何太波，袁愷，周衛(wèi)強(qiáng)，陳博，盧宗梅，周勇，李義,5，佟毅,5，彭超*

（1.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；2.中糧生物科技（北京）有限公司，北京 102209；3.營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209；4.中糧生物科技股份有限公司，安徽蚌埠 233010；5.玉米深加工國(guó)家工程研究中心，吉林長(zhǎng)春 130033）

聚蘋果酸是一種以蘋果酸為唯一單體并通過(guò)酯化聚合而成的新型聚酯類高分子材料，已經(jīng)被開發(fā)用于生物醫(yī)用材料、化妝類產(chǎn)品、藥物載體等極具市場(chǎng)前景的生物活性材料的生產(chǎn)。聚蘋果酸主要有α、β、γ 3種結(jié)構(gòu)，其中通過(guò)微生物法制備所得的聚蘋果酸均為β型[1]。圖1所示為蘋果酸以及3種聚蘋果酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式[2]。

圖1 蘋果酸與聚蘋果酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)

目前，聚蘋果酸合成途徑主要有兩種。化學(xué)合成法研究起步早，工藝及生產(chǎn)路線成熟，通過(guò)流程控制可以得到α、β、γ任意構(gòu)型的聚蘋果酸。但是化學(xué)合成制備材料來(lái)源單一、設(shè)備要求嚴(yán)格、能耗大，無(wú)法滿足綠色制造的要求。微生物發(fā)酵法制備的聚蘋果酸分子量高、產(chǎn)物純度高，且該方法使用可再生資源，符合綠色環(huán)保理念，吸引了國(guó)內(nèi)外眾多研究人員的注意力[3]。因此，圍繞近年來(lái)出芽短梗霉合成聚蘋果酸的實(shí)驗(yàn)報(bào)道，從已開發(fā)的各種發(fā)酵調(diào)控、培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵條件優(yōu)化等相關(guān)方面進(jìn)行論述，并希望這些研究方法和改進(jìn)措施能夠?yàn)槲⑸锇l(fā)酵法制備聚蘋果酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 微生物法產(chǎn)聚蘋果酸研究現(xiàn)狀

1.1 聚蘋果酸生產(chǎn)方式

與化學(xué)法制備聚蘋果酸相比，微生物發(fā)酵法利用微生物將葡萄糖、淀粉等可再生資源直接轉(zhuǎn)化為聚蘋果酸，再經(jīng)下游工序處理后即可得到聚蘋果酸純品。表1詳細(xì)列舉了分別通過(guò)化學(xué)制備和微生物制備聚蘋果酸存在的優(yōu)勢(shì)和不足。從表中可以看出，微生物發(fā)酵法制備聚蘋果酸具有可觀的前景：（1）微生物發(fā)酵法制備聚蘋果酸使用可再生資源，來(lái)源廣、資源豐富；（2）微生物發(fā)酵法反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境污染小；（3）微生物發(fā)酵法只可以制備β型聚蘋果酸，產(chǎn)物純度高，同時(shí)分子量高，有利于后期開發(fā)利用[2]。

1.2 聚蘋果酸生產(chǎn)菌株

1969年，Shimada等人[4]從圓弧青霉中分離得到一種具有抑制蛋白酶活性的酸性高分子化合物，經(jīng)鑒定后確認(rèn)是聚蘋果酸。1989年，F(xiàn)ischer等人[5]在黏菌的代謝產(chǎn)物中也發(fā)現(xiàn)了聚蘋果酸的存在。后來(lái)短梗霉[6-7]、出芽短梗霉[8]、環(huán)狀青霉[4]和多頭絨泡菌[5]等菌株都被報(bào)道可以用于發(fā)酵制備聚蘋果酸。在用于制備聚蘋果酸的微生物菌株中，出芽短梗霉不僅形態(tài)穩(wěn)定，易于實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中的有效調(diào)控，其合成聚蘋果酸的能力也高于其他菌種[9-10]。

