王振杰，柴 琳，徐 冉，張根葆，3

（皖南醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)教研室，2口腔醫(yī)學(xué)院，3蛇毒蛇傷研究所，安徽蕪湖241001）

口腔鱗癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，多數(shù)為舌鱗癌[1-2]。舌部血運豐富導(dǎo)致舌鱗癌細胞生長快，浸潤性強，易轉(zhuǎn)移[3]。雖然舌鱗癌的治療方法在不斷發(fā)展，但患者的5年生存率僅為55%左右[4]，且各種治療方法都有不同程度的不良反應(yīng)。因此，尋求一種安全、高效、廉價的治療方式對舌鱗癌患者具有重要的意義。

蛇毒為我國豐富的天然藥用資源，具有降壓、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血栓、抗腫瘤等作用[5]，其中的抗腫瘤作用仍是目前研究的熱點。尖吻蝮蛇毒抑瘤組分I（anti-tumor component I fromAgkistrodon acutusvenom，AAVC-I）是由皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒蛇傷研究所利用蛋白分離純化技術(shù)從皖南尖吻蝮蛇毒中提取的一種活性成分[6]，對肺癌、白血病等[7-10]多種腫瘤細胞具有抑制增殖和促進凋亡的作用。但AAVC-I具體是如何誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡目前尚未完全明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介導(dǎo)的細胞凋亡途徑是近些年發(fā)現(xiàn)的一種獨立于死亡受體和線粒體途徑的新凋亡通路[11-12]，而其中的蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）/真核翻譯起始因子 2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）通路最為關(guān)鍵。因此，本實驗基于ERS相關(guān)的PERK/eIF2α通路探討AAVC-I對人舌鱗癌Tca8113細胞凋亡的影響，為尋找蛇毒抗腫瘤作用靶點的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 細胞

人舌鱗癌Tca8113細胞于2014年10月購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，由皖南醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室凍存保留。

2 主要藥品試劑

胎牛血清（廣州鴻泉生物科技有限公司，批號：180809）；DMEM 高糖細胞培養(yǎng)液（Gibco，批號：8118392）；0.25%胰蛋白酶溶液（批號：J150003）和PBS（批號：NAG1434）購自 HyClone；AAVC-I（皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒蛇傷研究所提供）；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（編號：C0009）、HE染色試劑盒（編號：C0105）和BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型，編號：P0010S）均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；4%組織細胞固定液（合肥睿捷生物科技有限公司，批號：7J21BL014）；annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司，批號：BB19061）；RIPA組織/細胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20180809）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒（編號：BL522A）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠蛋白上樣緩沖液（5×，編號：BL502A）和聚偏二氟乙烯膜（編號：BSPVDF-45）均購自 BioSharp；PageRuler? Prestained Protein Ladder（ThermoFisher，批號：00505780）；Ⅰ抗[葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）兔單克隆抗體（貨號：3177T）、p-PERK兔單克隆抗體（貨號：3179S）、p-eIF2α兔單克隆抗體（貨號：3398T）、活化轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）兔單克隆抗體（貨號：11815S）、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancerbinding protein homologous protein，CHOP）兔單克隆抗體（貨號：5554T）、Bax兔單克隆抗體（貨號：5023T）、Bcl-2兔單克隆抗體（貨號：4223T）和GAPDH兔單克隆抗體，貨號：4970T）]和Ⅱ抗（辣根過氧物酶標記的山羊抗兔IgG，貨號：7074P2）均購自 Cell Signaling Technology；ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate（Millipore，批號 ：1722101）。

3 主要實驗儀器

CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，型號：311）；酶標儀（Tecan Austria GmbH，型號：Sunrise）；流式細胞儀（BD，型號：FACSVerse）；電泳和轉(zhuǎn)模系統(tǒng)（Bio-Rad，型號：PowerPacTMBasic）；凝膠成像儀（Bio-Rad，型號：Universal Hood II）。

4 實驗方法

4.1 細胞培養(yǎng) 在5%CO2、37℃恒溫恒濕的細胞培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)Tca8113細胞，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

