來元亮

（上海奧尚生物科技有限公司，上海 200090）

細(xì)胞培養(yǎng)在整個(gè)生物技術(shù)工程中是一個(gè)必不可少的步驟，也是最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)。旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的出現(xiàn)使得細(xì)胞的培養(yǎng)過程更加順利，效果也更符合人們的需求。本文分析細(xì)胞培養(yǎng)裝置的現(xiàn)狀，闡述旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的概念，并介紹這一系統(tǒng)的作用原理、優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用。

1 細(xì)胞培養(yǎng)裝置研究現(xiàn)狀

雖然在目前已掌握的微生物技術(shù)中，工業(yè)培養(yǎng)微生物的技術(shù)已經(jīng)發(fā)展得比較完善，但是這種微生物技術(shù)主要還是用于培養(yǎng)一些細(xì)菌以及藻類的蛋白質(zhì)細(xì)胞。這類細(xì)胞的外層有牢固的細(xì)胞壁，生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)條件比較簡單，屬于容易培養(yǎng)的一類細(xì)胞。哺乳類動(dòng)物細(xì)胞所需要的營養(yǎng)物質(zhì)條件要求高，細(xì)胞大且脆弱，還不能進(jìn)行游離生活，大多數(shù)要直接附著在某種哺乳類生物的細(xì)胞表面才能繼續(xù)生長[1]。所以，就目前的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)而言，大量培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞是一個(gè)艱巨的任務(wù)。初期，研究人員通過微珠轉(zhuǎn)瓶等方法來直接培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，但是只能少量培養(yǎng)成功[2-3]。此后有研究者利用一種高密度的微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來直接培養(yǎng)更多的哺乳類細(xì)胞，利用微珠作為一種載體，使細(xì)胞直接生長在其表面。這種用微珠來培養(yǎng)細(xì)胞的方法一定程度上提高了哺乳類細(xì)胞的培養(yǎng)量[4-6]。但是隨著哺乳類細(xì)胞的生長發(fā)育，細(xì)胞周圍有利營養(yǎng)物質(zhì)會(huì)逐漸減少，而排泄的垃圾和有害物質(zhì)會(huì)逐漸增多。為了使生長的哺乳類細(xì)胞不斷接觸到有利的物質(zhì)條件，通過分散和懸浮微珠，不斷供給有利的物質(zhì)條件并排出廢液，以此來培養(yǎng)更多的細(xì)胞[7-8]。旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的出現(xiàn)，使細(xì)胞培養(yǎng)的成活率逐漸升高，效率加快，已成為目前世界上最為理想的細(xì)胞培養(yǎng)裝置[9-10]。

2 旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)簡介

旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)（The Rotary Cell Culture System，RCCS）可以有效培養(yǎng)貼壁和懸浮的三維細(xì)胞，是目前已知世界上最為理想的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。這一系統(tǒng)最先出現(xiàn)在美國約翰遜航天中心，發(fā)明者最初的設(shè)計(jì)目的是為了保護(hù)在美國宇航局中進(jìn)行纖細(xì)的組織培養(yǎng)。這種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能夠用來培養(yǎng)其他不能輕易進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的三維細(xì)胞和各種高密度的三維細(xì)胞。低剪切力、高化學(xué)物質(zhì)能量傳遞效率以及微重力的獨(dú)特培養(yǎng)環(huán)境是RCCS容器的獨(dú)特培養(yǎng)特點(diǎn)，這種特點(diǎn)也使得研究者能夠在普通的實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)出三維的細(xì)胞組織。

目前已知有2種基本的RCCS細(xì)胞培養(yǎng)容器[11]：第一種是長圓柱形容器（STLV）（圖1），容器呈管狀，中央的氣體交換膜芯是為了培養(yǎng)貼壁細(xì)胞而設(shè)計(jì)的；第二種是高精度截面縱橫比細(xì)胞培養(yǎng)容器（HARV）（圖2），這是一種盤狀懸浮細(xì)胞培養(yǎng)容器，其內(nèi)壁主要由氧交換細(xì)胞膜組成，是為了方便培養(yǎng)懸浮細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。

