侯春喜, 李逸佳, 王婷婷, 劉盛達(dá), 閆騰飛, 劉俊秋

(吉林大學(xué)超分子結(jié)構(gòu)與材料國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 化學(xué)學(xué)院, 長春 130012)

彈性肽(ELPs)是一類具有多個五肽重復(fù)單元的多肽. ELPs的一級結(jié)構(gòu)為(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)n, Xaa是除脯氨酸外的其它氨基酸. ELPs由于具有溫度響應(yīng)自組裝性質(zhì), 引起了科研人員的廣泛興趣; 并且由于具有易修飾、 組裝效率高和生物相容性好等特點(diǎn), ELPs得到了廣泛應(yīng)用[1～3]. ELPs來源于彈性蛋白, 是胞外基質(zhì)的主要組成部分. 當(dāng)溫度低于相變溫度時, ELPs以可溶形式存在, 當(dāng)溫度高于其相變溫度時, ELPs從隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu)變?yōu)棣罗D(zhuǎn)角或β螺旋結(jié)構(gòu), 通過增加疏水作用形成組裝體. 許多ELPs誘導(dǎo)策略直接利用多聚Val-Pro-Gly-Val-Gly[poly(VPGVG)]作為誘導(dǎo)基元連接親水分子, 溫度達(dá)到相變溫度時形成兩親性分子, 在水溶液中組裝成納米結(jié)構(gòu)[4～6]. 從組裝結(jié)構(gòu)可以看出, Val和Pro分別參與疏水組裝和β轉(zhuǎn)角形成, 在形成組裝體方面起到重要作用, 因而在設(shè)計和應(yīng)用ELPs時常保留這2種氨基酸. ELPs結(jié)構(gòu)對序列敏感, 如果用其它氨基酸替換重復(fù)序列中的氨基酸, 會使組裝結(jié)構(gòu)發(fā)生改變. ELPs可以被修飾, 從而顯現(xiàn)出與ELPs不同的性質(zhì). 在ELPs主鏈上引入帶電氨基酸, 離子化的ELPs在電荷被中和時會發(fā)生相變, 利用這一特點(diǎn)可以構(gòu)建pH響應(yīng)納米結(jié)構(gòu)[7]; 用精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸(RGD)等分子修飾后, ELPs可以靶向細(xì)胞; 用半胱氨酸修飾后, ELPs具有氧化還原性質(zhì); 用客體分子修飾后, ELPs具有主客體組裝能力. 因此, ELPs的組裝及調(diào)控備受關(guān)注[8～10].

1 ELPs在調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用

ELPs作為一種大分子量的多肽, 既可以采用基因工程方法合成, 也可以用肽合成法或化學(xué)法合成. 利用點(diǎn)擊化學(xué)手段, Guan等[11]以ELPs基序?yàn)榻Y(jié)構(gòu)單元進(jìn)行聚合反應(yīng), 合成了ELPs模擬物, 研究了其疏水水合作用對ELPs力學(xué)性質(zhì)的影響. 基因工程常用的方法主要有滾動循環(huán)擴(kuò)增(Rolling cycle amplification)、 同尾酶法、 單酶法和遞歸定向連接法(Recursive directional ligation). 滾動循環(huán)擴(kuò)增是近年來發(fā)展的用于擴(kuò)增多聚DNA的有效方法, 該方法以長度為26～74 nt的單鏈環(huán)狀DNA為模板, 不需要常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的升溫和降溫過程[12]. Li等[13]用同尾酶法構(gòu)建了一系列彈性蛋白, 成功用于蛋白質(zhì)折疊-解折疊研究. 如果基因兩端含有同種內(nèi)切酶序列, 可用單酶法進(jìn)行體外多聚基因的快速篩選. 遞歸定向連接法則利用Ⅱs型限制性內(nèi)切酶, 可以進(jìn)行無縫連接[14]. 這些方法在ELPs合成方面的成功應(yīng)用促進(jìn)了ELPs在超分子組裝領(lǐng)域的發(fā)展.