聚蘋果酸合成能力僅次于短梗霉屬的是黏菌變形體，如多頭絨泡菌。對(duì)多頭絨泡菌合成聚蘋果酸的研究多集中在合成及代謝調(diào)控方面[11]，發(fā)酵法制備方面的研究不多。目前，利用黏菌發(fā)酵合成聚蘋果酸多是采用Lee等[12]在1999年建立的原質(zhì)團(tuán)細(xì)胞發(fā)酵的方法。該方法中菌株M3CVII（ATCC204388）培養(yǎng)6 d后聚蘋果酸的產(chǎn)量可以達(dá)到2.7 g/L。2000年，該研究組用非生長(zhǎng)型的黏菌原質(zhì)團(tuán)細(xì)胞發(fā)酵合成了聚蘋果酸，使聚蘋果酸的合成和黏菌的生長(zhǎng)解離開來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)了低生物量情況下高聚蘋果酸產(chǎn)量的合成。Willibald等[13]通過(guò)向多頭絨泡菌中注射14C標(biāo)記的L-蘋果酸，確定了聚蘋果酸的合成路徑，同時(shí)考察了KCN、砷酸鹽、Desulfo CoA、ATP類似物等物質(zhì)對(duì)聚蘋果酸合成的影響。Pinchai等人[14]鑒定出一種調(diào)節(jié)聚蘋果酸水平的蛋白質(zhì)NKA48，但是沒(méi)有證據(jù)證明該多肽是聚蘋果酸合成酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。對(duì)已分離合成聚蘋果酸的生產(chǎn)菌株進(jìn)行總結(jié)，見表2。

表1 聚蘋果酸合成途徑的比較

1.3 出芽短梗霉合成聚蘋果酸的代謝途徑

聚蘋果酸由L-蘋果酸單體聚合而成，通過(guò)增加代謝中間產(chǎn)物或添加相關(guān)酶的抑制劑可以促進(jìn)或削弱其合成轉(zhuǎn)化效率。Liu等[28]在研究出芽短梗霉合成聚蘋果酸途徑時(shí)，發(fā)現(xiàn)添加三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）和乙醛酸循環(huán)的強(qiáng)抑制劑三氟乙酸會(huì)降低聚蘋果酸產(chǎn)量。當(dāng)增加TCA代謝中間產(chǎn)物丁二酸或蘋果酸時(shí)可減弱三氟乙酸的抑制作用。例如，當(dāng)添加馬來(lái)酸和丙二酸時(shí)，琥珀酸脫氫酶受抑制，琥珀酸轉(zhuǎn)化為延胡索酸節(jié)點(diǎn)受阻，可導(dǎo)致TCA循環(huán)中檸檬酸到琥珀酸的中間代謝物積累，而延胡索酸到草酰乙酸之間的代謝產(chǎn)物降低，從而誘導(dǎo)累積的異檸檬酸經(jīng)乙醛酸循環(huán)分流至蘋果酸，導(dǎo)致聚蘋果酸的合成反而增加，說(shuō)明聚蘋果酸合成與乙醛酸通路異檸檬裂解酶和蘋果酸合成酶有關(guān)。喬長(zhǎng)晟等[29]通過(guò)代謝通量分析及關(guān)鍵酶活性的測(cè)定發(fā)現(xiàn)丙酮酸羧化途徑及乙醛酸途徑是合成聚蘋果酸的主要途徑，因此在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)代謝調(diào)控增加丙酮酸羧化途徑或在丙酮酸節(jié)點(diǎn)進(jìn)行靶點(diǎn)改造，減少丙酮酸流向其他途徑造成碳骨架的流失，有利于聚蘋果酸的合成。程若東等[30]研究發(fā)現(xiàn)三氟乙酸可以抑制菌體生長(zhǎng)和聚蘋果酸產(chǎn)生，發(fā)酵過(guò)程中添加丙二酸與順丁烯二酸，關(guān)鍵酶的活性增高，A.pullulansBS24生產(chǎn)聚蘋果酸的途徑可能與TCA循環(huán)和乙醛酸循環(huán)兩個(gè)途徑有關(guān)。

