盧美杉，朱蓓薇，付云，劉小玲*

1(廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧，530004) 2(國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連，116034)

我國繅絲蠶蛹資源豐富，年產(chǎn)量已達(dá)50萬t以上，具有較高的營養(yǎng)價值。蠶蛹干燥后蛋白質(zhì)含量在40%左右，并且還富含多種維生素以及Fe、Zn、Se等微量元素[1-2]。作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)替代來源，蠶蛹也是最符合人體需要的氨基酸來源代表之一[3]。2004年，蠶蛹被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為“普通食品管理的食品新資源”，也是其中僅有的昆蟲類原料。研究證實，蠶蛹具有抗腫瘤、抗氧化、降血壓、抗疲勞、預(yù)防肝損傷、延緩衰老等作用[4-5]。已有研究表明，蠶蛹的納豆菌發(fā)酵產(chǎn)物具有抗菌活性[6]，但并沒有對其抗凝血和降血脂活性進(jìn)行研究。

納豆菌是枯草芽孢桿菌的一個亞種,屬于益生菌[7]。本實驗發(fā)酵用納豆菌菌株為北京川秀科技生產(chǎn)的納豆菌凍干粉經(jīng)活化后涂板得到,在其發(fā)酵過程中會生成納豆激酶等酶。因此，本研究采用納豆菌發(fā)酵蠶蛹粉，對發(fā)酵產(chǎn)物的纖維蛋白溶解率、ABTS自由基清除率、膽酸鹽結(jié)合率、以及抗凝血活性的4項指標(biāo)進(jìn)行分析，并同黃豆發(fā)酵液進(jìn)行比較。本研究探討了蠶蛹替代黃豆進(jìn)行納豆菌發(fā)酵的可行性，并期望提高繅絲副產(chǎn)物-蠶蛹的附加值和利用度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

繅絲蠶蛹，廣西河池桑蠶基地；東北黃豆，南寧百貨；新鮮牛血漿采于西大動科學(xué)院健康成年牛。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、牛肉粉30、葡萄糖10，調(diào)節(jié)pH至7.0。

黃豆培養(yǎng)基(g/L)：黃豆凍干粉30、蔗糖10、KH2PO41、K2HPO42.5、 MgSO40.5。

蠶蛹培養(yǎng)基(g/L)：蠶蛹凍干粉30、蔗糖10、KH2PO41、K2HPO42.5、MgSO40.5。

納豆菌，北京川秀科技；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(優(yōu)級純)，上海哈靈生物科技；N,N,N′N′-四甲基乙二胺(生化級)；納豆激酶標(biāo)品(Nattokinase)，和光純藥工業(yè)株式會社；纖維蛋白、凝血酶、水溶性VE、胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛黃膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉，上海麥克林生物化學(xué)有限公司；枸櫞酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；RCT basic磁力攪拌器，德國IKA公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；L-8900氨基酸分析儀，日本日立公司；Bio-Rad ChemiDoc XRS凝膠成像儀，美國伯樂公司；CR21N高速冷凍離心機，日立公司；K9840自動凱氏定氮儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司；UV6100紫外可見分光光度計，上海美譜達(dá)公司；SUNRISE酶標(biāo)儀，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司；T25高速分散均質(zhì)機，德國IKA公司；CS-5100全自動凝血分析儀，日本Sysmex。

1.3 蠶蛹基礎(chǔ)組成成分分析

分別將新鮮的繅絲蠶蛹與浸泡過夜的黃豆去皮勻漿，-50 ℃下采用真空冷凍干燥機處理48 h將其凍干成粉。

冷凍干燥后的蠶蛹粉分別參照GB5009.3—2016、GB5009.4—2016、GB5009.6—2016、GB5009.5—2016 對水分、灰分、脂肪、蛋白含量進(jìn)行檢測。

蛋白含量的計算參考國標(biāo)中的計算公式，其中蛋白質(zhì)折算系數(shù)定為6.25(其他食品)。

1.4 氨基酸組成與總氨基酸含量的測定

參考GB/T5009.124—2016氨基酸的檢測方法進(jìn)行測定。

1.5 蠶蛹蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳

前處理參考李健等與穆利霞等[8-10]的方法提取蛋白。得到的蛋白用蒸餾水清洗后，4 000 r/min離心5 min，至上清液澄清無味，經(jīng)真空冷凍干燥獲得淡褐色蠶蛹蛋白粉。對該蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析(濃縮膠質(zhì)量濃度50 g/L、分離膠質(zhì)量濃度12 g/L，電壓90 V)，1.5 h后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析[11]。