1.1 1D結(jié)構(gòu)

在自然界中, ELPs首先形成線形纖維, 纖維通過團(tuán)聚作用逐漸長成彈性蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu). 設(shè)計并構(gòu)筑一維(1D)彈性肽纖維是探索彈性肽材料的一個重要環(huán)節(jié). Poly(VPGVG)(富含脯氨酸, 用P表示)作為彈性肽模擬物, 由于缺少形成定向氫鍵的能力, 難以在體外組裝形成納米纖維. 天然彈性肽含有poly(VGGVG)(富含甘氨酸, 用G表示), 當(dāng)poly(VPGVG)兩端連接序列poly(VGGVG)可以得到嵌段共聚物GPG[圖1(A)和(B)], GPG首先形成納米粒, 然后在7 d內(nèi)形成串珠形狀的線形結(jié)構(gòu)[15]. 用圓二色(CD)光譜和原子力顯微鏡(AFM)進(jìn)行組裝動力學(xué)檢測發(fā)現(xiàn), 當(dāng)在溶液中加入10%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙醇后, 在15 min到48 h內(nèi), 嵌段共聚物GPG可以組裝成納米粒、 納米纖維及成熟纖維, 最后形成串珠結(jié)構(gòu)[圖1(C1～C4)]. 當(dāng)用帶正電的多肽KAAK修飾C端形成GPG2, GRGDS修飾GPG2形成GPG3后, 可以靶向整合蛋白-胞外基質(zhì). 富含G的區(qū)域互相作用形成β片層結(jié)構(gòu), 促進(jìn)了GPG3納米纖維的形成. CCK-8檢測或細(xì)胞數(shù)檢測和細(xì)胞形態(tài)分析結(jié)果表明, GPG3是最佳的細(xì)胞黏附材料或類纖維連接蛋白組織. 因此, 基于天然彈性蛋白結(jié)構(gòu), 設(shè)計并引入β片層結(jié)構(gòu), 是一種構(gòu)建ELPs納米線的有效方法.

Fig.1 Amino acid sequences of GPG1, GPG2 and GPG3(A), schematic structure of the beaded nanofibers(B) and AFM images of the assembled of GPG1(C1), GPG2(C2), GPG3(C3) and high magnification image(C4) of GPG3 nanofibers[15]Copyright 2017, Wiley-VCH.

線形ELPs的成功構(gòu)建激發(fā)了人們用超分子方法構(gòu)建多功能蛋白質(zhì)納米線或彈性蛋白模擬物的興趣. 本課題組[16]在C2對稱的谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的N末端修飾三肽Phe-Gly-Gly(FGG), 利用FGG與葫蘆脲(CB[8])的主客體作用(結(jié)合常數(shù)超過1011mol/L2, 摩爾比為2∶1)構(gòu)建了蛋白質(zhì)納米線, 并用硒酶模擬方法構(gòu)建硒酶功能化納米線, 該酶組裝體顯示出高抗氧化活性和高穩(wěn)定性. 利用CB[8]與FGG的主客體作用, 我們[17]構(gòu)建了鈣調(diào)蛋白納米線, 實(shí)現(xiàn)了金屬離子響應(yīng)的超分子組裝. 上述研究表明, 利用蛋白質(zhì)獨(dú)特的對稱性, 在超分子主-客體作用下可以制備多功能的彈性蛋白模擬物, 為彈性蛋白的生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

1.2 球形結(jié)構(gòu)

球形納米粒子的比表面積較高, 常用于修飾熒光分子、 細(xì)胞靶向分子或細(xì)胞膜穿透肽, 在藥物傳遞等方面發(fā)揮著重要作用. ELPs被廣泛用于構(gòu)建球形膠束或囊泡, 構(gòu)建這些結(jié)構(gòu)的方法包括改變客體氨基酸(氨基酸或非天然氨基酸)、 改變聚合度和嵌段共聚(AB/ABA)等方法[18]. 其中, 一個有效的方法是改變氨基酸的種類, 如引入帶電氨基酸, 使其具有pH響應(yīng)性, 或引入疏水氨基酸改變其相變溫度. Callahan等[19]設(shè)計了富含His的ELPs, 在37 ℃, pH=7.4和Zn2+存在下組裝成球形膠束, 在pH值降至6.4時解離, 與pH不敏感膠束相比, 球形ELPs納米結(jié)構(gòu)具有較好的腫瘤穿透性. 研究結(jié)果表明, ELPs納米結(jié)構(gòu)對氨基酸序列具有敏感性. Vanrell等[20]設(shè)計了poly(VPAVG), 用于構(gòu)建納米粒子, 即在不影響脯氨酸與纈氨酸之間形成氫鍵情況下, 甘氨酸被更疏水的丙氨酸代替. DSC表征結(jié)果表明, poly(VPAVG)在升溫時呈吸熱反應(yīng), 而降溫時呈放熱反應(yīng), 降溫曲線具有明顯滯后效應(yīng). 這是因?yàn)榻禍貢r, 與poly(VPGVG)相比, 水結(jié)合到酰胺鍵的量減少, 而納米粒子穩(wěn)定性與重新溶解相關(guān).

