表明細胞的損傷越大. 如圖6所示, 形成的CaOx對細胞的損傷導致膜電位下降. 正常組和損傷組細胞的Δψm下降的比例分別為8.50%和26.88%; 加入不同Ox/Ca摩爾比的CaOx過飽和溶液后, 2組細胞的Δψm下降的比例分別增加至13.87%～25.58%和43.53%～76.13%.

Fig.6 Mitochondrial membrane potential detection(Δψm) of HK-2 cells before and after injury withCaOx supersaturated solutions with various Ox/Ca molar ratios(A1—A8) Flow cytometric data of mitochondrial membrane potential(Δψm), green R2 value represents decreasing membrane potential; (A1)—(A4) normal cell; (A5)—(A8): damage cell; (A1), (A5) blank; n(Ox)/n(Ca): (A2), (A6) 0.25; (A3), (A7) 1; (A4), (A8) 4. (B) Quantitative histogram of Δψm. Action time: 12 h; ** P<0.01, * P<0.05 vs. normal blank group.

2.7 Ox/Ca摩爾比對PS外翻量的影響

如圖7所示, 正常組和損傷組細胞的PS外翻比例分別為7.92%和36.45%; 加入不同Ox/Ca摩爾比的CaOx過飽和溶液后, PS外翻量比例分別增加至22.91%～27.31%和38.39%～44.16%.

Fig.7 Flow cytometry analysis of PS eversion in HK-2 cells before and after injury withCaOx supersaturated solutions with various Ox/Ca molar ratios(A1—A8) Histogram of the percentage of PS eversion; abscissa: the fluorescence intensity; ordinate: the number of cells; (A1)—(A4) normal cell; (A5)—(A8): damage cell; (A1), (A5) blank; n(Ox)/n(Ca): (A2), (A6) 0.25; (A3), (A7) 1; (A4), (A8) 4. (B) Quantitative histogram. Action time: 12 h; ** P<0.01, * P<0.05 vs. normal blank group.

2.8 Ox/Ca摩爾比對細胞表面形成的CaOx晶體量的影響

采用ICP定量檢測了CaOx過飽和溶液中各組細胞表面形成的CaOx晶體量. 由圖8可見, 隨著溶液中Ox/Ca摩爾比增大細胞誘導生成的CaOx晶體量增多, 且損傷組細胞誘導的晶體量(12.92～20.38 μg/cm2)大于正常組(11.37～18.26 μg/cm2).

Fig.8 Amount of CaOx crystals on HK-2 cells injury with CaOx supersaturated solutionswith various Ox/Ca molar ratios Action time: 12 h; * p<0.05.

2.9 Ox/Ca摩爾比對細胞表面COM晶體形成和聚集的影響

采用SEM觀察了不同Ox/Ca摩爾比過飽和溶液中細胞誘導形成的CaOx晶體. 由圖9可見, 在正常HK-2細胞表面主要形成四方錐形二水草酸鈣(COD)晶體, 但隨著Ox/Ca摩爾比增大, COD晶體數(shù)量和尺寸均增加, 并在Ox/Ca摩爾比為4時出現(xiàn)了少量COM晶體. 損傷組細胞主要誘導六角菱形的一水草酸鈣(COM)晶體形成, 且隨著Ox/Ca摩爾比的增大, COM晶體數(shù)量和聚集程度均增加. 與正常組細胞相比, 損傷組細胞誘導的晶體棱角更加尖銳. 尖銳狀的晶體對腎上皮細胞的損傷大于圓鈍狀的晶體.

Fig.9 SEM images of CaOx crystals on HK-2 cells before and after injury with CaOx supersaturatedsolutions with various Ox/Ca molar ratios (A1)—(A3) Normal cells; (A4)—(A6) damage cell; n(Ox)/n(Ca): (A1), (A4) 0.25; (A2), (A5) 1; (A3), (A7) 4. Action time: 12 h.