圖1 長圓柱形RCCS細(xì)胞培養(yǎng)容器（STLV）

圖2 高精度截面縱橫比細(xì)胞培養(yǎng)容器（HARV）

3 RCCS的工作原理

旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)主要由同軸旋轉(zhuǎn)的氧化器和細(xì)胞培養(yǎng)皿組成。系統(tǒng)工作時(shí)，培養(yǎng)皿內(nèi)部已經(jīng)充滿了大量培養(yǎng)基，且這些培養(yǎng)基可以像固體一樣緊緊圍著水平軸進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)。在這一過程中，培養(yǎng)基均以相同的角速度轉(zhuǎn)動(dòng)，使得培養(yǎng)皿內(nèi)產(chǎn)生層流并具有最小的剪切力；培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞由離心力、重力以及科式力共同作用而變成懸浮狀態(tài)。所以在RCCS培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞不僅受到最小的機(jī)械外力，還能夠得到最充足的營養(yǎng)以及氧氣等必備物質(zhì)，因此而聚集形成了類組織聚合物。在旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，懸浮的細(xì)胞可以產(chǎn)生一個(gè)液體懸浮軌道；而隨著細(xì)胞的不斷生長，研究者可以隨意調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)速度，以此來抵償沉降速率[12]。

4 RCCS的優(yōu)勢(shì)

在RCCS的液體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中的各種液體培養(yǎng)物質(zhì)都隨著RCCS容器在電機(jī)驅(qū)動(dòng)作用下沿細(xì)胞的水平軸方向旋轉(zhuǎn)[13]。在細(xì)胞的水平軸內(nèi)，細(xì)胞顆?？梢院苋菀椎亟⑵鹨粋€(gè)細(xì)胞懸浮軌道，使得細(xì)胞培養(yǎng)基以及細(xì)胞顆粒都會(huì)隨著培養(yǎng)系統(tǒng)一起旋轉(zhuǎn)，而這些細(xì)胞顆粒又不會(huì)與培養(yǎng)容器壁或其他生物體相互接觸或碰撞；加上培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)部沒有其他外力，使得細(xì)胞或者組織在生長過程中受到的破壞性影響降至最低。在此培養(yǎng)系統(tǒng)中，通過氣體交換器，細(xì)胞或者組織的氣泡能夠直接吸入大量氧氣并排出二氧化碳[14]。另外，由于RCCS培養(yǎng)器有很好的物質(zhì)交換功能，因此細(xì)胞能夠在RCCS中以很高的密度生長，細(xì)胞組織的生物體培養(yǎng)細(xì)胞密度大約為107～1011個(gè)細(xì)胞/mL；其細(xì)胞的培養(yǎng)密度大約為107。所以到目前為止，幾乎所有的生物體細(xì)胞組織都已經(jīng)能夠通過RCCS培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)。具體分析，RCCS培養(yǎng)器主要有以下4方面優(yōu)勢(shì)：

（1）利用RCCS培養(yǎng)器培養(yǎng)細(xì)胞能夠?yàn)榧?xì)胞提供良好理想的環(huán)境，與動(dòng)態(tài)和靜態(tài)組織培養(yǎng)環(huán)境相比，更加接近體內(nèi)的生長環(huán)境，能夠允許細(xì)胞聚焦、三位分化以及生長。

（2）在利用動(dòng)態(tài)的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，由于懸浮的作用，細(xì)胞組織會(huì)與推進(jìn)器接觸，從而使其受到損傷；在處于靜態(tài)的培養(yǎng)裝置中，二維的環(huán)境可能會(huì)改變基因的表達(dá)和組織細(xì)胞的分化，因此這兩種均不是理想的培養(yǎng)系統(tǒng)。而與這兩種培養(yǎng)系統(tǒng)的功能相比，RCCS培養(yǎng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能較為理想。一些細(xì)胞或者組織在RCCS培養(yǎng)器中，會(huì)因?yàn)殡S機(jī)變化的重力矢量而懸浮，從而使組織在整個(gè)培養(yǎng)液中處于自由落下的隨機(jī)生長狀態(tài)[15-16]。組織在培養(yǎng)液中自由地落下、翻滾并相互混合，不會(huì)受到任何一個(gè)細(xì)胞生長方向的單個(gè)細(xì)胞重力矢量的相互影響，因此可以向各個(gè)細(xì)胞生長方向自由地生長[17]。這是目前RCCS培養(yǎng)系統(tǒng)所表現(xiàn)出來的不同于其他兩種培養(yǎng)系統(tǒng)的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，也是這種培養(yǎng)系統(tǒng)能夠成為最為理想的培養(yǎng)裝置的一個(gè)重要原因。

（3）在旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，沒有推進(jìn)器、空氣升液器等外力因素，使得細(xì)胞受到的破壞力減至最小。細(xì)胞都維持在一個(gè)較為適合生長的軌道中，因此能夠共同生長，從而形成一種三維式結(jié)構(gòu)。

（4）旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是目前世界上唯一一種能使研究者進(jìn)行共同培養(yǎng)的系統(tǒng)。這種培養(yǎng)方法能夠使高細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞死亡率，并增加細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。

如表1所示，為旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)與其他培養(yǎng)方式的對(duì)比[18]。

