陸錦遙，王瓊，王優(yōu)杰，谷穎敏，章鑫，謝家駿，張小利，田雪松*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新中藥研究院，上海 201203；2.上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，上海 201401)

熊膽是傳統(tǒng)名貴中藥，熊膽粉為熊科動(dòng)物黑熊(Selenaretos thibetanus Cuvier)經(jīng)膽囊手術(shù)引流膽汁而得的干燥品，具有清熱、平肝、明目等功效，用于治療驚風(fēng)抽搐，目赤腫痛，咽喉腫痛[1-3]。限于天然熊膽粉來源的特殊性和稀缺性，其相關(guān)中藥制劑的開發(fā)和使用受到了嚴(yán)重阻礙，因此通過合成或生物技術(shù)的手段尋找安全有效的熊膽粉替代品迫在眉睫[4-5]。上海中醫(yī)藥大學(xué)、上海凱寶藥業(yè)股份有限公司及重慶大學(xué)協(xié)作建立了熊膽粉體外培育生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，將家禽雞膽粉體外轉(zhuǎn)化為熊膽粉，以期替代天然熊膽粉應(yīng)用于臨床。為進(jìn)一步探究基于該技術(shù)生產(chǎn)的體外培育熊膽粉的安全性，本實(shí)驗(yàn)按照《中藥、天然藥物一般藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》對其進(jìn)行一般藥理學(xué)研究，觀察其對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，為臨床應(yīng)用提供安全性評價(jià)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并為進(jìn)一步研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 ICR小鼠160 只，雌雄各半，體質(zhì)量16～18 g，SPF 級，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號:SCXK (滬) 2013-0016。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級動(dòng)物房，環(huán)境溫度23～24 ℃，相對濕度42%～63%，換氣次數(shù)≥15次/h。人工控制照明，晝夜交替時(shí)間為12 h/12 h。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。

1.1.2 藥物與試劑 體外培育熊膽粉(上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，黃色至深棕色碎片、顆粒或粉末，含量：?；切苋パ跄懰?1.1%，牛磺鵝去氧膽酸13.3%，批號：20160801)，臨用時(shí)，0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解配置成所需濃度的溶液；地西泮(上海信誼藥廠有限公司，規(guī)格：2.5 mg/片，批號：1416030)。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，微黃色纖維狀粉末，批號：20150421)，用前配制成0.5% (W/V)溶液。戊巴比妥鈉(德國進(jìn)口分裝，白色粉末，純度：≥98%，批號：WS20141110)。上述藥品均密封，避光，置陰涼干燥處保存。

1.1.3 主要儀器 ME203型電子天平(儀器編號：20131673，梅特勒-托利多有限公司)；YLS-1A多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀(儀器編號：20020620、20061560，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠一般行為和自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn) 取檢疫合格的小鼠60 只，按給藥前自發(fā)活動(dòng)數(shù)隨機(jī)分為5 組，每組12只，雌雄各半，分別為溶劑對照組、體外培育熊膽粉低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組。低、中、高劑量組分別灌胃體外培育熊膽粉為0.8、2.5、8.0 g·kg-1；陽性對照組灌胃地西泮2.0 mg·kg-1；溶劑對照組灌胃等容量20 mL·kg-1的0.5% CMC-Na溶液。給藥前各組禁食3～5 h，觀察給藥后2.5 h內(nèi)的一般行為變化(姿態(tài)、步態(tài)、流涎、流汗、肌顫及瞳孔變化等)。多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀記錄給藥前及給藥后30、60、90、120及150 min小鼠的自發(fā)活動(dòng)次數(shù)。每次記錄前先將小鼠置于自主活動(dòng)儀中適應(yīng)3 min，記錄5 min 內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)次數(shù)。

1.2.2 小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn) 給藥前兩天，每天用一根表面光滑、垂直豎立的金屬棒(直徑為1.5 cm，長度80.0 cm)，訓(xùn)練小鼠爬竿，每天3次。給藥當(dāng)天，按協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)障礙評級標(biāo)準(zhǔn)(見表1)，挑取檢疫合格且評分0.0級小鼠50 只，體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組，每組10只，雌雄各半，分別為溶劑對照組、體外培育熊膽粉低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組(除給予陽性對照組地西泮3.0 mg·kg-1外，其他給藥方法與劑量同自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn))。給藥前各組禁食3～5 h，分別于給藥前及給藥后30、60、90、120及150 min將小鼠頭朝下放在棒的頂端，任小鼠自然向下爬行，以測定協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)情況。

