黃世芳，陳埏芳，施 穎，鐘 綠，湯紹輝△

（暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1重癥醫(yī)學(xué)科，2消化科，廣東廣州510630）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，全世界CRC發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]。盡管CRC的治療取得一定進(jìn)展，但中晚期CRC患者5年生存率仍不樂觀[2-3]。CRC的發(fā)生發(fā)展與遺傳因素、環(huán)境因素以及它們之間的相互作用密切相關(guān)，而原癌基因激活、腫瘤抑制基因失活和細(xì)胞信號(hào)通路功能異常被認(rèn)為是CRC發(fā)生的重要機(jī)制[4-5]，但其詳細(xì)分子機(jī)制尚未完全明確。

癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫是美國國家癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）和美國國家人類基因組研究所（National Human Genome Research Institute，NHGRI）于2006年共同開發(fā)的研究項(xiàng)目，旨在采用高通量基因組測序技術(shù)對(duì)腫瘤標(biāo)本進(jìn)行全基因組分析，包括差異表達(dá)基因、單核苷酸多態(tài)性、拷貝數(shù)變異、長鏈非編碼RNA、甲基化數(shù)據(jù)等，從而在分子水平上挖掘出與腫瘤發(fā)生發(fā)展、預(yù)后相關(guān)的基因變異及信號(hào)通路[6-9]。高通量測序技術(shù)將有助于尋找新的CRC分子治療靶點(diǎn)及CRC早期診斷和預(yù)后監(jiān)測的分子標(biāo)志物，這對(duì)改善CRC患者預(yù)后具有重要意義。

本研究通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中大樣本CRC組織基因表達(dá)譜RNA測序（RNA sequencing，RNA-Seq）數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，挖掘與CRC預(yù)后密切相關(guān)的新基因，對(duì)篩選出的新基因進(jìn)行驗(yàn)證和功能研究，為臨床上CRC診治提供參考資料。

材料和方法

1 研究對(duì)象

1.1 數(shù)據(jù)來源 將納入TCGA數(shù)據(jù)庫中的410例CRC樣本和30例CRC癌旁組織樣本分別用編號(hào)進(jìn)行區(qū)分。這些樣本有完整的mRNA高通量測序結(jié)果，且有相應(yīng)的臨床病理學(xué)信息資料。基因表達(dá)數(shù)據(jù)級(jí)別為level 3。官方授權(quán)可以公開發(fā)表利用TCGA數(shù)據(jù)庫的分析研究結(jié)果。

1.2 組織標(biāo)本 22例CRC及配對(duì)的癌旁組織[男14例，女8例，年齡（61.1±10.5）歲；右半結(jié)腸7例，左半結(jié)腸6例，直腸9例；中分化腺癌21例，黏液腺癌1例]收集于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科2018年5～9月住院的CRC患者手術(shù)切除標(biāo)本，診斷均經(jīng)病理組織學(xué)檢測證實(shí)。組織標(biāo)本收集后立即放入超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。本研究由暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞株 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、HT29、SW620和HCT116，人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株HCoEpiC，人胚腎細(xì)胞株293T，均購于ATCC。

2 方法

2.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理

2.1.1 CRC基因表達(dá)數(shù)據(jù)的獲取 TCGA訪問主頁為https：//cancergenome.nih.gov/。進(jìn)入數(shù)據(jù)下載頁面，癌癥類型為colorectal cancer，選擇TCGA-COAD、Transcriptome Profiling、Gene Expression Quantification和HTSeq-Counts類型數(shù)據(jù)，進(jìn)入數(shù)據(jù)獲取頁面。RNA的表達(dá)數(shù)據(jù)為level 3級(jí)別，同時(shí)勾選Metadata和Manitest文件，利用GDC Data Transfer Tool下載所需數(shù)據(jù)。

2.1.2 差異表達(dá)基因的篩選及聚類分析 利用R語言R 3.3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，篩選差異表達(dá)基因。設(shè)定差異基因的篩選閾值：Padj＜0.05，|log2（fold change）|＞1。其意義為：mRNA在腫瘤組織與正常組織表達(dá)有差異的校正后P值＜0.05，改變倍數(shù)＞2。同時(shí)采用heatmap包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析。

