季 丹，何曉剛，汪 剛，羅 濤，張 露，徐曉丹，徐曉軍，3，李菲菲△

（1安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽合肥230032；2安徽醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，安徽合肥230061；3安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，安徽合肥230022）

近年來(lái)，許多惡性疾病被認(rèn)為是免疫異常的結(jié)果，其中細(xì)胞因子和趨化因子作為重要的炎癥介質(zhì)，參與了腫瘤的發(fā)生與惡性轉(zhuǎn)化，涉及腫瘤細(xì)胞生物學(xué)的許多方面，包括監(jiān)管腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移以及宿主的免疫反應(yīng)[1-2]。單核細(xì)胞趨化蛋白 1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）也被稱(chēng)為CC趨化因子配體2（CC chemokine ligand 2，CCL2），其受體為CC趨化因子受體2（CC chemokine receptor 2，CCR2）。研究表明，MCP-1/CCR2信號(hào)途徑在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮招募和激活單核細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要作用[3]。新近文獻(xiàn)報(bào)道，MCP-1的分泌及其受體CCR2的表達(dá)與酒精導(dǎo)致的細(xì)胞毒性、免疫損傷及腫瘤侵襲性生長(zhǎng)相關(guān)[4]。乳腺癌作為女性發(fā)病率和致死率最高的惡性疾病，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜。流行病學(xué)調(diào)查表明，飲酒會(huì)以劑量依賴(lài)的方式增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[5-6]，但酒精促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制是否與MCP-1相關(guān)還有待進(jìn)一步闡明。本研究旨在觀察酒精促進(jìn)乳腺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移與趨化因子MCP-1/CCR2介導(dǎo)的腫瘤血管新生的關(guān)系。

材料和方法

1 主要材料和試劑

小鼠乳腺癌E0771細(xì)胞和人乳腺癌MDAMB231細(xì)胞由Dr.Enrico Mihich（Roswell Park Cancer Institute，Buffalo，NY）提供。DMEM培養(yǎng)基、纖維蛋白原、蛋白酶抑制劑、凝血酶和酒精購(gòu)自Sigma；抗MCP-1抗體和抗CCR2抗體購(gòu)自BD Biosciences；Cytodex 3微珠購(gòu)自Amersham Pharmacia Biotech；其它試劑材料為本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) E0771細(xì)胞用含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和0.25 mg/L兩性霉素B的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MDA-MB231細(xì)胞和小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞SVEC4-10EE2（SVEC）用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MDA-MB231細(xì)胞是具有侵襲性的乳腺癌細(xì)胞并且對(duì)酒精暴露敏感。用1 g/LⅠ型膠原酶使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelical cells，HUVEC）脫離新鮮的人類(lèi)胎盤(pán)，并于EGM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2.2 小鼠乳腺腫瘤移植瘤模型的建立 健康C57BL/6小鼠購(gòu)自江蘇集萃藥康生物有限公司，許可證號(hào)為SCXK（蘇）2018-0008。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分成2組，每組8只：（1）正常對(duì)照（control）組；（2）2%酒精（EtOH）組。其中，control組給予常規(guī)滅菌飲用水；EtOH組晚上8點(diǎn)到次日早上8點(diǎn)給予含2%酒精的飲用水，再換回常規(guī)滅菌飲用水，到晚上8點(diǎn)再換成2%酒精，依次循環(huán)。飲酒后1周進(jìn)行腫瘤細(xì)胞接種：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E0771細(xì)胞，胰酶消化，離心后用PBS或無(wú)胎牛血清的DMEM重懸，將細(xì)胞混勻，用1 mL無(wú)菌注射器抽取0.3 mL的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞皮下接種到C57BL/6小鼠下腹部第2乳腺處，每只小鼠接種0.1 mL的細(xì)胞懸液，即每只小鼠接種3.5×105個(gè)E0771細(xì)胞。細(xì)胞接種后，每2～3 d觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，并稱(chēng)重小鼠體重，于第21天處死小鼠，取瘤組織、稱(chēng)重固定，-80℃保存。

2.3 免疫組化和微血管密度檢測(cè) 從上述移植瘤標(biāo)本取癌組織和癌旁組織，按常規(guī)程序脫水、固定、切片制成組織切片。分別加Ⅰ抗[抗MCP-1、CCR2、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體]孵育后PBS清洗4次，Ⅱ抗孵育25 min后PBS清洗4次，然后顯色、封片、拍照。以每張切片超過(guò)10%腫瘤細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈棕黃色者，作為MCP-1和CCR2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。微血管密度（microvessel density，MVD）的測(cè)定：以PECAM-1（CD31）單抗染成鮮紅色的單個(gè)內(nèi)皮或內(nèi)皮細(xì)胞群作為一個(gè)微血管，在40倍鏡下選取5個(gè)血管豐富的視野，于100倍鏡下用北航CMIAS圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色陽(yáng)性血管進(jìn)行密度定標(biāo)。由計(jì)算機(jī)自動(dòng)求和并取平均值。