共聚是調(diào)控聚合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的有效方法[21～23]. 嵌段共聚是用來設(shè)計兩親分子的常用方法. AB型多肽具有易制備、 分子量均一和結(jié)構(gòu)易優(yōu)化等特點(diǎn), 已成功用于構(gòu)建球形膠束. 研究結(jié)果表明, ELPs在第4位氨基酸負(fù)載疏水氨基酸或帶電氨基酸后, 可形成具有不同相變溫度的囊泡. Kim等[24]設(shè)計了C4G3作為連接基團(tuán)的AB共聚物[圖2(A)和(B)], 同時在A中引入Glu避免聚集, 在B中引入Ile增加疏水性. 不同層次結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果顯示其組裝形成了球形膠束. CD光譜顯示, 在210 nm處出現(xiàn)正峰, 表明形成β轉(zhuǎn)角. 動態(tài)光散射(DLS)分析結(jié)果表明, 在10～37 ℃之間, 由于二硫鍵交聯(lián)使結(jié)構(gòu)大小穩(wěn)定在25 nm. 透射電子顯微鏡(TEM)、 核磁共振波譜(1H NMR)和AFM分析結(jié)果表明, 共聚物組裝形成了膠束[圖2(C)和(D)], 與DLS分析結(jié)果一致. 該策略可用于設(shè)計制備刺激響應(yīng)性膠束, 或構(gòu)建藥物傳遞系統(tǒng), 在還原性硫醇分子存在時實(shí)現(xiàn)可控釋放.

Fig.2 Complete amino acid sequence of elastin diblock polypeptides(A, B), variable-temperature 1H NMR spectra(C) and AFM image of amphiphilic micelle fomation(D)[24]Copyright 2010, Wiley-VCH.

1.3 樹枝狀結(jié)構(gòu)

樹枝狀分子具有明確的大小、 結(jié)構(gòu)和大量處于分子末端的功能基團(tuán). 這些基團(tuán)可被VPGVG共價修飾, 使末端暴露出幾十至數(shù)百個VPGVG, 從而形成樹枝狀的ELPs模擬物. Tanaka等[25]以HATU/HOAt為縮合試劑, 將VPGVG和(VPGVG)2交聯(lián)到樹枝狀分子G3, G4和G5上. 圓二色光譜分析顯示, 在218 nm處出現(xiàn)β轉(zhuǎn)角峰. 在濁度實(shí)驗(yàn)中, 大量VPGVG共價結(jié)合在樹枝狀分子或者納米粒子多個末端時, 具有poly(VPGVG)的相變性質(zhì)[圖3(A～C)], 因此該聚合物是一種彈性肽模擬物.

Fig.3 Synthetic pathway of elastin-mimetic dendrimers with two repeats of peptide(A), DSC analysis of elastin-mimetic dendrimers, normalized to dendrimer molar(B) and peptide unit mole(C)[25]Copyright 2013, Wiley-VCH.

1.4 柱狀結(jié)構(gòu)

ELPs納米結(jié)構(gòu)具有序列敏感性, 即ELPs納米結(jié)構(gòu)不僅受一級結(jié)構(gòu)影響, 而且受氨基酸相互作用的影響. 球形結(jié)構(gòu)的構(gòu)建激發(fā)了學(xué)者構(gòu)建更加復(fù)雜納米結(jié)構(gòu)的興趣. McDaniel等[26]將(XGG)8(X為疏水氨基酸)引入到ELPs的C末端. A160-(YGG)8不能組裝成任何結(jié)構(gòu), 但通過移除甘氨酸部分增強(qiáng)其疏水性后, A160-(YG)8能夠組裝成水動力學(xué)半徑為71 nm的納米粒子, 甚至在pH=12時也保持很好的組裝能力, 而此時離子化的Tyr比中性的Tyr親水性提高了10倍. 盡管A160-(YG)8和A160-(Y)8均可組裝成柱狀膠束, 但A160-(YG)8具有更高的長寬比(圖4), 因此它們的組裝結(jié)構(gòu)不同.