2.10 細胞誘導形成的CaOx晶體的XRD表征

Fig.10 XRD patterns of CaOx crystals on HK-2 cells before and after injury with CaOxsupersaturated solutions with various Ox/Ca molar ratios* COD; # COM. (A1)—(A3) normal cell; (A4)—(A6) damage cell; n(Ox)/n(Ca): (A1), (A4) 0.25; (A2), (A5) 1; (A3), (A6) 4. Action time: 12 h.

3 討 論

3.1 細胞誘導晶體形成

3.2 Ox/Ca摩爾比增大促進晶體形成和聚集

無論是在正常組細胞表面還是在損傷組細胞表面, Ox/Ca摩爾比增大均會促進CaOx晶體的形成, 即誘導的晶體質量增加(圖8和圖9). Rodgers等[30]研究表明, 草酸鹽對CaOx過飽和度的影響是鈣的23倍; 尿液中的草酸鹽濃度達到正常人的上限時, 大多數(shù)個體都會超過CaOx的形成積Ksp, 從而形成結晶尿, 導致CaOx晶體在尿液中自發(fā)形成[31], 從而引起CaOx晶體量大幅增加.

在損傷細胞表面, Ox/Ca摩爾比增大后形成的晶體聚集程度顯著增加. 損傷細胞表面表達的帶負電分子(OPN, HA和PS等)與已經(jīng)形成的CaOx晶體相作用, 不但促進了晶體在細胞膜上的黏附, 而且細胞表面帶負電荷的分子的增多也增加了帶正電荷的COM晶體在細胞表面的聚集[32].

3.3 形成的晶體對HK-2細胞的損傷

在過飽和的CaOx溶液中HK-2細胞能誘導CaOx晶體形成, 這些晶體會對細胞產(chǎn)生損傷. 晶體對細胞的損傷程度與晶體中COM的百分含量、 晶體數(shù)目、 晶體聚集程度和晶體的棱角尖銳程度4個因素成正相關.

圖11示出了改變Ox/Ca摩爾比后在正常和損傷HK-2細胞表面形成的CaOx晶體差異及所形成晶體的細胞毒性差異機理圖. CaOx過飽和溶液作用于HK-2細胞后, 正常細胞生成的晶體為較圓鈍的COD, 損傷細胞表面生成的晶體為較尖銳的COM; 隨著溶液中Ox/Ca摩爾比的增大, 細胞表面生成的晶體增多; 形成的CaOx晶體對細胞造成損傷, 誘導了ROS的過量產(chǎn)生, 引起了溶酶體破裂和線粒體膜通透性改變, 導致線粒體膜電位去極化程度增加[33], 線粒體功能破壞, 膜電位下降. 正常情況下, PS位于腎小管上皮細胞膜的內側, 但在細胞膜受損后PS會遷移至細胞膜外側. 細胞表面PS外翻量和OPN表達量的增加使細胞黏附晶體的能力增強.

Fig.11 Mechanism diagram of cytotoxic difference and CaOx crystal difference induced by HK-2 cellsbefore and after injury with CaOx supersaturated solutions with various Ox/Ca molar ratios

早期的研究也證明, COM對HK-2細胞的毒性比COD大[34], 棱角尖銳的COM晶體比圓鈍的COM晶體更容易造成細胞的急性損傷[35]. 因此, 誘導COD晶體形成和降低晶體棱角的尖銳程度均可以減少晶體的細胞毒性, 降低腎結石發(fā)生的風險.

4 結 論

在RS不變的條件下, 隨著Ox/Ca摩爾比的增大, 細胞的損傷程度增加, 導致細胞活力降低, 細胞的溶酶體完整性和線粒體膜電位下降, ROS水平和細胞紊亂程度增加, OPN的表達和PS外翻比例增大. 正常細胞表面主要誘導形成COD晶體, 而損傷的細胞表面主要生成COM晶體. Ox/Ca摩爾比增大后, 細胞誘導生成的CaOx晶體量增加, 晶體中COM比例增大, 晶體聚集程度增大, 對細胞的毒性增大. 本文結果表明, 草酸對腎結石形成的危害遠比Ca大, 降低CaOx的過飽和度、 減小Ox/Ca摩爾比和修復受損傷細胞均有利于降低腎結石形成的風險.