2.1.3 差異表達(dá)基因的生存分析 使用R-survival包對(duì)富集于生物學(xué)過程中的差異表達(dá)基因進(jìn)行生存分析并繪制生存曲線圖。首先對(duì)基因的表達(dá)量按中位數(shù)進(jìn)行分組，表達(dá)量高于中位數(shù)的為高表達(dá)組[CCDC78（coiled-coil domain containing 78）高表達(dá)組、PGGHG高表達(dá)組和TSPEAR高表達(dá)組]，表達(dá)量低于中位數(shù)的為低表達(dá)組（CCDC78低表達(dá)組、PGGHG低表達(dá)組和TSPEAR低表達(dá)組）。將差異基因表達(dá)量數(shù)據(jù)和生存數(shù)據(jù)整合在一起，采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存時(shí)間及累積生存率，結(jié)合log-rank檢驗(yàn)比較生存率的差異，過濾條件為P＜0.01。

2.2 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 取1×106個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞，加入1 mL TRIzol，吹打混勻使細(xì)胞充分裂解；人體組織標(biāo)本（10～20 mg）加入液氮充分研磨呈粉末，加入1 mL TRIzol，收取細(xì)胞裂解產(chǎn)物。按照說明書提取RNA，測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄RNA成cDNA后進(jìn)行RT-qPCR檢測。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)量。引物通過Primer 5軟件設(shè)計(jì)，由蘇州金唯智公司合成。CCDC78的上游引物序列為5'-CAAGGAGCTGGTCGACATT-3'，下游引物序列為5'-AGCCGAAGGATCTCACTCT-3'；PGGHG的上游引物序列為5'-CTTGACTCTGGGCAGCTTTA-3'，下游引物序列為5'-CTCAAATCCCTCTCCTGTTCTC-3'；TSPEAR的上游引物序列為5'-GAGCGATCCTCAGAGAGTTTAC-3'，下游引物序列為5'-GAGCTGAAGGTGAACAGACA-3'；GAPDH的上游引物序列為5'-GGAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，下游引物序列為5'-GCTTCCCGTTCTCAGCCTTGA-3'。

2.3CCDC78siRNA（siCCDC78）的篩選 檢索GenBank中人 CCDC78的 mRNA序列（NM_001031737.2），按照siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)CCDC78_001、CCDC78_002和CCDC78_003共3對(duì)siRNA，另設(shè)計(jì)1對(duì)無任何靶基因的陰性對(duì)照siRNA（negative control siRNA，NC siRNA）作為陰性對(duì)照，均委托蘇州金唯智公司合成，序列見表1。培養(yǎng)SW480細(xì)胞至匯合度為30%～50%，按照Lipofectamine?RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染siRNA。用RT-qPCR法檢測siRNA的干擾效率，引物同前，每個(gè)樣本同時(shí)擴(kuò)增3個(gè)復(fù)管，并連續(xù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

表1 CCDC78 siRNA候選序列Table 1.Candidate sequences of CCDC78 siRNA

2.4 pLVX-shRNA2-Puro-shCCDC78慢病毒載體的構(gòu)建 （1）篩選得到的高效沉默CCDC78基因的siRNA為CCDC78_001（序列見表 1），相應(yīng)的CCDC78基因靶序列為5'-CCT ACA TGA GCA GCA TGA GGC-3'。（2）設(shè)計(jì)CCDC78_001的shRNA序列：上游為5'-GAT CCG CCT ACA TGA GCA GCA TGA GGC CTC GAG GCC TCA TGC TGC TCA TGT AGG TTT TTT G-3'，下游為 5'-AAT TCA AAA AAC CTA CAT GAG CAG CAT GAG GCC TCG AGG CCT CAT GCT GCT CAT GTA GGC G-3'?？寺≥d體pLVX-shRNA2-Puro的酶切位點(diǎn)為BamH I+EcoR I。（3）雙鏈CCDC78_001的制備：將表達(dá)CCDC78_001的上游序列和下游序列等體積混合后，煮沸5 min，自然冷卻至室溫。取pLVX-shRNA2-Puro載體行BamH I與EcoR I雙酶切，酶切產(chǎn)物與雙鏈CCDC78_001連接，構(gòu)建成pLVX-shRNA2-Puro-shCCDC78慢病毒載體。挑取酶切鑒定正確的陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序引物為U6-F（5'-TAC GAT ACA AGG CTG TTA GAG AG-3'）。