Fig.4 TEM images(A—F) of genetically encoded asymmetric amphiphiles and highly asymmetric polypeptide amphiphiles into cylindrical micelles(G)[26](A) A160-(YGG)8; (B) A160-(YG)8; (C) A160-Y8; (D) A160-(FGG)8; (E) A80-(FGG)8; (F) A40-(FGG)8.Copyright 2014, Wiley-VCH.

1.5 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

Sun等[27]用ELPs作為可溶性連接分子, 連接RGD和貽貝足蛋白的酪氨酸富含區(qū)(黏附蛋白, 重復(fù)單元為5～7個氨基酸). 在酪氨酸酶調(diào)節(jié)氧化反應(yīng)中, 酪氨酸轉(zhuǎn)化為DOPA和多巴醌, 從而促進(jìn)交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和凝膠(圖5). 這些凝膠表現(xiàn)出序列依賴性的力學(xué)性質(zhì). 細(xì)胞包覆和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 它們可以作為生物相容性材料用作細(xì)胞生長模板.

Fig.5 Formation of adhesive hydrogels enabled by enzymatically oxidized peptide motifs originated from Mfp’s(A) and frequency sweep tests on oxidized product(B)[27]Copyright 2019, Royal Society of Chemistry.

2 ELPs在生物功能方面的應(yīng)用

ELPs及其組裝體在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)方面應(yīng)用廣泛. 在醫(yī)學(xué)方面, 由于彈性蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分, Lee等[28～30]將溫度響應(yīng)的ELPs與整合素靶向的RGD連接, 進(jìn)而利用溫度刺激包覆胰島, 發(fā)現(xiàn)可以重構(gòu)損傷基質(zhì)并提供胰島周質(zhì)環(huán)境, 保護(hù)其免于免疫排斥. 此外, ELPs本身也具有一定的生物學(xué)活性, 利用ELPs與細(xì)胞表面彈性蛋白受體復(fù)合物的作用, 可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖; 或利用其與細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖的作用, 誘導(dǎo)金屬蛋白酶在成纖維細(xì)胞中表達(dá)[31].

2.1 ELPs誘導(dǎo)蛋白質(zhì)組裝

蛋白質(zhì)組裝體是同源或異源蛋白質(zhì)形成的有序結(jié)構(gòu), 其有序性是發(fā)揮生物功能的基礎(chǔ). 病毒、 微管和鐵蛋白等高級有序蛋白質(zhì)組裝體在侵染、 維持結(jié)構(gòu)和體內(nèi)鐵平衡方面具有重要作用. 目前, 構(gòu)建蛋白質(zhì)組裝體是一個重要的研究方向. 利用主-客體作用、 金屬配位作用和親疏水作用, 已成功構(gòu)建出具有光俘獲、 催化和輔助蛋白質(zhì)折疊功能的蛋白質(zhì)組裝體. ELPs作為疏水域可用于誘導(dǎo)肽、 聚合物和樹枝狀分子等組裝, 證明ELPs是一個有效的誘導(dǎo)基元. 因此, 近年來ELPs被用于誘導(dǎo)蛋白質(zhì)組裝, 這些組裝體不僅可以保持蛋白質(zhì)的活性, 而且可以利用ELPs的刺激響應(yīng)性實(shí)現(xiàn)藥物傳遞. Champion等[32]設(shè)計了球-拉鏈-彈性肽(globule-zipper-ELPs)系統(tǒng), 并提出了理論模型予以解釋(圖6). 通過相反電荷的拉鏈的二聚作用, 連接mCherry到ELPs上, 該球-拉鏈-彈性肽與彈性肽共組裝獲得了囊泡. Jang等[33]進(jìn)一步研究了mCherry-ZE/ZR-ELPs組裝成囊泡的詳細(xì)參數(shù). 動力學(xué)研究表明, mCherry-ZE/ZR-ELPs形成了團(tuán)聚體、 單層囊泡和雙層囊泡3種類型結(jié)構(gòu). 當(dāng)溫度達(dá)到相變溫度時, 首先形成單層囊泡, 進(jìn)一步加熱促進(jìn)ELPs分子間作用, 形成雙層囊泡結(jié)構(gòu), 表明溫度差ΔT(T0-Tt)決定囊泡結(jié)構(gòu).