4.2 MTT法檢測AAVC-I對Tca8113細胞活力的影響 取對數(shù)生長期的Tca8113細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化離心去上清后，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液制備細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×107/L。按每孔200 μL細胞懸液的量均勻接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，然后將其于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，去除孔內(nèi)原有培養(yǎng)液，加入100 μL含10%胎牛血清和不同濃度（2.0、4.0、8.0、16.0和24.0 mg/L）AAVC-I的DMEM高糖培養(yǎng)液，同時設(shè)置空白對照（blank control）組和正常對照（normal control）組，每組各6個復(fù)孔，將其繼續(xù)于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后向每孔內(nèi)加入10 μL濃度為5 g/L的MTT，再于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。4 h后再向每孔內(nèi)加入100 μL的formazan溶解液，適當混勻。最后在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育至formazan全部溶解，于酶標儀570 nm波長測定每孔吸光度（A）并計算細胞生長抑制率（inhibitory rate，IR）。公式如下：IR（%）=[1-（藥物濃度組平均A值-空白對照組平均A值）/（正常對照組平均A值-空白對照組平均A值）]×100%。

4.3 HE染色觀察AAVC-I對Tca8113細胞形態(tài)的影響 收集對數(shù)生長期的Tca8113細胞制備細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為2×107/L。按每孔3 mL細胞懸液的量將細胞均勻接種到6孔細胞培養(yǎng)板中，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，去除孔內(nèi)原有培養(yǎng)液，每孔加入3 mL含10%胎牛血清和不同濃度AAVC-I的DMEM高糖培養(yǎng)液，同時設(shè)置正常對照組；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)板，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS液輕輕清洗每孔2遍，加入4%組織細胞固定液2 mL固定細胞30 min；去除固定液，用PBS清洗每孔2遍，加入1 mL蘇木素染液染色5 min；吸去蘇木素染液并用單蒸水流水沖洗每孔2 min；向每孔加入1 mL伊紅染液染色1 min；單蒸水流水沖洗每孔1 min；最后于倒置顯微鏡下鏡檢拍照。

4.4 annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡 密度為2×107/L的對數(shù)生長期Tca8113細胞懸液按每孔3 mL接種到6孔板中。培養(yǎng)24 h細胞貼壁后去除孔內(nèi)原有培養(yǎng)液并加入實驗濃度的AAVC-I，每孔3 mL，同時設(shè)置正常對照組繼續(xù)培養(yǎng)24 h；收集每孔上清液中的細胞和胰酶消化的貼壁細胞于相對應(yīng)10 mL離心管中，4℃、500×g離心5 min，棄上清；用預(yù)冷的PBS洗滌細胞沉淀，再4℃、300×g離心5 min，棄上清液，每支離心管加入400 μL的annexin V結(jié)合液（1×）重懸細胞；每支離心管加入5 μL的FITC染色液，輕輕混勻，于4℃避光條件下孵育15 min；每支離心管再加入10 μL的PI染色液，輕輕混勻，于4℃避光條件下孵育5 min；最后用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，使用FlowJo 10.0.7軟件分析細胞凋亡情況。

4.5 Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達量 取密度為2×107/L的對數(shù)生長期Tca8113細胞懸液按每孔3 mL接種到6孔板中。24 h細胞貼壁后去除孔內(nèi)原有培養(yǎng)液并加入實驗濃度的AAVC-I，每孔3 mL，同時設(shè)置正常對照組繼續(xù)培養(yǎng)24 h；吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液加入冷PBS液輕輕清洗每孔2遍，清洗后再向每孔加入RIPA細胞裂解液（含1%的PMSF）200 μL；把6孔板置于冰上輕輕刮下孔內(nèi)細胞使其與細胞裂解液充分接觸。待細胞充分裂解后收集孔內(nèi)總蛋白液于1.5 mL離心管內(nèi)，4℃、12 000×g離心5 min；收集離心管內(nèi)總蛋白上清液于新的1.5 mL離心管內(nèi)，并用BCA法測定總蛋白濃度，然后加入相應(yīng)量的5×蛋白上樣緩沖液，沸水中煮10 min使蛋白充分變性。取相同質(zhì)量變性后的總蛋白液行SDS-PAGE分離；然后把凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上；轉(zhuǎn)膜后用5%的牛血清白蛋白室溫下對膜進行封閉1.5 h；對封閉完成的膜于4℃搖床上孵育Ⅰ抗過夜，Ⅰ抗孵育結(jié)束后用TBST液洗膜3次（每次5 min）；加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，Ⅱ抗孵育結(jié)束后再次用TBST洗膜3次（每次5 min）；在膜上滴加化學(xué)發(fā)光劑于凝膠成像儀上曝光顯影；最后利用圖像分析軟件Image Lab 5.2.1對條帶進行分析。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多組間比較差異比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異t檢驗（LSD-t），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AAVC-I對Tca8113細胞活力的抑制作用