2 出芽短梗霉發(fā)酵法產(chǎn)聚蘋果酸合成條件優(yōu)化

目前，出芽短梗霉發(fā)酵制備聚蘋果酸的優(yōu)化主要集中在菌株的選育、培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵條件優(yōu)化。

2.1 菌株的選育

出芽短梗霉發(fā)酵制備聚蘋果酸獲得高產(chǎn)菌株的方法主要有3種，分別是菌株篩選、菌株誘變和菌株代謝工程改造。徐玲芬等[25]從樹皮、樹葉和樹的分泌物以及花中經(jīng)分離、初篩、復(fù)篩得到一株出芽短梗霉菌。以葡萄糖為碳源、發(fā)酵培養(yǎng)基中添加30 g/L的CaCO3、0.5 g/L的玉米渣液，置于搖床 25 ℃、220 r/min條件下發(fā)酵7 d，聚蘋果酸的濃度達(dá)到26.23 g/L。李睿穎等[31]通過(guò)紫外線誘變研究發(fā)現(xiàn)，該菌株最佳誘變時(shí)間為150 s，采用甘氨酸平板篩選出產(chǎn)量較高的菌株，且連續(xù)重復(fù)傳代后菌株遺傳穩(wěn)定性無(wú)明顯異常。隨后，研究者又發(fā)現(xiàn)在適合時(shí)間段添加30 g/L的CaCO3可以有效中和發(fā)酵產(chǎn)酸，利于菌體生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明：出芽短梗霉的最佳生長(zhǎng)溫度為30 ℃，最佳產(chǎn)酸溫度為25 ℃，最佳接種量為8%。喬長(zhǎng)晟等[32]通過(guò)紫外和氦氖激光復(fù)合誘變后篩選出一株正向突變的出芽短梗霉菌株，以丁二酸、檸檬酸為唯一碳源，其搖瓶產(chǎn)量為12.62 g/L，較出發(fā)菌株聚蘋果酸產(chǎn)量提高了2.97倍。

表2 聚蘋果酸生產(chǎn)菌株

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化調(diào)控

出芽短梗霉發(fā)酵制備聚蘋果酸可以從兩個(gè)方面進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化。其一是能夠有效地合成產(chǎn)物。其二是降低發(fā)酵成本，使得聚蘋果酸市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力更強(qiáng)。對(duì)聚蘋果酸合成的影響因子較多，主要包括氮源、碳源、表面活性劑及CaCO3添加量等。

2.2.1 碳源、氮源的影響

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，除了發(fā)酵生產(chǎn)中最常用的葡萄糖、淀粉、麥芽糖等碳源外，一些生物質(zhì)也被用于聚蘋果酸的生產(chǎn)。Naoki等[33]從日本各地采集的木質(zhì)標(biāo)本中分離到Aureobasidiumsp. A-91，以葡萄糖為碳源，培養(yǎng)基中加入 30 g/L 的 CaCO3，25 ℃搖床培養(yǎng) 7 d，聚蘋果酸的濃度達(dá)到47 g/L；Timothy等[34]經(jīng)過(guò)預(yù)堿性H2O2處理的小麥秸稈，在含有5%的小麥秸稈發(fā)酵液中添加3% CaCO3，可產(chǎn)生23.5 g/L的聚蘋果酸。同樣的，經(jīng)過(guò)預(yù)處理的部分農(nóng)作物可以用于生產(chǎn)聚蘋果酸，通過(guò)降低發(fā)酵物料的成本從而降低聚蘋果酸的生產(chǎn)成本；Cheng等[16]報(bào)道了采用大豆制品加工的副產(chǎn)物大豆皮和大豆糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸，大豆糖蜜可無(wú)需經(jīng)過(guò)酶解預(yù)處理步驟而直接被A.pullulansZX—10利用，原因是A.pullulans中含有編碼α-半乳糖苷酶和β-呋喃糖苷酶的基因并能表達(dá)，從而使A.pullulans直接分解利用大豆低聚糖。Wei等[17]研究了甘蔗糖蜜對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生聚蘋果酸的影響，甘蔗糖蜜已經(jīng)含有充足的氮源支持細(xì)胞生長(zhǎng)，任何其他氮源都將減少聚蘋果酸的產(chǎn)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅僅采用稀釋后甘蔗糖蜜進(jìn)行發(fā)酵而無(wú)需添加其他額外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)即可滿足發(fā)酵需要，在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行的分批補(bǔ)料發(fā)酵中，聚蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到116.3 g/L。

