王媛媛，張奕霞，羅遠(yuǎn)湘，趙新榮，高云仙，楊 煒

0引言

青光眼是全球不可逆失明的首位原因[1]。2020年全球青光眼患者約7600萬(wàn)，預(yù)計(jì)到2040年將增至1.118億[2]。原發(fā)性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma，PACG)是我國(guó)致盲眼病之一，哈薩克族是新疆第二大少數(shù)民族，2006年李宏科等[3]對(duì)哈薩克族門診首診病例進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，哈薩克族青光眼發(fā)病以閉角型青光眼為主，占比約72%，急性閉角型青光眼患者及時(shí)就診率較低，慢性青光眼患者在發(fā)病早期缺乏足夠重視，單眼青光眼失明病例占29%，雙眼青光眼失明病例占51%，明顯高于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)青光眼失明率。加之新疆哈薩克族大多居住在邊遠(yuǎn)牧區(qū)，患者對(duì)青光眼認(rèn)識(shí)不足，直至病情嚴(yán)重影響日常生活才到醫(yī)院就診檢查，往往需要實(shí)行手術(shù)治療[4]。

小梁切除術(shù)是目前治療PACG的經(jīng)典手術(shù)方式[5-6]，其目的是制作一個(gè)鞏膜瓣，通過(guò)切除鞏膜小梁組織，使房水從前房流入球結(jié)膜下，房水的水流受機(jī)械應(yīng)力的影響積蓄在術(shù)區(qū)結(jié)膜下，構(gòu)成有功能濾過(guò)泡。此過(guò)程涉及復(fù)雜的動(dòng)態(tài)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，手術(shù)破壞血-房水屏障，損傷球結(jié)膜、鞏膜等周邊組織，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，從而釋放出轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β2)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)-1等因子，促使成纖維細(xì)胞(Tenon’s capsule fibroblasts，Tfb)遷移至損傷處分化為肌纖維細(xì)胞，最終導(dǎo)致濾過(guò)泡瘢痕形成[7-8]。當(dāng)濾過(guò)通道受阻，可使有功能濾過(guò)泡損傷，導(dǎo)致其塌陷、扁平進(jìn)而使眼壓控制不佳[9]。青光眼小梁切除術(shù)后2a內(nèi)復(fù)發(fā)率為15%～30%[10]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2在濾過(guò)泡纖維瘢痕化形成過(guò)程中起重要作用，被公認(rèn)為是濾過(guò)瘢痕、傷口愈合和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成的關(guān)鍵中介[11-12]。目前有關(guān)哈薩克族PACG患者術(shù)后臨床隨訪研究甚少。本研究通過(guò)檢測(cè)漢族與哈薩克族PACG患者房水與小梁網(wǎng)中TGF-β2水平差異，探討其對(duì)PACG術(shù)后濾過(guò)泡瘢痕形成及濾過(guò)泡形態(tài)的影響，旨在為漢族與哈薩克族PACG患者小梁切除術(shù)后的臨床隨訪結(jié)果提供理論依據(jù)。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象前瞻性研究。選取2018-07/2019-04在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科就診的PACG患者46例49眼，年齡40～85歲，漢族患者25例26眼，其中男11例，女14例，平均年齡65.650±9.529歲；哈薩克族患者21例23眼，其中男5例，女16例，平均年齡59.910±10.996歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合PACG的診斷標(biāo)準(zhǔn)，Goldmann眼壓計(jì)壓平記錄的眼內(nèi)壓>21mmHg，房角鏡下檢查房角粘連≥1/2，存在視野缺損、視盤改變(篩板變薄，視杯加深)；(2)擬首次行小梁切除術(shù)的漢族或哈薩克族患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)繼發(fā)性青光眼，如晶狀體源性青光眼、新生血管性青光眼、虹膜睫狀體炎繼發(fā)青光眼等；(2)原發(fā)性開(kāi)角型青光眼、先天性或發(fā)育性青光眼；(3)合并視網(wǎng)膜或視神經(jīng)疾??；(4)既往有內(nèi)眼手術(shù)史者。漢族和哈薩克族患者性別構(gòu)成比、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.051，P=0.152；t=1.958，P=0.056)。本研究通過(guò)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，所有患者及其家屬均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1樣本采集所有患者均由同一位具有豐富臨床經(jīng)驗(yàn)的術(shù)者行鞏膜下小梁切除術(shù)。結(jié)膜下注射利多卡因局部麻醉，懸吊上直肌，打開(kāi)穹窿部結(jié)膜，制作結(jié)膜瓣，充分暴露手術(shù)區(qū)域的角鞏膜部分，以此為基底做3mm×4mm梯形鞏膜瓣至角膜緣，沿結(jié)膜切口向后及向兩側(cè)盡量分離球周間隙，顳側(cè)角膜緣11 ∶ 00位進(jìn)針做前房穿刺，抽取房水0.1mL，后進(jìn)行小梁切除1mm×2mm，做周邊虹膜切除，縫合鞏膜，適當(dāng)調(diào)節(jié)切口松緊度，由側(cè)穿口注入前房灌注液，仔細(xì)觀察鞏膜瓣水密性、前房的穩(wěn)定性，隨后將結(jié)膜瓣對(duì)合，并用8-0可吸收縫線將兩端結(jié)膜縫合固定在角膜緣處。抗生素沖洗結(jié)膜囊，涂抗生素及阿托品眼膏，包扎術(shù)眼。術(shù)中均不使用5-氟尿嘧啶(5-FU)、絲裂霉素(MMC)干預(yù)。術(shù)中抽取房水0.1mL，4 000g離心20min，取上清液置于Eppendorf管中，-80℃凍存?zhèn)溆?；術(shù)中采集小梁組織，立即常溫下4%多聚甲醛液中固定24h備用。