1.6 納豆菌的活化及生長曲線測定

將購得的納豆菌粉活化后稀釋涂板，挑單菌落37 ℃下在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，將菌液以體積比1∶1與40%的丙三醇混合，置于-80 ℃保存。

以1%的接種量將納豆菌接種到種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h進(jìn)行一次活化。分別取1 mL活化后的菌液，加入7瓶100 mL種子培養(yǎng)基中37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h(此過程即為二次活化)，每隔4 h從培養(yǎng)箱中取出1瓶培養(yǎng)液，測定菌液的吸光度OD600， 并繪制納豆菌在種子培養(yǎng)基中的生長曲線。

取二次活化后的菌液以1%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)32 h，每隔8 h取出1瓶黃豆發(fā)酵液，1瓶蠶蛹發(fā)酵液，測定菌液的吸光度OD600，并繪制納豆菌在不同發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長曲線。

1.7 納豆菌不同發(fā)酵液的活性分析

1.7.1 發(fā)酵液的制備

取二次活化生長穩(wěn)定期的納豆菌液以體積比1∶100 加入新鮮蠶蛹培養(yǎng)基、煮熟蠶蛹培養(yǎng)基、黃豆培養(yǎng)基中(新鮮蠶蛹培養(yǎng)基中蠶蛹粉進(jìn)行紫外滅菌，剩余成分與其他2種培養(yǎng)基一同121 ℃、20 min滅菌)，恒溫?fù)u床37 ℃、160 r/min發(fā)酵。發(fā)酵時間分別為8、16、24、32 h。將發(fā)酵液在4 ℃，9 000 r/min的條件下離心，得到上清液取部分直接測定納豆激酶酶活，其余置于-20 ℃存放，用于其他指標(biāo)測定。本文后面出現(xiàn)的CSC(cooked silkworm chrysalis)、FSC(fresh silkworm chrysalis)、CSB(cooked soybean)分別指煮熟蠶蛹納豆菌發(fā)酵液、新鮮蠶蛹納豆菌發(fā)酵液、黃豆納豆菌發(fā)酵液。

1.7.2 納豆激酶酶活的測定

采用纖維蛋白降解法測定納豆激酶活[12-14]。將0.4 mL的纖維蛋白原溶液(7.2 g/L)和1.5 mL的Tris-HCl(0.050 mol/L，pH 7.8)混合并在37 ℃下溫育5 min；再向其中加入0.2 mL凝血酶(10 U/mL)，37 ℃下溫育10 min，得到纖維底物溶液。加入0.1 mL發(fā)酵液在37 ℃下孵育60 min。每20 min搖動混合溶液。孵育后加入2 mL三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液(0.2 mol/L)終止反應(yīng)。作為陰性對照，將纖維底物溶液37 ℃溫育60 min后，將0.1 mL發(fā)酵液和2 mL TCA溶液(0.2 mol/L)加入其中。將樣品以6 700 r/min離心15 min，并測量275 nm處的吸光度。1個單位的納豆激酶活性(FU)定義為1 min吸光度增加0.01的量。陽性對照為用生理鹽水溶解的不同濃度梯度的納豆激酶標(biāo)品(0.02、0.01、0.005、0.002 5 g/mL)。

1.7.3 ABTS自由基清除活性的測定

參考DAI等與王立博等的方法測定ABTS自由基的清除率[15-17]。將7.4 mmol/L ABTS 0.2 mL 與2.6 mmol/L K2S2O80.2 mL混合后置于室溫黑暗處12 h，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋40～50倍，直至OD734達(dá)到0.7±0.02，得到ABTS工作液。取3 mL ABTS工作液加200 μL 10倍稀釋后的發(fā)酵液充分搖勻，靜置6 min，測定734 nm處的吸光值。空白對照為PBS緩沖液，陽性對照為20 mg/mL Trolox。ABTS自由基清除率的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A0為空白對照在734 nm處的OD值；A為發(fā)酵液在734 nm處的OD值。