5 RCCS的特點(diǎn)

5.1 高分化度

旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)使得高分化的人體組織能夠在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)，從而培養(yǎng)出與人體器官相類似的細(xì)胞。

5.2 很好地模擬微組織重力

在目前傳統(tǒng)的微重力培養(yǎng)方式中，研發(fā)者一般都需要在體內(nèi)的外部環(huán)境中很好地模擬正常細(xì)胞組織生長的過程和環(huán)境。但是由于細(xì)胞外的基質(zhì)太復(fù)雜，且培養(yǎng)的細(xì)胞難以很好地適應(yīng)其在細(xì)胞外的正常生長環(huán)境，所以在正常培養(yǎng)的細(xì)胞生長過程中很難獲得成功。但是細(xì)胞外的基質(zhì)對(duì)于研發(fā)者調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和促進(jìn)細(xì)胞核機(jī)制蛋白的正常培養(yǎng)可能會(huì)起到至關(guān)重要的促進(jìn)作用，因此RCCS系統(tǒng)可以解決由于分裂而本來應(yīng)在一起的細(xì)胞組織的重力問題，從而能夠很好地模擬體內(nèi)的環(huán)境，改善傳統(tǒng)培養(yǎng)方式的不足[18]。

5.3 三維細(xì)胞培養(yǎng)

在普通的三維生物化學(xué)反應(yīng)器中，細(xì)胞要長期保持三維細(xì)胞的正常懸浮和流動(dòng)狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞間極有可能產(chǎn)生剪切力，影響了三維細(xì)胞間的穩(wěn)定，使得組織和三維細(xì)胞的注意力集中于自身的修復(fù)，從而對(duì)其生長和發(fā)育產(chǎn)生了很大的影響[13]。發(fā)酵罐主要是用來儲(chǔ)存和培養(yǎng)大量的三維細(xì)菌，并不特別適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及其他動(dòng)物組織的三維細(xì)胞培養(yǎng)。因此，把眾多的三維細(xì)胞直接移植至發(fā)酵罐中，只能保證很低的細(xì)胞成活率。而旋轉(zhuǎn)式發(fā)酵罐培養(yǎng)系統(tǒng)能夠很好地允許大規(guī)模的細(xì)胞生產(chǎn)，細(xì)胞平均成活率最低能達(dá)到97%，且細(xì)胞分化的速度還極高。

6 RCCS的應(yīng)用

目前，大型旋轉(zhuǎn)式體外組織培養(yǎng)系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于臨床生物醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。這種大型旋轉(zhuǎn)式體外組織培系統(tǒng)不僅可以直接用于人工生成各種大型高仿和逼真的體外體內(nèi)組織培養(yǎng)模型，還可以直接用于人體進(jìn)行長期的體外組織培養(yǎng)，被廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)場景主要有以下9種[18]。（1）疫苗生產(chǎn)。RCCS培養(yǎng)的肝在歐洲和美國已廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)，使其可以代替成為人的肝臟成為現(xiàn)實(shí)；（2）組織移植。用旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)的某些人體組織已經(jīng)和自然狀態(tài)下的組織在整體上無差別，所以這種培養(yǎng)技術(shù)使得局部組織的移植成為可能。（3）細(xì)胞軟骨關(guān)節(jié)再生。經(jīng)RCCS細(xì)胞再生系統(tǒng)復(fù)制和培養(yǎng)的細(xì)胞軟骨密度極高，可有效治療軟骨關(guān)節(jié)損傷。（4）骨髓再生。經(jīng)RCCS培養(yǎng)的骨髓生長狀況極佳，可依靠該方法建立大型骨髓庫，使更多的人受益。（5）分化性皮膚培養(yǎng)移植。經(jīng)過該系統(tǒng)培養(yǎng)的皮膚分化程度極高，彌補(bǔ)了以前的培養(yǎng)系統(tǒng)的一些不足之處，為那些需要及時(shí)進(jìn)行皮膚移植的人們和患者帶來了福音。（6）有效殺滅腫瘤。（7）腫瘤等病癥的理想模型。

表1 各種培養(yǎng)系統(tǒng)的對(duì)比

7 結(jié)語

旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)雖然為細(xì)胞的培養(yǎng)提供了理想的裝置，但是還存在一些不足之處，如儀器的使用成本較高，使用前的儀器消毒也比傳統(tǒng)的方法復(fù)雜。但是，這種培養(yǎng)系統(tǒng)依舊具有很好的發(fā)展前景，值得進(jìn)行深入研究和廣泛應(yīng)用，并為人類的發(fā)展以及進(jìn)步做出貢獻(xiàn)。