Fig.6 ELPs induced protein assembly into vesicle(A), theoretical model of molecular packing(B) and confocal micrographs of vesicles including mCherry-ZE and ZR-ELP(C1), EGFP-ZE and ZR-ELP(C2), mCherry-ZE, EGFP-ZE and ZR-ELP(C3)[32]Insets of (C1) and(C2): close-up images. Insets of(C3): close-up image and fluorescence intensity profile corresponding to the inset image.Copyright 2014, American Chemical Society.

鹽濃度的作用可以用堆積參數(shù)(P)表示, 可用公式P=V/(a0lc)進(jìn)行計算(V為疏水基元ELP的體積,a0為親水頭部的平均面積,lc為臨界長度[32]).a0可表示為a0=(1-χ)a1/2+χa2,χ為mCherry-ZE(或EGFP-ZE)與ZR-ELP的比值,a1和a2分別為ZR/ZR和mCherry(EGFP)-ZE/ZR的頭部面積[圖6(B)]. 由于球形的蛋白質(zhì)與卷曲螺旋形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu),a0的大小不受鹽離子濃度影響. 增加鹽離子濃度可促進(jìn)ELP發(fā)生相變, 導(dǎo)致堆積參數(shù)V和P均降低. 因此, 高于臨界鹽濃度時形成囊泡, 此時參數(shù)P的范圍為1/2a1, 而對于EGFP-ZE囊泡,a2

Hassouneh等[34]將ELPs嵌段共聚物(ELPBC)與硫氧還蛋白或纖維連接蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域連接, 發(fā)現(xiàn)其不僅保留了ELPBC的球形組裝能力, 還保留了Ⅲ型纖維連接蛋白靶向過表達(dá)αvβ3整合素細(xì)胞的能力. Mills等[35]發(fā)現(xiàn), 當(dāng)ELPs引入部分負(fù)電氨基酸時, SAXS表征結(jié)果顯示ELPs-mCherry的組裝能力顯著降低.

2.2 光響應(yīng)性彈性肽

光響應(yīng)分子在光照下可發(fā)生構(gòu)象變化或化學(xué)反應(yīng). 由于光照是一種非破壞非添加的刺激方式, 因此, 光控被視為一種綠色的超分子誘導(dǎo)方法. 偶氮苯是超分子領(lǐng)域常用的光響應(yīng)分子, Wu等[36]將其引入交替的兩親共聚物(EG4-a-NAzoOME)中, 形成了光響應(yīng)性膠束結(jié)構(gòu), 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明偶氮苯在聚合物中表現(xiàn)出良好的光響應(yīng)能力. 由于偶氮苯與α-環(huán)糊精有較好的復(fù)合能力, 在超分子研究中備受關(guān)注. Cabello等[37,38]將偶氮苯引入ELPs中, 在加入α-環(huán)糊精后, 偶氮苯的非極性側(cè)鏈進(jìn)入α-環(huán)糊精空腔, 使α-環(huán)糊精的極性表面暴漏, 因而導(dǎo)致ELPs相變溫度增加, 而α-環(huán)糊精的存在不阻礙偶氮苯的順反異構(gòu)變化(圖7).

Fig.7 Proposed interaction between azobenzene pendant group and α-CD(A)[37], photochemical reaction of spiropyran derivative(B), temperature profiles under distinctive illuminations(C) and photomodulation of phase separation by UV-sunlight(D1) or by darkness-sunlight(D2)[38](A) Copyright 2002, Wiley-VCH; (B)—(D) Copyright 2000, American Chemical Society.

2.3 ELPs應(yīng)用于脂類的組裝

磷脂是細(xì)胞膜的主要成分, 脂類分子的組裝備受關(guān)注. 為了促進(jìn)脂類分子組裝, Luginbuhl等[39]、 Meins等[40]和Liu等[41]利用翻譯后修飾方法將脂鏈連接到ELPs上[圖8(B)和(C)]. 在pETDuet共表達(dá)系統(tǒng)中, 當(dāng)肉豆蔻酰轉(zhuǎn)移酶(NMT)、 外源肉豆蔻酸和ELPs存在時, 通過催化甘氨酸的氨基與肉豆蔻酰-輔酶A的活化硫酯反應(yīng), 產(chǎn)生脂-彈性肽(lipid-ELPs)組裝基元. 由于脂肪鏈的引入增加了ELPs的疏水性, 使M-ELPs的相變溫度比ELPs降低了20 ℃. 疏水頭部誘導(dǎo)lipid-ELPs組裝形成不同結(jié)構(gòu). 研究結(jié)果表明, lipid-ELPs具有較高的DOX負(fù)載率, 在4T1腫瘤細(xì)胞中的生命周期與積累均高于游離的DOX. 該研究提供了一種構(gòu)建脂類組裝體系的有效方法, 并在細(xì)胞成像和藥物傳遞等方面顯示出良好的應(yīng)用前景.