1.7.4 降血脂活性的測定

1.7.4.1 三種膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用0.1 mol/L，pH 6.3的磷酸緩沖溶液配制0.3 mmol/L?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉溶液定容至100 mL，參考劉山等、王靜輝等的方法[18-19]繪制出3種膽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)處理得到牛黃膽酸鈉、甘膽酸鈉、膽酸鈉的線性回歸方程分別為：y=0.161 7x+0.074 2,R2=0.998 4;y=0.186x+0.074 6,R2=0.999 4;y=0.202 6x+0.077 6,R2=0.999。

1.7.4.2 發(fā)酵液體外膽酸鹽結(jié)合率的測定

參考于美匯等的方法[20-21]，用磷酸緩沖溶液配制10 mg/mL胃蛋白酶、胰蛋白酶。取2 mL發(fā)酵液，再向其中加入1 mL 0.01 mol/L的鹽酸溶液和3 mL 10 mg/mL的胃蛋白酶，模擬胃環(huán)境，在37 ℃下恒溫振蕩1 h；取出后加入4 mL胰蛋白酶，并用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.8～7.0，模擬腸道環(huán)境，在37 ℃下恒溫振蕩1 h；處理后的溶液分別加入4 mL 0.3 mmol/L?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉溶液中，在37 ℃下恒溫振蕩1 h后轉(zhuǎn)移至離心管，在4 000 r/min下離心15 min，收集上清液進(jìn)行下一步比色實驗，陽性對照為10 mg/mL考來烯胺。

向2.5 mL上清液中加入7.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%H2SO4溶液，將具塞試管置于70 ℃條件下水浴20 min，然后取出冰浴至冷卻，在374 nm測吸光度OD值并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品溶液中各膽酸鹽的濃度，從而計算出發(fā)酵液對3種膽酸鹽的結(jié)合率。膽酸鹽結(jié)合率的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：b為3種膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；k為3種膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；OD374為樣品在374 nm處的吸光度。

1.7.5 抗凝血活性的測定

參考李巖等[22]、王城的方法[23]，取健康牛新鮮血液與100 mmol/L枸櫞酸鈉按體積比9∶1混勻，3 000 r/min離心10 min，收集離心上層液體。將其分裝于1 mL離心管中，冷凍保藏。實驗時37 ℃預(yù)熱，取發(fā)酵液分別與待測血漿按體積比1∶4混合，用全自動血凝儀進(jìn)行抗凝血4項指標(biāo)的檢測，以肝素鈉作為陽性對照。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗均重復(fù)3次,實驗所得數(shù)據(jù)運用SPSS進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶蛹粉基礎(chǔ)成分含量

蠶蛹凍干粉的基礎(chǔ)成分如表1所示。蠶蛹主要成分為蛋白質(zhì)和脂肪，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為46.68%、35.74%。其蛋白質(zhì)含量與黃豆中的蛋白質(zhì)含量較為接近，脂肪含量明顯高于黃豆[24]。這表明，蠶蛹作為一種蛋白和脂肪含量較高的低值副產(chǎn)物，具有潛在的替代納豆加工制品原料的利用價值。

表1 蠶蛹凍干粉的主要成分Table 1 Basic ingredients of silkworm powder

注：*其他可能包含糖類和色素類等雜物質(zhì)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)通過減量法計算

2.2 蠶蛹氨基酸組成與總氨基酸含量

蠶蛹凍干粉氨基酸組成如表2所示。由表2可知，其主要含有17種游離氨基酸，其中谷氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高4.98%、其次是天冬氨酸4.03%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最少的半胱氨酸，僅占0.28%。總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.23%，與含有43%蛋白的豆粕中的氨基酸分布幾乎一致[25]。

表2 蠶蛹凍干粉的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of silkworm powder

2.3 蠶蛹蛋白組分分子質(zhì)量

蠶蛹凍干粉脫脂后，采用堿溶酸沉法進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取。提取的蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖如圖1所示。根據(jù)Marker分子量Mr的lg值與遷移距離d可以得到線性回歸方程為lgMr=-0.124 9d+2.071，根據(jù)此方程對分子質(zhì)量進(jìn)行計算。電泳顯示，蠶蛹蛋白中，分子質(zhì)量30～34 kDa的蛋白組分相對占比最多，此外，還含有74、66、52 kDa的組分，以及極少量14 kDa的蛋白組分。整體與黃豆的蛋白組分分子質(zhì)量相比較小[26]，更易被分解成小肽，在發(fā)酵過程中更容易產(chǎn)生具有功能活性的多肽。