1.2.2免疫組化法檢測(cè)小梁組織中TGF-β2表達(dá)術(shù)中取下小梁組織后立即放入4%多聚甲醛液中固定24h，常規(guī)石蠟包埋切片、烤片、抗原修復(fù)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用常規(guī)方法，分步滴加TGF-β2一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)19999-1-AP)，工作濃度1 ∶ 100，4℃濕盒中孵育過(guò)夜(15h)。PBS 漂洗3min×3次，滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠二抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)BA1034)，37℃孵育20min。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間(胞漿呈棕黃色為陽(yáng)性)，蒸餾水充分沖洗，蘇木素復(fù)染1min，梯度脫水，中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果，陽(yáng)性效應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒，位于細(xì)胞漿中。

1.2.3免疫熒光法觀察小梁組織中TGF-β2表達(dá)術(shù)中取下小梁組織后立即放入4%多聚甲醛液中固定24h，常規(guī)石蠟包埋、切片。切片脫蠟，抗原修復(fù)，血清封閉，加TGF-β2一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)19999-1-AP)，工作濃度1 ∶ 100，于4℃濕盒中孵育過(guò)夜。滴加CY3羊抗兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)BA1032)，工作濃度1 ∶ 100，濕盒中20℃～37℃孵育1h，PBST洗片3min×4次；滴加DAPI避光孵育5min進(jìn)行核染色，PBST洗片5min×4次，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

圖1免疫組化法觀察PACG患者小梁組織中TGF-β2的表達(dá)(IHC×400)A：漢族PACG患者；B：哈薩克族PACG患者。紅色箭頭示TGF-β2陽(yáng)性細(xì)胞。

圖2免疫熒光法觀察PACG患者小梁組織中TGF-β2的表達(dá)(IF×400)A：漢族PACG患者；B：哈薩克族PACG患者。紅色示TGF-β2表達(dá)陽(yáng)性，藍(lán)色示細(xì)胞核。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)房水中TGF-β2含量參考Human TGF-β2 ELISA Kit(Elabscience，貨號(hào)E-EL-H1587c)說(shuō)明書操作，分別檢測(cè)房水中總TGF-β2(total TGF-β2，tTGF-β2)含量及活化TGF-β2(active TGF-β2，aTGF-β2)含量。

1.2.5術(shù)后眼壓和濾過(guò)泡形態(tài)所有患者分別于術(shù)后1、3、7d，3、6mo利用非接觸式眼壓計(jì)測(cè)量眼壓，重復(fù)測(cè)量3次取平均值，對(duì)于眼壓高于30mmHg的患者利用Goldmann接觸式眼壓計(jì)復(fù)測(cè)，并進(jìn)行校正。隨訪至術(shù)后6mo，觀察患者的濾過(guò)泡形態(tài)，并參照Vanbuskirk法進(jìn)行分型[13]：Ⅰ型(微囊狀泡)：微囊、缺血、壁?。虎蛐?平坦彌散泡)：彌散、透明液腔、壁較厚；Ⅲ型(瘢痕泡)：扁而平、加壓無(wú)隆起；Ⅳ型(包裹囊狀泡)：囊泡樣、界清、壁厚。Ⅰ型、Ⅱ型濾過(guò)泡均表明結(jié)膜下有外濾過(guò)的房水存在，稱為功能性濾過(guò)泡；Ⅲ型和Ⅳ型為非功能性濾過(guò)泡，Ⅳ型濾過(guò)泡雖有房水外引流，但被包裹的囊腔限制了結(jié)膜的吸收面積，只能視為做前房的有效通道，對(duì)增加房水吸收并無(wú)益處[14]。