微生物發(fā)酵的氮源多數(shù)為蛋白胨、尿素、氯化銨和丁二酸銨等。靳挺等[35]采用丁二酸作為氮源時(shí)聚蘋果酸產(chǎn)量得到提高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：最佳氮源濃度丁二酸銨為3 g/L，此時(shí)聚蘋果酸的產(chǎn)量最大，達(dá)到16.58 g/L。

程媛嬡等[36]采用響應(yīng)面分析法對(duì)出芽短梗霉菌發(fā)酵制備聚蘋果酸的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)、中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析獲得了最適發(fā)酵培養(yǎng)基。優(yōu)化后，3種顯著影響因素的最佳濃度分別為葡萄糖 110.91 g/L、丁二酸銨 3.66 g/L、碳酸鈣 45.30 g/L，聚蘋果酸的濃度為 41.6 g/L，對(duì)比優(yōu)化前的20.74 g/L提高199%。李睿穎等[37]使用5 L發(fā)酵罐試驗(yàn)，得到最佳種子培養(yǎng)基配方為80 g/L葡萄糖、4 g/L KH2PO4、3 g/L 丁二酸銨、1 g/L 丁二酸、1 g/L MgSO4·7H2O、0.07 g/L ZnSO4·7H2O、3 g/L 玉米漿粉和 30 g/L CaCO3（單獨(dú)滅菌），轉(zhuǎn)速為 180 r/min。發(fā)酵 24 h 后加入 0.44 mmol/L 的曲拉通，發(fā)酵 124 h，可收集聚蘋果酸的總量達(dá)到318 g，優(yōu)化后產(chǎn)量提高46.8%，整個(gè)發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，減少種子罐培養(yǎng)，節(jié)省發(fā)酵成本。

2.2.2 添加CaCO3和表面活性劑的影響

出芽短梗霉合成聚蘋果酸培養(yǎng)基中加入CaCO3后，在丙酮酸羧化酶的作用下，草酰乙酸的合成量會(huì)增加，其中一部分進(jìn)一步還原生成L-蘋果酸，一部通過(guò)蘋果酸-天冬氨酸穿梭進(jìn)入TCA循環(huán)，防止草酰乙酸的過(guò)量積累造成代謝上的不平衡[27]。趙廷彬等[38]研究發(fā)現(xiàn)，不同表面活性劑對(duì)出芽短梗霉生長(zhǎng)和聚蘋果酸制備的影響各不相同。例如，添加吐溫80后，其最佳添加量為2 g/L，聚蘋果酸產(chǎn)量為31.36 g/L，較對(duì)照組提高了30.5%。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

微生物發(fā)酵過(guò)程主要是在微生物細(xì)胞作用下所進(jìn)行的系列串聯(lián)生物反應(yīng)過(guò)程。通過(guò)改變溫度、pH等條件可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物發(fā)酵代謝的控制，從而增加目標(biāo)產(chǎn)物的積累。

2.3.1 改變?nèi)苎醯挠绊?/p>

出芽短梗霉是一類與酵母有密切關(guān)系且高耗氧的真菌，發(fā)酵過(guò)程中必須提供充足的氧氣以維持菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的形成。Xia等[39]報(bào)道了采用分階段溶氧控制策略可以實(shí)現(xiàn)聚蘋果酸的高濃度積累。通過(guò)5 L發(fā)酵罐在10%～90%飽和度范圍內(nèi)恒定溶氧，將溶氧在72 h從30%的飽和度轉(zhuǎn)變?yōu)?0%飽和度的溶氧控制策略，以有效提高聚蘋果酸生產(chǎn)菌株的活性，聚蘋果酸最大濃度為118.6 g/L，產(chǎn)率大大提高。由此可見，改變?nèi)苎跄茱@著影響菌株對(duì)碳源的利用，溶氧增大時(shí)，碳源的利用速率和利用率都增大，維持在一定比例更有利于聚蘋果酸的產(chǎn)量。