1～4分別表示蠶蛹總蛋白的上樣質(zhì)量濃度為10、5、2.5和1.25 mg/mL
圖1 蠶蛹蛋白相對分子質(zhì)量分布
Fig.1 Molecular weight of silkworm pupa protein

2.4 納豆菌的發(fā)酵生長曲線

納豆菌在種子培養(yǎng)基中生長曲線如圖2所示，在黃豆和蠶蛹培養(yǎng)基中生長曲線如圖3所示。由圖2可知，納豆菌在種子培養(yǎng)基中0～8 h為快速生長期，8～20 h趨于平穩(wěn)即菌體活力穩(wěn)定，24 h后開始下降，所以取20 h的菌液作為發(fā)酵用菌液。由圖3可知，在2種發(fā)酵培養(yǎng)基中，0～8 h為納豆菌生長旺盛期，8～32 h活菌數(shù)繼續(xù)緩慢遞增，趨于平穩(wěn)。根據(jù)圖3結(jié)果，后續(xù)實驗將采用蠶蛹及大豆32 h的發(fā)酵液進(jìn)一步比較他們的功能活性差異。

圖2 納豆菌在種子培養(yǎng)基中的生長曲線
Fig.2 Growth curve of natto bacteria in basic culture medium

圖3 納豆菌在2種不同發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長曲線
Fig.3 Growth curve of natto bacteria in two different fermentation mediums

2.5 不同發(fā)酵液納豆激酶酶活的比較

不同發(fā)酵液的納豆激酶酶活如圖4所示。由圖4可知，隨發(fā)酵時間延長，3種發(fā)酵液的納豆激酶活力均呈現(xiàn)提升，其中8～16 h時，納豆激酶酶活變化不顯著，處于平臺期。發(fā)酵16 h后，發(fā)酵液納豆激酶酶活進(jìn)一步提高。3種發(fā)酵液中，F(xiàn)SC的納豆激酶酶活始終最大，CSB納豆激酶在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)線性遞增，而CSC增長緩慢。32 h時，3種發(fā)酵液中的納豆激酶酶活均達(dá)到最大，F(xiàn)SC為4 140 FU/mL、CSB為3 720 FU/mL、CSC～3 060 FU/mL。

圖4 不同發(fā)酵時間下3種發(fā)酵液的納豆激酶酶活
Fig.4 Nattokinase enzyme activity of three kinds of fermentation broth at different fermentation time

2.6 不同發(fā)酵液ABTS自由基清除活性的比較

3種發(fā)酵液的ABTS自由基清除活性如圖5所示。隨發(fā)酵時間延長，不同發(fā)酵液的ABTS自由基清除能力均不斷提高。其中，CSC始終高于其他2種，并在發(fā)酵32 h時清除率達(dá)到96.8%。8 h時，F(xiàn)SC與CSC基本一致，但16 h后則低于CSC。相比而言，CSB的ABTS自由基清除率最低。和陽性對照Trolox相比，2種蠶蛹發(fā)酵液始終顯著高于陽性對照，而黃豆發(fā)酵液則在16 h后才超過陽性對照。由此可見，蠶蛹的納豆菌發(fā)酵液的抗氧化活性顯著高于黃豆，且蠶蛹發(fā)酵液抗氧化活性很大程度來自于納豆菌對其的利用。

圖5 不同發(fā)酵時間下3種發(fā)酵液的ABTS自由基清除率
Fig.5 ABTS free radical scavenging rate of three kinds of fermentation broth at different fermentation time

2.7 不同發(fā)酵液降血脂活性的比較

以3種不同膽酸鹽的結(jié)合率為指標(biāo)考察發(fā)酵液的降血脂活性，如圖6所示。由圖6可知，隨著發(fā)酵時間的延長，3種發(fā)酵液對3種膽酸鹽的結(jié)合率均有提高。與陽性對照(10 mg/mL考來烯胺)相比，3種發(fā)酵液的牛膽酸鈉結(jié)合率低于陽性對照，而甘氨膽酸鈉、膽酸鈉3種膽酸鹽結(jié)合率高于陽性對照。3種發(fā)酵液中，2種蠶蛹發(fā)酵液的3種膽酸鹽結(jié)合率始終高于黃豆發(fā)酵液，且發(fā)酵32 h時，3種膽酸鹽結(jié)合率都在75%以上，其中FSC的牛膽酸鈉結(jié)合率和甘膽酸鈉結(jié)合率略高于CSC，而膽酸鈉結(jié)合率略低于CSC。由此可見，蠶蛹發(fā)酵液的降血脂活性優(yōu)于黃豆發(fā)酵液，且其活性強度受發(fā)酵時間影響。當(dāng)活性達(dá)到最大時蠶蛹熟化變性對其降血脂活性無顯著影響。

a-牛黃膽酸鈉結(jié)合率;b-甘膽酸鈉結(jié)合率;c-膽酸鈉結(jié)合率
圖6 三種發(fā)酵液對3種不同膽酸鹽的結(jié)合率
Fig.6 The binding rate of three kinds of fermentation broth to three different cholate salts