2結(jié)果

2.1 PACG患者小梁組織中TGF-β2的表達(dá)免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，漢族患者小梁組織細(xì)胞中TGF-β2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多(圖1A紅色箭頭示)，哈薩克族患者小梁組織細(xì)胞中TGF-β2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相對(duì)較少(圖1B紅色箭頭示)。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，漢族患者小梁組織細(xì)胞中TGF-β2呈現(xiàn)明顯高表達(dá)(圖2A)，哈薩克族患者小梁組織細(xì)胞中TGF-β2呈現(xiàn)低表達(dá)(圖2B)。

2.2 PACG患者房水中TGF-β2水平ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，漢族和哈薩克族PACG患者房水中tTGF-β2含量分別為448.917±135.221、425.822±146.122pg/mL，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.575，P=0.568)，aTGF-β2含量分別為172.015±79.367、83.436±41.743pg/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.794，P<0.001)，見(jiàn)圖3。

既往研究發(fā)現(xiàn)，PACG在70歲以上青光眼患者中占比最高[15]。本研究納入患者中，≥70歲者31例34眼，其中漢族患者18例19眼，哈薩克族患者13例15眼，漢族患者房水中tTGF-β2含量(480.124±152.997pg/mL)明顯高于哈薩克族(338.858±72.497pg/mL)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.421，P=0.026)；<70歲者15例15眼，其中漢族患者7例7眼，哈薩克族患者8例8眼，兩民族患者房水中tTGF-β2含量分別為422.159±116.985、472.203±155.878pg/mL，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.340)。

民族術(shù)前術(shù)后1d術(shù)后3d術(shù)后7d術(shù)后3mo術(shù)后6mo漢族43.27±11.0815.15±4.9614.15±4.6714.92±4.5316.69±5.1217.46±4.46哈薩克族61.83±20.7017.35±5.0314.61±4.0514.70±2.80313.91±2.9512.17±2.50

圖3PACG患者房水中TGF-β2水平A：tTGF-β2；B：aTGF-β2。

表2 PACG患者術(shù)后6mo濾過(guò)泡形態(tài) 眼

2.3手術(shù)前后眼壓情況手術(shù)前后，漢族和哈薩克族患者眼壓無(wú)組間差異性(F組間=1.146，P組間=0.290)，但有時(shí)間差異性和交互效應(yīng)(F時(shí)間=2.448，P時(shí)間=0.048；F交互=13.495，P交互<0.001)，兩民族患者術(shù)后眼壓均較術(shù)前明顯下降，見(jiàn)表1。

2.4術(shù)后濾過(guò)泡形態(tài)術(shù)后6mo，漢族患者形成功能性濾過(guò)泡者占50%(13/26)，哈薩克族患者形成功能性濾過(guò)泡者占78%(18/23)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.841，P=0.028)，見(jiàn)表2。

3討論

PACG是我國(guó)致盲眼病之一，眼壓升高是患者視力損傷的重要因素。目前有研究表明PACG急性發(fā)作時(shí)眼前段炎癥反應(yīng)引起的高眼壓可刺激TGF-β2在房水中表達(dá)升高[16]。本研究通過(guò)對(duì)漢族和哈薩克族患者房水檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，漢族患者房水中aTGF-β2表達(dá)量高于哈薩克族，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)證明，TGF-β2可能導(dǎo)致眼內(nèi)壓增高，在眼內(nèi)注射能夠編碼具有生物活性形式的TGF-β2腺病毒載體，可增加大鼠和小鼠眼內(nèi)壓[17-19]。Guo等[16]研究將急性閉角型青光眼(AACG)患者分為高眼壓組和正常眼壓組，眼壓高(>21mmHg)的AACG患者房水TGF-β2顯著高于眼壓正常的患者，表明TGF-β2在青光眼眼壓調(diào)節(jié)中起重要作用。