2.4 3D腫瘤細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng) HUVEC或SVEC被胰蛋白酶消化后（1×106）與Cytodex微珠（3×103）在4 mL培養(yǎng)基（HUVEC用EGM-2培養(yǎng)基，SVEC用DMEM培養(yǎng)基）中混合，加入50 mL離心管中?；旌衔镌?%CO2、37℃環(huán)境下孵育4 h，每隔20 min混勻一次。在孵育的第4 h，加入4 mL的培養(yǎng)基后繼續(xù)孵育4 h。然后將包被有內(nèi)皮細(xì)胞的微載體混合液轉(zhuǎn)移到25 mL的組織培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞不附著到微珠但附著在瓶體。第2天，將培養(yǎng)瓶輕輕沖洗后將混合液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，用不含Ca2+和Mg2+的PBS輕洗3遍，重懸于含有2.5 g/L纖維蛋白原和1.5×102U/L蛋白酶抑制劑的DMEM培養(yǎng)基中。在24孔板中加入0.625 U的凝血酶包被，再加入0.5 mL的微載體和纖維蛋白原溶液的混合液，室溫靜置凝結(jié)5 min，然后37℃、5%CO2孵育20 min。形成的纖維蛋白凝膠中內(nèi)皮細(xì)胞粘附在微珠上。每孔加入1 mL含1.5×102U/L蛋白酶抑制劑的培養(yǎng)基，使其與纖維蛋白凝塊平衡在37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。將24孔板內(nèi)培養(yǎng)基吸掉，加入1 mL含1.5×102U/L蛋白酶抑制劑的新鮮培養(yǎng)基，于37℃恒溫、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，5～96 h后4%多聚甲醛固定，鄰苯二甲酸二烯丙酯（diallyl phthalate，DAP）染色，觀察倒置顯微鏡下“出芽”（sprouts）的情況；對(duì)照組為不含腫瘤細(xì)胞的空白培養(yǎng)基模型。結(jié)果判斷：在規(guī)定觀察時(shí)點(diǎn)，每個(gè)培養(yǎng)孔在倒置顯微鏡下，隨機(jī)取3個(gè)視野，觀察“出芽”情況，計(jì)算出芽的微珠占總數(shù)的百分比（percentage of beads with sprouts）。

2.5 乳腺癌細(xì)胞酒精暴露實(shí)驗(yàn) 在培養(yǎng)基中添加酒精（95%酒精），稀釋至所需水平的酒精濃度（0.2%）。培養(yǎng)的細(xì)胞被放置在一個(gè)有密封蓋子的塑料容器中。在每個(gè)容器底部都有200 mL的水浴，水浴中酒精的濃度與培養(yǎng)基中相同。密封每個(gè)容器之前，注入60 mL CO2。將容器置于加濕的環(huán)境中，并維持在37℃、5%CO2環(huán)境中。用這種方法，培養(yǎng)基中的酒精濃度可以準(zhǔn)確地維持。

2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將Transwell小室插入培養(yǎng)板中，由一個(gè)孔徑為8 μm的膜分成一個(gè)上室和一個(gè)下室。上室接種SVEC（3×104）并用含2%胎牛血清的DMEM維持。下室充滿了含2%胎牛血清和不同濃度MCP-1（0.5和10 μg/L）的培養(yǎng)基。將小室放于37℃、5%CO2環(huán)境下孵育12 h。用甲醇固定膜，殘留在上室的細(xì)胞被除去。遷移的細(xì)胞吉姆薩染色并計(jì)數(shù)，每個(gè)孔選擇5個(gè)隨機(jī)的鏡下視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)孔得到3個(gè)視野的平均數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 10.0軟件進(jìn)行。

結(jié) 果

1 MCP-1和CCR2在飲酒的乳腺癌移植腫瘤小鼠的癌組織中高表達(dá)且與血管新生指標(biāo)相關(guān)

小鼠乳腺癌組織免疫組化染色結(jié)果顯示，MCP-1和CCR2在腫瘤組織中均呈陽(yáng)性表達(dá)，在飲酒小鼠組織中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖1A，且與微血管標(biāo)志物PECAM-1和VEGF表達(dá)水平正相關(guān)，見(jiàn)圖1B。微血管計(jì)數(shù)顯示，飲酒組小鼠腫瘤組織中微血管密度顯著高于非飲酒的對(duì)照組腫瘤組織（P＜0.05），見(jiàn)圖1C。