不同濃度的AAVC-I處理Tca8113細胞24 h，MTT法檢測結(jié)果顯示，隨著AAVC-I濃度（2.0、4.0、8.0、16.0和24.0 mg/L）的增加，細胞抑制率逐漸升高，AAVC-I各濃度組與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。AAVC-I處理Tca8113細胞24 h的IC50為17.69 mg/L（圖1），故選擇4.0、8.0和16.0 mg/L作為AAVC-I的實驗濃度。

2 AAVC-I對Tca8113細胞形態(tài)的影響

實驗濃度的AAVC-I作用Tca8113細胞24 h，對細胞進行HE染色可以明顯觀察到細胞的形態(tài)變化。正常對照組細胞的胞核經(jīng)蘇木素染成藍紫色，胞質(zhì)經(jīng)伊紅染成粉紅色，細胞飽滿呈良好的貼壁生長狀態(tài)，形態(tài)多為梭形或不規(guī)則多邊形；隨著AAVC-I實驗濃度的增加，實驗組細胞逐漸皺縮變小，細胞間隙增大，其中AAVC-I（16 mg/L）組大部分細胞胞膜消失，僅看到染色加深呈固縮狀態(tài)的胞核，并且出現(xiàn)大量的細胞碎片和凋亡小體，見圖2。

表1 AAVC-I對Tca8113細胞活力的影響Table 1.Inhibitory effect of AAVC-I on viability of Tca8113 cells（Mean±SD.n=6）

Figure 1.Inhibitory effect of AAVC-I on viability of Tca8113 cells.圖1 AAVC-I對Tca8113細胞活力的影響

Figure 2.Effects of AAVC-I on morphological changes of Tca8113 cells（HE staining）.圖2 AAVC-I對Tca8113細胞形態(tài)的影響

3 AAVC-I對Tca8113細胞凋亡的影響

實驗濃度的AAVC-I處理Tca8113細胞24 h后，用annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，正常對照組細胞凋亡率為（2.27±0.36）%，AAVC-I（4.0 mg/L）組凋亡率為（11.04±2.03）%，AAVC-I（8.0 mg/L）組凋亡率為（18.71±0.71）%，AAVC-I（16.0 mg/L）組凋亡率為（35.50±2.26）%，AAVC-I各濃度組的細胞凋亡率較正常對照組顯著升高（P＜0.05），且各濃度組的細胞凋亡率之間差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

4 AAVC-I對Tca8113細胞相關(guān)蛋白表達的影響

實驗濃度的AAVC-I處理Tca8113細胞24 h后，Western blot法檢測了ERS相關(guān)蛋白GRP78、PERK/eIF2α通路中的p-PERK和p-eIF2α、PERK/eIF2α通路下游的ATF4和CHOP，以及細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，AAVC-I各濃度組 GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP和Bax表達上調(diào)，Bcl-2表達下調(diào)（P＜0.05），且AAVC-I各濃度組的蛋白表達水平之間的差異同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4～6。

討 論

臨床治療腫瘤以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡為有效策略之一[13]，其中，細胞凋亡實驗是一種評價和篩選抗腫瘤藥物快捷有效的方法[14]。ERS介導(dǎo)的細胞凋亡是近年來抗腫瘤藥物研發(fā)的重要靶點[15]。研究表明，ERS介導(dǎo)的細胞凋亡通路是促進人白血病細胞、人肝癌細胞、人肺癌細胞等多種腫瘤細胞凋亡的有效途徑[16-18]。本實驗室基于ERS相關(guān)的PERK/eIF2α信號通路，進一步研究AAVC-I促人舌鱗癌Tca8113細胞凋亡的機制。

Figure 3.Effect of AAVC-I on apoptosis of Tca8113 cells.The apoptosis of the Tca8113 cells treated with AAVC-I for 24 h was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs AAVC-I（4.0 mg/L）group；△P＜0.05 vs AAVC-I（8.0 mg/L）group.圖3 AAVC-I對Tca8113細胞凋亡的影響

Figure 4.The protein levels of GRP78，p-PERK and p-eIF2α in Tca8113 cells treated with different concentrations of AAVC-I.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs AAVC-I（4.0 mg/L）group；△P＜0.05 vs AAVC-I（8.0 mg/L）group.圖4 AAVC-I對Tca8113細胞GRP78、p-PERK和p-eIF2α蛋白水平的影響

Figure 5.The protein expression levels of ATF4 and CHOP in Tca8113 cells treated with different concentrations of AAVC-I.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs AAVC-I（4.0 mg/L）group；△P＜0.05 vs AAVC-I（8.0 mg/L）group.圖5 AAVC-I對Tca8113細胞ATF4和CHOP蛋白表達水平的影響