小梁切除術(shù)是目前抗青光眼手術(shù)的主要方式，而手術(shù)的成功標(biāo)志是生成功能性濾過(guò)泡。李靜等[20]研究發(fā)現(xiàn)，青光眼小梁切除術(shù)后濾過(guò)泡形態(tài)與眼壓關(guān)系密切，且證明濾過(guò)通道的通暢性和有效濾過(guò)空間是維持功能性濾過(guò)泡形成的條件。小梁切除手術(shù)早期發(fā)現(xiàn)，前房炎癥反應(yīng)、分泌房水的睫狀體功能恢復(fù)、濾過(guò)通道的重塑及術(shù)后并發(fā)癥均可對(duì)眼壓產(chǎn)生影響，濾過(guò)術(shù)后眼壓的正常維持需要并依賴于功能性濾過(guò)泡的形成，當(dāng)濾過(guò)泡瘢痕形成，濾過(guò)通道受阻，可使有功能的濾過(guò)泡損傷，導(dǎo)致其塌陷、扁平進(jìn)而使眼壓控制不佳[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，漢族和哈薩克族患者小梁切除術(shù)后6mo功能性濾過(guò)泡形成情況有差異(P<0.05)。

TGF-β2是人眼內(nèi)廣泛存在的生長(zhǎng)因子，眼內(nèi)多種細(xì)胞(如小梁細(xì)胞、晶狀體細(xì)胞、色素上皮細(xì)胞等)均可分泌，且眼內(nèi)TGF-β2濃度高于血清，該因子參與眼內(nèi)炎性細(xì)胞趨化、調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)化、凋亡、ECM合成和損傷修復(fù)等多種生理病理過(guò)程[21-23]。小梁切除術(shù)造成血-房水屏障破壞及術(shù)區(qū)的炎癥反應(yīng)，血漿及血小板分泌的TGF-β2主要分布在切口周圍[24], TGF-β2可以促進(jìn)ECM在小梁網(wǎng)沉積，其中活化的Tfb在ECM中積聚，最終促進(jìn)濾過(guò)泡瘢痕的形成，導(dǎo)致手術(shù)失敗。Picht等[25]對(duì)PACG患者房水中TGF-β2濃度進(jìn)行檢測(cè)并在術(shù)后進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn)，存在高濃度TGF-β2的術(shù)眼術(shù)后濾過(guò)瘢痕化發(fā)生率明顯提高。Cordeiro等[26]發(fā)現(xiàn)單克隆抗TGF-β2抗體可抑制成纖維細(xì)胞增殖，延長(zhǎng)兔眼內(nèi)功能性濾過(guò)泡的維持時(shí)間。Burgos-Blasco等[27]和Metelli等[28]研究發(fā)現(xiàn)，房水中潛在的TGF-β2被房水中特異性蛋白酶(如細(xì)胞膜表面的唾液酸酶)水解，轉(zhuǎn)化為aTGF-β2。本研究術(shù)后6mo隨訪顯示，漢族與哈薩克族患者術(shù)后功能性濾過(guò)泡形成情況具有差異，推測(cè)可能是兩民族患者自身具有不同的分泌TGF-β2的能力，在手術(shù)的刺激下，房水中潛在的TGF-β2被房水中特異性蛋白酶水解，轉(zhuǎn)化為的aTGF-β2與損傷部位釋放的TGF-β2共同發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)傷口愈合及瘢痕化的發(fā)生。我們發(fā)現(xiàn)，漢族患者房水中tTGF-β2、aTGF-β2的表達(dá)均高于哈薩克族，兩民組患者房水中aTGF-β2含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；漢族患者小梁組織中也呈現(xiàn)TGF-β2高表達(dá)，表明TGF-β2可能在濾過(guò)瘢痕形成過(guò)程中起重要作用。另有研究表明，PACG存在年齡差異性，其在70歲以上青光眼患者中占比最高[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩民族患者中年齡在70歲以上的患者房水中tTGF-β2表達(dá)存在差異，表明年齡可能與TGF-β2表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，漢族和哈薩克族PACG患者房水及小梁組織中TGF-β2的表達(dá)具有差異性。TGF-β2在PACG的早期及預(yù)后扮演重要角色，哈薩克族PACG患者房水及小梁組織中TGF-β2的低表達(dá)可能減緩眼內(nèi)Tfb活化增生和分泌ECM，減少濾過(guò)泡瘢痕形成從而控制眼壓，并促進(jìn)功能性濾過(guò)泡形成。但由于本研究的樣本量較小，研究結(jié)論還需更進(jìn)一步驗(yàn)證。