2.5 慢病毒包裝及滴度測定 將含有目的基因的慢病毒載體pLVX-shRNA2-Puro-shCCDC78及其陰性對(duì)照載體pLVX-shRNA2-Puro分別用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，產(chǎn)生高滴度慢病毒，分別稱為rLV-shRNA2-Puro-shCCDC78及其陰性對(duì)照rLV-shRNA2-Puro慢病毒。主要過程如下：將重組慢病毒載體及兩種輔助包裝質(zhì)粒（pHelper 1.0及pHelper 2.0載體）采用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；轉(zhuǎn)染后8 h更換為完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對(duì)其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，在293T細(xì)胞中測定并標(biāo)定病毒滴度，取最佳病毒滴度做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6 慢病毒感染SW480和HT29結(jié)腸癌細(xì)胞株 感染前24 h，取對(duì)數(shù)生長期的SW480和HT29細(xì)胞按每孔2×105接種于24孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后，細(xì)胞密度達(dá)40%～50%時(shí)，加入慢病毒及合適濃度的polybrene。實(shí)驗(yàn)分為shCCDC78組（感染rLV-shRNA2-Puro-shCCDC78的SW480和HT29細(xì)胞）及shNC組（感染rLV-shRNA2-Puro的SW480和HT29細(xì)胞）。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。感染12 h后棄上清液，更換為新鮮的完全培養(yǎng)液，72 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，挑選熒光強(qiáng)度大的陽性克隆孔逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，即可得到沉默CCDC78表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.7 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株CCDC78 mRNA表達(dá)的檢測 培養(yǎng)shCCDC78組和shNC組SW480細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，按TRIzol試劑盒說明抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測CCDC78的mRNA表達(dá)，引物同前。

2.8 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 常規(guī)培養(yǎng)shCCDC78組和shNC組SW480和HT29細(xì)胞，取生長狀態(tài)良好的2組細(xì)胞以每孔7×104接種于96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)孵育過夜，收集各個(gè)時(shí)點(diǎn)（24、48和72 h）的細(xì)胞，在避光條件下每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板放到培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，然后將96孔板中的培養(yǎng)液移至酶標(biāo)板中；酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度（A）。

2.9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移與侵襲 遷移實(shí)驗(yàn)主要步驟如下：培養(yǎng)上述2組細(xì)胞48 h后，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度，使每種細(xì)胞的密度為3×108/L；取細(xì)胞懸液100 μL加入Transwell小室，即每孔3×104個(gè)細(xì)胞，下室加入600 μL完全培養(yǎng)液；在37℃、5%CO2孵育24 h后，取出小室，棄去培養(yǎng)液，用棉簽擦去上室未遷移的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌3次并晾干，顯微鏡下觀察6個(gè)視野細(xì)胞并拍照計(jì)數(shù)。對(duì)于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，首先用Matrigel包被Transwell小室底部膜的上室面，置于37℃孵育30 min使Matrigel聚合成凝膠，使用前進(jìn)行基底膜水化，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間差異采用Student'st檢驗(yàn)，多組間差異采用單因素方差分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraghPad Prism 7作圖。

結(jié) 果

1 CRC患者預(yù)后相關(guān)基因篩選結(jié)果

從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載410例CRC組織樣本和30例癌旁組織樣本的RNA-Seq數(shù)據(jù)，使用DESeq2包進(jìn)行差異基因篩選，篩選出在CRC與癌旁組織之間有顯著差異表達(dá)的基因數(shù)目為4 017個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的基因有1 653個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有2 364個(gè)，見圖1。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，有69個(gè)基因與CRC患者預(yù)后差密切相關(guān)（P＜0.01），其中表達(dá)上調(diào)的基因有36個(gè)。這36個(gè)基因中有11個(gè)目前尚未在腫瘤研究中被報(bào)道，分別是ELFN1-AS1、CCDC78、PGGHG、AGAP3、DPP7、ADAMTSL2、TSPEAR、PCED1A、RNU6-403P、GABRD和BICDL1，見表2。其中RNU6-403P是一個(gè)假基因，而ELFN1-AS1是一個(gè)lncRNA[10]。因此，我們選擇其中表達(dá)上調(diào)倍數(shù)前3位的基因CCDC78、PGGHG和TSPEAR做進(jìn)一步研究。生存分析結(jié)果顯示，這3個(gè)基因高表達(dá)與患者生存期縮短顯著相關(guān)，見圖2。

Figure 1.Volcanic map of differentially expressed genes between colorectal cancer tissues and adjacent tissues.Padj：adjusted probability.Red dots represent significantly up-regulated genes，green dots represent significantly down-regulated genes，and black dots represent genes with insignificantly differential expression.圖1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織間差異表達(dá)基因的火山圖