表1 協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)障礙評級標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 閾下睡眠劑量戊巴比妥鈉協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)[6]取檢疫合格的小鼠50 只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組，每組10只，雌雄各半，分別為溶劑對照組、體外培育熊膽粉低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組(給藥方法與劑量同小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn))。給藥前各組禁食3～5 h，給予溶劑及體外培育熊膽粉后60 min(陽性對照組灌胃3.0 mg·kg-1地西泮后30 min)，小鼠腹腔立即注射戊巴比妥鈉30 mg·kg-1，以翻正反射消失達(dá)1 min以上者計(jì)為發(fā)生睡眠，計(jì)算各組睡眠發(fā)生百分率。

2 結(jié)果

2.1 體外培育熊膽粉對小鼠一般行為和自發(fā)活動(dòng)的影響 各劑量組的體外培育熊膽粉對小鼠姿態(tài)、步態(tài)、流涎、流汗、肌顫及瞳孔變化等一般行為無明顯影響。在自發(fā)活動(dòng)方面，低劑量、高劑量組與溶劑對照組在各時(shí)間點(diǎn)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中劑量組給藥后60 min自發(fā)活動(dòng)減少，與溶劑對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陽性對照組給藥后各時(shí)間點(diǎn)小鼠活動(dòng)均減少，與溶劑對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，結(jié)果見表2。

表2 體外培育熊膽粉對小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

注：與溶劑對照組比較，*P<0.05，**P<0.001

2.2 體外培育熊膽粉對小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)的影響 各劑量組給藥后各時(shí)間點(diǎn)與溶劑對照組相比，無顯著性差異(P>0.05)。與溶劑對照組比較，陽性對照組小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)障礙的評級明顯升高，在給藥后各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，結(jié)果見表3。

表3 體外培育熊膽粉對小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)的影響(n=10)

注：與溶劑對照組比較，**P<0.001

2.3 體外培育熊膽粉對閾下睡眠劑量戊巴比妥鈉協(xié)同作用的影響 溶劑對照組(無小鼠睡眠)、低劑量(無小鼠睡眠)、中劑量[10只小鼠1只(雌性)睡眠]、高劑量[10只小鼠1只(雄性)睡眠]，睡眠發(fā)生的百分率與溶劑對照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給予陽性對照品30 min時(shí)，腹腔注射閾下睡眠劑量的戊巴比妥鈉，小鼠全部睡眠(5雌性,5雄性)，睡眠發(fā)生的百分率與溶劑對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，結(jié)果見表4。

表4 體外培育熊膽粉與閾下睡眠劑量的戊巴比妥鈉協(xié)同作用對小鼠睡眠的影響(n=10)

注：與溶劑對照組比較，**P<0.001

3 討論

體外培育熊膽粉擬臨床用于替代天然熊膽粉，但是其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響尚未進(jìn)行研究，其臨床安全性及潛在受累器官均不清楚。前期實(shí)驗(yàn)顯示，體外培育熊膽粉大鼠藥效學(xué)有效劑量為0.3 mg·kg-1，按照安全藥理學(xué)試驗(yàn)的劑量設(shè)定原則“應(yīng)包括或超過主要藥效學(xué)的有效劑量或治療范圍”，故本次實(shí)驗(yàn)低劑量設(shè)定為0.8 g·kg-1，中、高劑量分別按等比設(shè)定為2.5和8.0 g·kg-1[7]。此外文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠灌胃熊膽粉提取物后，熊去氧膽酸Tmax為(55.0±7.7)min，t1/2為(97.5±17.7)min，鵝去氧膽酸Tmax為(52.5±8.2)min，t1/2為(113.8±21.5)min。故本次實(shí)驗(yàn)記錄給藥后30、60、90、120及150 min，涵蓋了體外培育熊膽粉主要組分的Tmax及t1/2[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各劑量組的體外培育熊膽粉對小鼠一般行為無明顯影響，但在自發(fā)活動(dòng)方面，低、高劑量組與溶劑對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中劑量組在給藥后60 min自發(fā)活動(dòng)減少，其余各時(shí)間點(diǎn)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因該時(shí)間點(diǎn)一般行為無明顯改變，協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)亦差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且高劑量組無類似改變，故認(rèn)為此變化與藥物毒性作用無關(guān)；陽性對照組給藥后各時(shí)間點(diǎn)自發(fā)活動(dòng)均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，低、中及高劑量的體外培育熊膽粉在各時(shí)間點(diǎn)對小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)無明顯影響，陽性對照組與溶劑對照組相比在各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在閾下睡眠劑量戊巴比妥鈉實(shí)驗(yàn)，低劑量組無睡眠出現(xiàn)，中、高劑

量組各有1只睡眠，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；陽性對照組則全部睡眠，與溶劑對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明具有協(xié)同作用。

綜合考慮認(rèn)為，小鼠灌胃設(shè)計(jì)劑量的體外培育熊膽粉對中樞神經(jīng)系統(tǒng)無明顯影響。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步補(bǔ)充和完善了體外培育熊膽粉安全性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為其在臨床上的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。