Figure 6.The protein expression levels of Bax and Bcl-2 in Tca8113 cells treated with different concentrations of AAVC-I.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs normal control group；#P＜0.05 vs AAVC-I（4.0 mg/L）group；△P＜0.05 vs AAVC-I（8.0 mg/L）group.圖6 AAVC-I對Tca8113細胞Bax和Bcl-2蛋白表達水平的影響

本實驗首先應(yīng)用MTT法檢測不同濃度的AAVCI對人舌鱗癌Tca8113細胞活力的抑制作用。結(jié)果顯示，在AAVC-I處理Tca8113細胞24 h后，隨著濃度的增加，AAVC-I對細胞活力的抑制作用逐漸增強；另外，根據(jù)IC50值確定AAVC-I的合適實驗濃度，繼續(xù)作用細胞24 h，HE染色結(jié)果可以直接觀察到細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。在AAVC-I作用肺癌、白血病等[7-10]腫瘤細胞的既往研究表明，AAVC-I在抑制腫瘤細胞增殖的同時也誘導(dǎo)細胞的凋亡，與本文結(jié)果一致，且本實驗采用annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡水平的結(jié)果進一步顯示了AAVC-I誘導(dǎo)Tca8113細胞凋亡的作用呈劑量依賴性。相關(guān)文獻報道，細胞凋亡主要是由于抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白的平衡失衡而導(dǎo)致的，其中Bcl-2蛋白家族在當中起著重要作用[19-21]。我們應(yīng)用Western blot檢測顯示，在AAVC-I誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡時促凋亡蛋白Bax的表達水平升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平降低。有研究證實，在ERS誘導(dǎo)細胞凋亡的過程中，過表達的CHOP蛋白會引起B(yǎng)cl-2蛋白家族的失衡而導(dǎo)致細胞凋亡[22-23]。本實驗結(jié)果也顯示，隨著AAVC-I濃度的增加，細胞凋亡率逐漸上升，CHOP蛋白的表達水平也隨之升高。在這一過程中，當AAVC-I誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡時，我們又進一步檢測了ERS標志性蛋白GRP78的表達量，結(jié)果顯示其表達水平亦升高。有研究發(fā)現(xiàn)，ERS標志性蛋白GRP78在細胞發(fā)生ERS時表達量顯著增加，進而減緩ERS對細胞的損傷，同時GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK解離，導(dǎo)致PERK蛋白激活自身磷酸化，磷酸化的PERK會進一步導(dǎo)致eIF2α蛋白磷酸化以抑制蛋白質(zhì)的合成，從而減少錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聚集，有助于恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[24-25]。本實驗同樣觀察到AAVC-I各濃度組的磷酸化PERK和磷酸化eIF2α蛋白水平均高于正常對照組，同時ATF4蛋白水平也升高。ATF4蛋白是ERS相關(guān)的PERK/eIF2α通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子，持續(xù)ERS時磷酸化的eIF2α蛋白會導(dǎo)致ATF4蛋白合成大量增加并與CHOP基因啟動子結(jié)合使CHOP蛋白大量表達，最終引起細胞凋亡[26-27]。國內(nèi)外研究表明，敲除CHOP基因和在缺氧條件下發(fā)生的ERS中沉默PERK基因，均可顯著抑制細胞凋亡[28-29]。這進一步佐證了本研究的結(jié)果。

在之前的蛇毒抗腫瘤研究中，我們只是針對蛇毒抗腫瘤效應(yīng)進行簡單研究分析[7-10]，而本實驗在蛇毒抗腫瘤效應(yīng)的基礎(chǔ)上進一步探討其誘導(dǎo)凋亡的機制，表明AAVC-I在誘導(dǎo)人舌鱗癌Tca8113細胞凋亡時ERS相關(guān)的PERK/eIF2α通路發(fā)揮著重要作用，這為蛇毒抗腫瘤的機制提供了實驗依據(jù)。但還需注意的是，由于蛇毒成分復(fù)雜，純化技術(shù)難度大，蛇毒促腫瘤細胞凋亡的ERS相關(guān)PERK/eIF2α通路機制是否與其它促凋亡機制之間存在聯(lián)系等問題還有待深入研究。

同時，細胞系作為體外模型而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究。不同細胞系之間可能存在交叉污染，其中最為常見的是多種細胞系受到HeLa細胞污染[30-32]，而本研究中所用到的人舌鱗癌Tca8113細胞也不能排除受到HeLa細胞的污染[33]，但本教研室對蛇毒抗多種腫瘤細胞的大量研究證實，蛇毒抑制腫瘤細胞增殖及促進凋亡的作用是值得肯定的。