Fig.8 Characterization of phase transition for ELP90A,120 with and without NMT(A), a bicistronic vector used to coexpress two genes(B), fatty-acid-modified elastin-like peptides(C)[42] and TEM images of of M-B1-ELP(D1), M-B2-ELP(D2) and M-B3-ELP(D3) above Tt[39]Insets of (D2) and (D3): higher-magnification images from the super-resolution mode of the microscope.(A) Copyright 2018, Macmillan Publishers Limited; (B—D) Copyright 2017, Wiley-VCH.

Mozhdehi等[42]利用同樣的技術(shù), 在脂肪鏈與ELPs之間引入β-片層肽基序(M-B-ELPs), 形成刺激響應(yīng)材料[圖8(C)和(D)]. 研究結(jié)果表明, 與單獨(dú)的ELPs相比, 相變溫度降低了15 ℃, 這是由于通過肉豆蔻酰化引入脂肪鏈?zhǔn)沟肊LPs疏水性增加, 同時N末端氨基的移除也有一定貢獻(xiàn). 熒光檢測結(jié)果顯示, 在β-片層加入硫磺素探針后, 當(dāng)?shù)陀谙嘧儨囟葧r, M-B3-ELPs比M-B1-ELPs顯示出更強(qiáng)的熒光, 這是由于B3形成β-片層的能力更強(qiáng). 由TEM照片可以看出, M-B3-ELPs在相變溫度下組裝成線形串珠結(jié)構(gòu), 超過相變溫度后, 由于ELPs去溶劑化產(chǎn)生聚集, 進(jìn)一步組裝成分形結(jié)構(gòu).

如果ELPs與疏水藥物分子共價連接, Lipid-ELPs有望應(yīng)用于癌癥靶向治療. McDaniel等[43]根據(jù)組成和序列, 提出了預(yù)測ELPs的Tt的有效模型, 使含阿霉素的ELPs相變溫度處在39～42 ℃之間, 研究發(fā)現(xiàn), 適當(dāng)升溫可以顯著提升DOX-ELPs納米粒子靶向腫瘤的能力并增加在腫瘤內(nèi)的積累. 與共價連接相比, 包覆等方式更有利于藥物釋放. Choi等[44]合成了Lipid-ELPs, 用于包覆作為藥物模型的熒光素, 證明該體系增加了控制釋放能力. 以上研究表明, 通過控制相變溫度, 負(fù)載藥物的ELPs有望成為生物相容且高效的藥物傳遞系統(tǒng).

2.4 ELPs應(yīng)用于小肽組裝

由于具有形成納米管(FF苯丙二肽)、β-片層(FKFEFKFE)和三螺旋束(CLP)的能力, 小肽或寡肽組裝引起了研究人員的廣泛興趣. 在許多ELPs組裝系統(tǒng)中, 當(dāng)重復(fù)數(shù)n或聚合度達(dá)到幾十或幾百時, 才能獲得足夠的兩親性而組裝[45～47]. 如何降低重復(fù)數(shù)n并促進(jìn)ELPs組裝是近年來的研究熱點(diǎn)之一. 研究表明, 短肽自組裝能夠形成多聚體, 從而在局部促進(jìn)ELPs組裝. Qin等[49]構(gòu)建了智能的組裝基元, 通過點(diǎn)擊反應(yīng)將(VPGFG)5交聯(lián)到膠原蛋白CLP上(圖9), 得到了具有低相變溫度的ELPs-CLP. TEM表征結(jié)果表明, 在室溫下ELPs-CLP可組裝成80～100 nm納米粒子. 這是由于CLP可以形成三螺旋結(jié)構(gòu), 在低溫時能使3個ELPs聚集在一起. 在高溫時, 解折疊的ELPs-CLP具有高相變溫度, 這是因?yàn)榻庹郫BCLP作為親水域加入到ELPs可以提高ELPs的相變溫度. 因此, 小肽組裝是調(diào)節(jié)ELPs組裝的一種有效方法, 通過改變ELPs序列可以得到更豐富的結(jié)構(gòu). 當(dāng)將(GPO)8引入到含有GFOGER序列的ELPs中時[49], ELPs-CLP(FWWF, FWWW和WWWW)可以組裝成不同類型的納米片層[50,51]. 進(jìn)一步研究表明, 納米片由2層ELP-CLP分子組裝而成, 其中ELPs呈現(xiàn)塌陷結(jié)構(gòu), 而CLP呈現(xiàn)三螺旋結(jié)構(gòu), 且這些具有不同轉(zhuǎn)角的組裝結(jié)構(gòu)具有序列依賴性.