2.3.2 pH的影響

出芽短梗霉適合在酸性環(huán)境中生長(zhǎng)，但pH偏低也會(huì)影響聚蘋果酸的合成，選擇適合的pH值也會(huì)提高聚蘋果酸的產(chǎn)率。目前研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基初始pH值為4.0～6.0時(shí)，有利于聚蘋果酸的合成；當(dāng)pH 5.0～6.0時(shí)，是菌株的最佳產(chǎn)聚蘋果酸環(huán)境[27]。靳挺等[35]控制發(fā)酵初始pH為5.5時(shí)，聚蘋果酸的產(chǎn)量達(dá)到 16.58 g/L。

2.3.3 調(diào)節(jié)溫度的影響

程若東等[30]對(duì)出芽短梗霉積累聚蘋果酸途徑及調(diào)控進(jìn)行了細(xì)致研究，開發(fā)出了雙階段控溫法實(shí)現(xiàn)了菌株高產(chǎn)量的目的。前24 h最適生長(zhǎng)溫度調(diào)至30 ℃，24 h至發(fā)酵結(jié)束控制溫度保持在25 ℃，使菌株保持在產(chǎn)酸的最適條件，聚蘋果酸產(chǎn)量為45.2 g/L；李睿穎等[31]發(fā)現(xiàn)出芽短梗霉在不同溫度下會(huì)出現(xiàn)不同的代謝情況，于是開發(fā)出雙階段控溫發(fā)酵法提高聚蘋果酸產(chǎn)量。發(fā)酵前期控制發(fā)酵溫度在30 ℃，此時(shí)菌體主要吸收必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于生物量的積累，發(fā)酵后期控制發(fā)酵溫度在25 ℃，菌株由生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸階段，經(jīng)發(fā)酵18 h后，聚蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到56.2 g/L。

2.3.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化

Toshiaki等[40]向細(xì)胞制備培養(yǎng)基中添加CuSO4，發(fā)現(xiàn)對(duì)于提高細(xì)胞活性是有效的，最佳條件為葡萄糖 160 g/L、CaCO3為 40 g/L，30 ℃下發(fā)酵 5 d，聚蘋果酸的濃度為80 g/L；Zou等[9]通過(guò)固定在纖維床生物反應(yīng)器中的菌體進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，發(fā)酵6 d聚蘋果酸濃度為144.2 g/L。在發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化方面，中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所的萬(wàn)印華等[41]公開了利用A.pullulansipe-1發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的新工藝。研究人員通過(guò)發(fā)酵過(guò)程中溶氧控制、pH控制，同時(shí)結(jié)合有機(jī)氮、無(wú)機(jī)氮的交配使用，在7 L發(fā)酵罐中發(fā)酵4 d，發(fā)酵液中聚蘋果酸的濃度達(dá)到 35.2 g/L。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

聚蘋果酸是一種重要、新型、市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊的生物高分子活性材料。隨著環(huán)境污染越來(lái)越嚴(yán)重以及化學(xué)合成法存在的較多弊端，勢(shì)必逐漸被微生物發(fā)酵法替代。盡管出芽短梗霉生產(chǎn)聚蘋果酸具有產(chǎn)量高的優(yōu)勢(shì)，但其較長(zhǎng)的發(fā)酵周期以及由此導(dǎo)致的單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)量低的問(wèn)題限制了其的廣泛應(yīng)用。基于基因測(cè)序手段的高產(chǎn)菌株誘變和代謝途徑改造將進(jìn)一步提高出芽短梗霉在聚蘋果酸生產(chǎn)上的優(yōu)勢(shì)。在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室條件下，通過(guò)篩選及改造高產(chǎn)菌株的合成代謝途徑等方式提高聚蘋果酸發(fā)酵產(chǎn)量取得了一定效果，并摸索出低成本的培養(yǎng)原料和穩(wěn)定可靠的發(fā)酵控制工藝，為加快實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)聚蘋果酸提供了參考。