表2 11個(gè)尚未在腫瘤研究中報(bào)道的表達(dá)上調(diào)基因Table 2.Eleven up-regulated genes not yet reported in cancer studies

2 CRC患者預(yù)后相關(guān)基因在CRC細(xì)胞株中呈高表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株HCoEpiC相比，3個(gè)上調(diào)基因（CCDC78、PGGHG和TSPEAR）的mRNA表達(dá)水平在人結(jié)腸癌細(xì)胞株中顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖3，其上調(diào)趨勢與TCGA數(shù)據(jù)庫中的RNAseq數(shù)據(jù)一致。于是，我們選擇表達(dá)上調(diào)倍數(shù)最大的CCDC78基因做進(jìn)一步研究。

Figure 2.Kaplan-Meier curves for overall survival time of the colorectal cancer patients with different CCDC78（A），PGGHG（B）and TSPEAR（C）expression levels.圖2 CCDC78、PGGHG和TSPEAR基因表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

Figure 3.Relative mRNA expression levels of CCDC7，PGGHG and TSPEAR in colon cancer cell lines（HCT116，SW620，SW480 and HT29）and normal colon epithelial cells（HCoEpiC）detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs HCoEpiC.圖3 結(jié)腸癌細(xì)胞和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中CCDC78、PGGHG和TSPEAR mRNA的表達(dá)水平

3 CCDC78基因在CRC組織中表達(dá)水平驗(yàn)證結(jié)果

RT-qPCR結(jié)果顯示，CCDC78 mRNA在CRC組織中的表達(dá)水平顯著高于配對(duì)癌旁組織（P＜0.01），見圖4。

4 沉默CCDC78表達(dá)顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞活力、侵襲與遷移

4.1 siCCDC78篩選結(jié)果 RT-qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CCDC78_001、CCDC78_002及CCDC78_003這 3對(duì)siRNA的SW480細(xì)胞中CCDC78 mRNA表達(dá)量均有不同程度的降低，其中100 nmol/L的CCDC78_001抑制效率最高，達(dá)69%（表3），因此將此siRNA用于后續(xù)研究。

4.2 pLVX-shRNA2-Puro-shCCDC78慢病毒載體構(gòu)建及其慢病毒包裝結(jié)果 將載體及兩種病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，顯示幾乎所有293T細(xì)胞均發(fā)出較亮的綠色熒光，采用倍比稀釋法檢測病毒滴度為1.0×1011TU/L。

4.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株CCDC78 mRNA表達(dá)水平 與shNC組相比，穩(wěn)定沉默CCDC78表達(dá)的shCCDC78組SW480細(xì)胞中CCDC78 mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），見圖5。

Figure 4.Relative CCDC78 mRNA expression level in colorectal cancer tissues and matched adjacent tissues was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=22.**P＜0.01 vs adjacent.圖4 結(jié)直腸癌組織和配對(duì)癌旁組織中CCDC78 mRNA的表達(dá)水平

表3 CCDC78 siRNA的篩選結(jié)果Table 3.Results of CCDC78 siRNA screening

4.4 沉默CCDC78對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞活力、遷移與侵襲的影響 與shNC組相比，shCCDC78組結(jié)腸癌細(xì)胞活力顯著降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P＜0.01），見圖6～8。這說明穩(wěn)定沉默CCDC78表達(dá)可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞活力、遷移和侵襲。

討 論

Figure 5.Relative CCDC78 mRNA expression level in SW480 cells with stable silencing of CCDC78 was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs shNC group.圖5 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中CCDC78 mRNA的表達(dá)水平