Fig.9 Chemical conjugation of ELPs and CLP(A)[48] and TEM images of various ELPs-CLPconjugates(B) and theoretical model(C)[49] Copyright 2004, Elsevier.

2.5 ELPs應(yīng)用于水凝膠構(gòu)筑

水凝膠被普遍應(yīng)用于藥物傳遞、 組織工程和診斷治療方面. 與合成水凝膠相比, 生物水凝膠具有良好的生物相容性和生物可降解性等優(yōu)勢. 通過合理設(shè)計, 可利用基因重組法或化學(xué)方法合成ELPs, 使其具有合適的細(xì)胞靶向能力, 有望應(yīng)用于癌癥治療方面[52,53]. Kaufmann等[54]設(shè)計了基于(EMM)7-(VPGXG)42(X代表K, E, V或I)的水凝膠, 并利用賴氨酸側(cè)鏈交聯(lián)RGD配體用于細(xì)胞黏附(圖10). 如果交聯(lián)后修飾RGD, FGRGDS修飾的凝膠不顯示任何細(xì)胞黏附[54～57]. 這是由于配基的空間位阻和非均相反應(yīng)導(dǎo)致了RGD交聯(lián)效率較低. 如果ELPs交聯(lián)前修飾RGD, 則顯示出較好的細(xì)胞黏附行為. 重要的是, 具有環(huán)狀RGD配基和己酸作為連接基團(tuán)的ELPs水凝膠{(EMM)7-Ahx-c-[RGDFK]}顯示出100%的細(xì)胞黏附能力, 明顯高于線狀RGD的ELPs水凝膠.

Fig.10 Schematic of the two ways to RGD-modified elastin-like hydrogels[54] Copyright 2008, Wiley-VCH.

3 結(jié)論與展望

由于在誘導(dǎo)超分子組裝方面具有的顯著優(yōu)勢, ELPs誘導(dǎo)法已成為構(gòu)建結(jié)構(gòu)復(fù)雜、 功能靈活多變超分子結(jié)構(gòu)的一種有效手段. 通過改變客體氨基酸、 引入疏水鏈或化學(xué)修飾等方法, ELPs不僅可用于組裝線形、 片層、 球形和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu), 而且可用于制備光響應(yīng)系統(tǒng)、 蛋白質(zhì)組裝體和水凝膠體系. 研究結(jié)果表明, ELPs納米結(jié)構(gòu)具有序列敏感性, 即氨基酸序列和聚合度對相變溫度有很大影響, 同時, 蛋白質(zhì)濃度、 鹽離子種類和濃度等也起一定作用. 因此, 通過合理設(shè)計, 有望進(jìn)一步豐富基于ELPs的超分子組裝體的結(jié)構(gòu)和種類.

盡管如此, ELPs應(yīng)用于在超分子組裝領(lǐng)域仍面臨許多問題. 首先, 低聚合度的ELPs難以進(jìn)行超分子組裝, 主要原因是其相變溫度較高; 其次, 線形組裝體仍難以構(gòu)建, 目前體外線形組裝體組裝時間較長, 而線形組裝體是天然彈性蛋白網(wǎng)絡(luò)形成的中間體; 第三, 光響應(yīng)組裝體動力學(xué)研究較少, 人們對光照循環(huán)過程中ELPs納米結(jié)構(gòu)變化的認(rèn)識有限. 此外, 盡管已經(jīng)有研究報道稱, 根據(jù)ELPs的組成和分子量可以定量預(yù)測ELPs的相變溫度, 但仍然缺乏pH值響應(yīng)ELPs的相變溫度的預(yù)測研究. 將來, ELPs的超分子組裝體納米結(jié)構(gòu)和組裝動力學(xué)有望更加可控, 這些ELPs組裝體有望保持高效組裝和高穩(wěn)定性, 并進(jìn)一步應(yīng)用在細(xì)胞成像、 藥物傳遞、 生物技術(shù)和組織工程等領(lǐng)域.