2 成功建立乳腺癌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)3D血管生成模型

在乳腺癌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中內(nèi)皮細(xì)胞附著在Cytodex微珠表面生長(zhǎng)，形成一個(gè)3D毛細(xì)管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表明血管生成。如圖2A所示，SVEC附著Cytodex微珠從微珠發(fā)芽形成短而狹窄的條索狀結(jié)構(gòu)。在這個(gè)系統(tǒng)中加入乳腺癌細(xì)胞（2×104或4×104E0771細(xì)胞）共培養(yǎng)可以明顯增加了SVEC“出芽”的數(shù)量和長(zhǎng)度：SVEC單獨(dú)培養(yǎng)的“出芽”率為57.2%，SVEC和E0771共培養(yǎng)的“出芽”率顯著提高（P＜0.05）；然而，高密度的E0771細(xì)胞（4×104）并沒(méi)有進(jìn)一步增加出芽，表明適宜的腫瘤細(xì)胞數(shù)更能促進(jìn)血管新生，見(jiàn)圖2B。

3 MCP-1可以通過(guò)其受體CCR2促進(jìn)腫瘤血管生成

為了研究MCP-1是否直接參與腫瘤血管生長(zhǎng)，我們利用三維血管生成的體外模型，共培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞（乳腺癌細(xì)胞E0771或MDAMB231），觀察在MCP-1直接誘導(dǎo)下，微載體表面的血管生成情況。結(jié)果顯示：E0771或MDA-MB231細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，都可見(jiàn)明顯的內(nèi)皮細(xì)胞出芽式血管生成（E0771組68%，MDA-MB231組70%）；然后，在內(nèi)皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系里加入在MCP-1誘導(dǎo)以代替腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)，同樣觀察到了微載體表面有大量微血管形成（兩組分別為65.3%與69.7%），與誘導(dǎo)前的對(duì)照組相比顯著增多（P＜0.01）；而使用MCP-1受體CCR2的抑制劑（CCR2 antagonist，CCR2 AT）處理后，血管生成分別降至52.7%和51.9%，與MCP-1誘導(dǎo)組相比顯著減少（P＜0.05），見(jiàn)圖3。由此可見(jiàn)，MCP-1不僅直接誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成微血管的能力，并且是為血管形成所必需的因子之一。

Figure 1.Analysis of MCP-1，CCR2 and angiogenesis of the breast cancer tissues in mice between ethanol consumption group（EtOH）and control group（Con）.A：immunohistochemical staining of MCP-1 and CCR2 in breast tumor tissues（×100）；B：immunohistochemical staining of PECAM（CD31）and VEGF in breast tumor tissue（×100）C：effect of ethanol on microvessel density（MVD）of E0771 transplanted tumor tissues.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs control group.圖1 MCP-1和CCR2的組織表達(dá)與微血管分布的相關(guān)性

Figure 2.Sprouts and new micro-vessels formation in three-dimensionalin culture models of SVEC and Cytodex in fibrin medium.A：sprouts were observed on the beats surface as shown in red arrows per 24 h；B：sprouts were counted at 72 h after co-cultured in 3D medium.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs SVEC group.圖2 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SVEC、Cytodex微載體及E0771細(xì)胞在Fibrin膠中3D共培養(yǎng)時(shí)新生血管生成的情況

Figure 3.MCP-1 can increase angiogenesis in vitro.E0771 or MB231 were co-cultured with SVEC pre-beaded with cytodex in 3D angiogenesis system.Then cells were treated with MCP-1 or MCP-1 antagonist.After 96 h，besds with sprouts were counted under microscope.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs tumor cell group and MCP-1 group.圖3 MCP-1在體外誘導(dǎo)腫瘤血管生成

4 CCR2抑制劑可以特異性阻斷酒精誘導(dǎo)的腫瘤血管生成

我們?cè)谀[瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞三維共培養(yǎng)體系中加入MCP-1受體拮抗劑，觀察對(duì)血管生成的影響。結(jié)果顯示：內(nèi)皮細(xì)胞SVEC4-10-EE2單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，無(wú)論加入酒精與否，都未見(jiàn)有明顯的“出芽”。在與E0771共培養(yǎng)后，微載體表面形成較多的微血管樣結(jié)構(gòu)，加入0.2%的酒精刺激后，微血管結(jié)構(gòu)進(jìn)一步增多（P＜0.05）。在使用CCR2AT后，無(wú)論有無(wú)酒精刺激，血管生成均明顯受到抑制（P＜0.01），見(jiàn)圖4。由此可見(jiàn)，當(dāng)CCR2生物學(xué)效應(yīng)被阻斷時(shí)，酒精加速的血管生成的誘導(dǎo)腫瘤效應(yīng)明顯減弱，酒精相關(guān)乳腺腫瘤血管生成與MCP-1/CCR2信號(hào)密切相關(guān)。