2.8 不同發(fā)酵液抗凝血活性的比較

以80 mg/mL肝素鈉作為陽性對照，使用全自動血凝儀對不同發(fā)酵液的抗凝血指標(biāo)[活化部分凝血酶時間(active part thrombin time,APTT)、凝血酶原時間(protothrombin time,PT)、凝血酶時間(thrombin time,TT)、纖維蛋白原(fibrinogen,FIB)]進(jìn)行檢測。隨著發(fā)酵時間的增長FSC的APTT值呈上升趨勢，在32 h時達(dá)到最大，且在8 h以后APTT值一直高于CSC、CSB(圖7-a)。隨著發(fā)酵時間的增長FSC的PT值呈上升趨勢，CSC、CSB的PT值呈下降趨勢，在發(fā)酵時間為32 h時，F(xiàn)SC的PT值達(dá)到最大為38.3(圖7-b)。隨著發(fā)酵時間的增長，F(xiàn)SC與CSC的TT值略有波動，都在32 h時達(dá)到最大17.2 s，CSB的TT值呈下降趨勢，在發(fā)酵時間為32 h時，CSC、FSC、CSB的TT值分別為17.2、17.2、22.4 s(圖7-c)。隨著發(fā)酵時間的增長FSC、CSC、CSB的FIB值整體均呈下降趨勢，在發(fā)酵時間為32 h時3種發(fā)酵液的FIB值均達(dá)到最小，CSC、FSC、CSB分別為1.17、1.22、1.26 g/L(圖7-d)。APTT、PT、TT 3個指標(biāo)值越大說明該機理下的抗凝血活性越高，F(xiàn)IB則相反[27]。由數(shù)據(jù)分析可知，APTT、PT指標(biāo)下的抗凝血活性新鮮蠶蛹發(fā)酵液遠(yuǎn)高于其他2種發(fā)酵液，TT指標(biāo)下的抗凝血活性黃豆發(fā)酵液略高于2種蠶蛹發(fā)酵液，F(xiàn)IB指標(biāo)下的抗凝血活性為煮熟蠶蛹發(fā)酵液高于新鮮蠶蛹發(fā)酵液高于黃豆發(fā)酵液。綜合4項指標(biāo)在抗凝血方面的作用程度重要性，得出結(jié)論新鮮蠶蛹發(fā)酵液的抗凝血活性大于煮熟蠶蛹發(fā)酵液大于黃豆發(fā)酵液。

a-APTT值;b-PT值;c-TT值;d-FIB值
圖7 三種發(fā)酵液在不同發(fā)酵時間的4項抗凝血指標(biāo)
Fig.7 Four anticoagulation indicators of three fermentation broth at different fermentation time

3 結(jié)論

本文以煮熟蠶蛹粉、新鮮蠶蛹粉和黃豆粉3種不同的氮源進(jìn)行納豆菌的發(fā)酵，并對發(fā)酵液的納豆激酶酶活、抗氧化活性、降血脂和抗凝血活性進(jìn)行比較。研究表明，與常規(guī)以黃豆為基礎(chǔ)的納豆發(fā)酵制品相比，蠶蛹具有與黃豆相似的蛋白含量，但在相同發(fā)酵條件下，蠶蛹的納豆激酶酶活、抗氧化活性、降血脂及抗凝血活性優(yōu)于黃豆的納豆菌發(fā)酵產(chǎn)物。而蠶蛹以鮮蛹狀態(tài)發(fā)酵得到的活性略優(yōu)于熟蛹狀態(tài)發(fā)酵，可見蠶蛹發(fā)酵液的活性更大來源于發(fā)酵過程納豆菌對蠶蛹的利用。綜上，利用納豆菌發(fā)酵繅絲蠶蛹是繅絲蠶蛹高值化利用的有效途徑。