TCGA數(shù)據(jù)庫包含了海量的基因測序信息，包括基因組、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組和臨床資料等相關(guān)數(shù)據(jù)[11-12]。利用生物信息學(xué)分析工具，從中探尋腫瘤差異性表達(dá)基因，分析其與疾病的臨床相關(guān)性，可為惡性腫瘤生物標(biāo)志物和藥物靶標(biāo)的篩選提供重要線索。Hou等[13]利用TCGA中的379例CRC患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，通過共表達(dá)分析、基因互作網(wǎng)分析、生存分析等綜合分析方法確定了潛在的與CRC預(yù)后相關(guān)的因素，包括9個(gè)DNA甲基化位點(diǎn)、6個(gè)miRNA及11個(gè)mRNA；Yang等[14]利用TCGA數(shù)據(jù)庫交叉驗(yàn)證了 miR-15b、miR-215、miR-145、miR-192、let-7g等miRNA與CRC患者總體生存的相關(guān)性，顯示let-7g可以作為預(yù)測CRC患者預(yù)后的因子之一；Yang等[15]利用TCGA數(shù)據(jù)庫，經(jīng)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)SLC17A9可能在CRC的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，并可能作為CRC預(yù)后評(píng)估的獨(dú)立生物標(biāo)志物。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫中410例CRC樣本的RNA-Seq數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理方法，鑒定了69個(gè)與CRC患者預(yù)后差密切相關(guān)的基因，其中CCDC78是CRC患者顯著高表達(dá)的基因之一，CCDC78高表達(dá)與CRC患者生存期縮短顯著相關(guān)（P=0.002 07），目前在人類腫瘤研究中尚未見報(bào)道。由于TCGA數(shù)據(jù)庫中腫瘤標(biāo)本數(shù)據(jù)主要來自美國患者，我們采用RT-qPCR技術(shù)檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株（4個(gè)細(xì)胞株）及中國人CRC標(biāo)本（n=22）中CCDC78 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，結(jié)腸癌細(xì)胞株和CRC標(biāo)本中CCDC78的表達(dá)也顯著上調(diào)，與TCGA數(shù)據(jù)庫中的RNA-Seq數(shù)據(jù)一致，進(jìn)一步表明CCDC78基因異常表達(dá)參與CRC的發(fā)生發(fā)展。

Figure 6.CCDC78 gene silencing significantly inhibited the viability of SW480 and HT29 colon cancer cells.The cell viability was detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs shNC group.圖6 沉默CCDC78表達(dá)顯著抑制SW480和HT29結(jié)腸癌細(xì)胞的活力

Figure 7.CCDC78 gene silencing significantly inhibited the migration ability of SW480 and HT29 colon cancer cells.The migration ability was detected by Transwell assay.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs shNC group.圖7 沉默CCDC78表達(dá)顯著抑制SW480和HT29結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力

Figure 8.CCDC78 gene silencing significantly inhibited the invasion ability of SW480 and HT29 colon cancer cells.The invasion ability was detected by Transwell assay.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs shNC group.圖8 沉默CCDC78表達(dá)顯著抑制SW480和HT29結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力

CCDC78基因定位于16p13.3，是一個(gè)蛋白編碼基因，包含12個(gè)外顯子。CCDC78在肺、脾、腦、淋巴結(jié)、胃、大腸、小腸等24種人類組織中表達(dá)，其中在肺和脾高表達(dá)，在淋巴結(jié)、胃、大腸和小腸中等表達(dá)，在食管、肝臟和胰腺表達(dá)水平很低。CCDC78 mRNA（NM_001031737）長度為1 611 bp，CCDC78蛋白含有438個(gè)氨基酸。檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)顯示，CCDC78基因可能參與肌肉功能調(diào)節(jié)，其突變是導(dǎo)致先天性肌病的遺傳學(xué)病因之一[16]，未見CCDC78基因表達(dá)異常與人類腫瘤及其它疾病相關(guān)的報(bào)道，其詳細(xì)生理功能也尚不明確。CCDC78是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的基因，相關(guān)研究很少，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，我們未能找到與CCDC78蛋白完全匹配的商業(yè)化抗體，因此在本研究中未能進(jìn)行蛋白表達(dá)方面的實(shí)驗(yàn)，有待今后進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步探討CCDC78基因異常表達(dá)在CRC發(fā)生中的作用，我們采用RNA干擾技術(shù)，觀察敲減CCDC78基因表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株功能的影響。結(jié)果顯示，穩(wěn)定沉默CCDC78表達(dá)可顯著抑制SW480和HT29結(jié)腸癌細(xì)胞株的活力、遷移和侵襲。結(jié)合前述來自TCGA數(shù)據(jù)庫CRC標(biāo)本的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)，這些結(jié)果提示CCDC78可能是一個(gè)新的與CRC預(yù)后差相關(guān)的癌基因，抑制CCDC78表達(dá)有望成為CRC分子靶向治療的潛在新靶點(diǎn)。據(jù)我們所知，本研究是第一個(gè)有關(guān)CCDC78基因異常高表達(dá)與人類腫瘤（CRC）發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的報(bào)道。