5 MCP-1/CCR2過(guò)增加內(nèi)皮細(xì)胞遷移促進(jìn)血管新生

血管生成是由內(nèi)皮細(xì)胞的活化調(diào)節(jié)的，包括內(nèi)皮細(xì)胞的增殖增加或遷移兩種主要形式。為了進(jìn)一步了解MCP-1/CCR2途徑究竟通過(guò)何種機(jī)制來(lái)促進(jìn)血管新生，我們觀察檢測(cè)了MCP-1/CCR2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響。結(jié)果顯示，MCP-1并不能引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；但是通過(guò)遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5 ng和10 ng計(jì)量的MCP-1均可以顯著刺激內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，而這種遷移被CCR2拮抗劑阻斷（P＜0.01），見(jiàn)圖5B。以上結(jié)果說(shuō)明MCP-1/CCR2信號(hào)途徑是通過(guò)增加血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移來(lái)促進(jìn)血管新生的。

Figure 4.CCR2 antagonist inhibited tumor angiogenesis with or without Ethanol in vitro.A：morphologic change of tumor angiogenesis after treatment of CCR2 antagonist with or without ethanol in vitro；B：statistics of beads with sprouts in different groups.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control，**P＜0.01 vs control and 0.2%EtOH groups.TC：tumor cell；EC：endothelial cell.圖4 CCR2阻斷劑CCR2AT可以抑制體外腫瘤血管新生

Figure 5.The effects of MCP-1/CCR2 on HUVEC proliferation and migration.A：MCP-/CCR2 didn’t affect HUVEC proliferation；B：MCP-1 promted HUVEC migration.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；**P＜0.05 vs MCP-1 group.圖5 MCP-1/CCR2途徑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移直接影響

討 論

在腫瘤新生血管的來(lái)源中，其中一個(gè)重要理論就是認(rèn)為腫瘤細(xì)胞自身分泌的多種細(xì)胞因子可以活化內(nèi)皮細(xì)胞，從而刺激其增殖或遷移，形成新的脈管結(jié)構(gòu)[7]。在本研究中我們通過(guò)使用3D腫瘤-內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型，來(lái)評(píng)估酒精是否能刺激腫瘤細(xì)胞，引起腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)血管新生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在這個(gè)3D系統(tǒng)中加入乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)一段時(shí)間，明顯刺激了血管生成，在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步研究證明了酒精的刺激可以增強(qiáng)此種血管新生作用，其作用機(jī)制是與MCP-1相關(guān)，當(dāng)使用MCP-1抑制劑或者其受體CCR2抑制劑，血管新生效應(yīng)大大受到抑制。

MCP-1是炎癥領(lǐng)域單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的一個(gè)強(qiáng)有力的趨化因子，并且參與感染性疾病、腫瘤發(fā)生發(fā)展[8-9]。MCP-1在正常乳腺上皮導(dǎo)管細(xì)胞中極少表達(dá)，但在乳腺癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)[10]。已經(jīng)有大量研究表明MCP-1是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要促進(jìn)因子。它介導(dǎo)的親腫瘤活性可能與以下因素有關(guān)：（1）刺激有害的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM）的增加，從而抗腫瘤T細(xì)胞活性的抑制；（2）增加腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞之間的相互適應(yīng)，起到促腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移作用；（3）對(duì)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲特性直接增加[11-13]。

此外，近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)MCP-1也是一種促血管生成因子，它可以通過(guò)增加TAM的活性，通過(guò)TAM促進(jìn)血管生成因子VEGF等分泌，從而促進(jìn)血管新生[14]。乳腺腫瘤在發(fā)生發(fā)展中血管新生密度顯著增加，在飲酒患者中尤為顯著，那MCP-1是否能通過(guò)酒精作用，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的呢？本研究結(jié)果證實(shí)，外源的MCP-1可以直接促進(jìn)腫瘤血管新生作用，這種作用可能是通過(guò)腫瘤細(xì)胞分泌MCP-1，介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移來(lái)實(shí)現(xiàn)的。使用MCP-1受體拮抗劑CCR2 AT能有效抑制了酒精處理過(guò)的乳腺癌細(xì)胞促血管生成作用；在沒(méi)有MCP-1刺激時(shí)，同培養(yǎng)體系也能出現(xiàn)大量新生血管，但是如果用CCR2抑制劑則可以大大阻斷這一效應(yīng)，提示乳腺癌細(xì)胞可能以旁分泌的方式產(chǎn)生MCP-1，通其受體CCR2介導(dǎo)酒精暴露刺激下的腫瘤血管新生。

酒精介導(dǎo)的血管生成和促腫瘤機(jī)制非常復(fù)雜，可能涉及多種參與者和調(diào)節(jié)者。除了其他潛在途徑，本研究闡明了MCP-1在酒精誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)和腫瘤生長(zhǎng)中的作用及其調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。