王云霞，侯霞霞*，趙淑環(huán)，井麗娟，劉麗君，李翠枝

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

發(fā)酵乳桿菌CECT5716屬于乳桿菌屬，兼性厭氧、呈革蘭氏陽(yáng)性、接觸酶陰性、無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛、不能運(yùn)動(dòng)，是西班牙Biosearch Life公司從母乳中分離的天然益生菌，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，發(fā)酵乳桿菌CECT5716安全[1]且具有抗菌[2-3]和免疫調(diào)節(jié)[4-5]作用，有助于嬰兒腸道菌群建立和增殖[6]，能降低胃腸道感染[7]，提高母嬰免疫力和維持腸道健康[8-10]，被廣泛應(yīng)用于功能食品和醫(yī)藥產(chǎn)品[11-12]。發(fā)酵乳桿菌CECT5716已通過(guò)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的公認(rèn)安全認(rèn)定，并于2016年6月列入我國(guó)《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》[13]，可用于嬰幼兒乳粉。通過(guò)對(duì)市場(chǎng)上常見(jiàn)嬰幼兒食品，尤其是有益生菌宣稱(chēng)的調(diào)制乳粉進(jìn)行調(diào)研后發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)產(chǎn)品添加菌種為動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12，僅少數(shù)添加了動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12和乳雙歧桿菌HN019 2 種菌種，將發(fā)酵乳桿菌添加于嬰幼兒配方乳粉較為少見(jiàn)[14]。發(fā)酵乳桿菌CECT5716在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用起步較晚，且相應(yīng)的檢測(cè)手段也存在不足，利用GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵乳桿菌的單獨(dú)計(jì)數(shù)操作復(fù)雜。本研究通過(guò)對(duì)方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，建立乳粉中發(fā)酵乳桿菌CECT5716的微生物檢測(cè)方法，稀釋液為緩沖蛋白胨水，采用10 倍系列梯度稀釋?zhuān)x擇適宜稀釋度在MRS平板上進(jìn)行涂布，（36±1） ℃厭氧培養(yǎng)（48±2） h后計(jì)數(shù)，并對(duì)分離菌株進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵乳桿菌CECT5716菌粉（批號(hào)：98961；標(biāo)準(zhǔn)值：1×1011CFU/g） 西班牙Biosearch Life公司；MRS瓊脂 美國(guó)BD公司；緩沖蛋白胨水（含蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、磷酸氫二鈉（12H2O）9 g、磷酸二氫鉀1.5 g、蒸餾水1 000 mL） 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；WH-250-II生化培養(yǎng)箱（（36±1） ℃） 上海喬躍電子有限公司；GI54DWS高壓滅菌鍋 致微（廈門(mén)）儀器有限公司；Stomacher? 400 Circulator無(wú)菌均質(zhì)器 英國(guó)Seward公司。

1.3 方法

1.3.1 試樣制備

樣品的全部制備過(guò)程均應(yīng)遵循無(wú)菌操作程序，樣品應(yīng)盡可能混勻。冷凍樣品可先在2～5 ℃條件下解凍，時(shí)間不超過(guò)24 h，或在室溫下解凍不超過(guò)3 h，純菌粉需恢復(fù)至室溫才能打開(kāi)包裝。

1.3.2 檢測(cè)步驟

以無(wú)菌操作稱(chēng)取10 g樣品，置于裝有90 mL滅菌緩沖蛋白胨水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min制成1∶10的樣品勻液。用1 mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1 mL初始懸浮液加入裝有9 mL滅菌緩沖蛋白胨水的無(wú)菌試管中，制備10 倍系列稀釋樣品勻液，用旋渦振蕩器混勻。每遞增稀釋1 次，換用1 次1 mL滅菌吸管或吸頭。根據(jù)對(duì)樣品質(zhì)量濃度的估計(jì)，選擇2～3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，在進(jìn)行10 倍遞增稀釋時(shí)，吸取0.1 mL接入MRS瓊脂平板（最好前一天配制），使用一次性無(wú)菌L形涂布棒均勻涂布，每個(gè)稀釋度做2 個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取0.1 mL空白稀釋液（滅菌緩沖蛋白胨水）加入2 個(gè)MRS瓊脂平板作空白對(duì)照。待瓊脂表面干燥后，將平板翻轉(zhuǎn)，（36±1） ℃厭氧培養(yǎng)（48±2） h，培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)平板上的所有菌落數(shù)。

1.3.3 發(fā)酵乳桿菌CECT5716計(jì)數(shù)

培養(yǎng)48 h后，對(duì)MRS瓊脂平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，保留30～300 個(gè)菌落的平板。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。

1.3.4 菌種鑒定

涂片鏡檢：MRS平板上，發(fā)酵乳桿菌菌落較大，呈圓形、乳白色、不透明，表面光滑、隆起、邊緣整齊。挑取MRS平板上生長(zhǎng)的單個(gè)發(fā)酵乳桿菌菌落進(jìn)行染色鏡檢，發(fā)酵乳桿菌為革蘭氏陽(yáng)性，呈短桿狀，單個(gè)或鏈狀，無(wú)芽孢桿菌。

菌株16S rDNA序列測(cè)定：挑取3 個(gè)或3 個(gè)以上單個(gè)典型菌落，純培養(yǎng)后外送進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用在線分析網(wǎng)站NCBI或EzBioCloud進(jìn)行比對(duì)分析，相似度達(dá)97%以上為符合[15-17]，確認(rèn)鑒定結(jié)果，最終結(jié)果以CFU/g表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選用未添加乳酸菌的嬰兒配方乳粉為基質(zhì)，通過(guò)人為添加發(fā)酵乳桿菌CECT5716純菌粉后作為待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，添加量設(shè)置高、中、低3 個(gè)水平，每個(gè)水平進(jìn)行6 次檢測(cè)。

表 1 方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Accuracy and repeatability of the new method

發(fā)酵乳桿菌CECT5716為純菌粉，菌落數(shù)標(biāo)準(zhǔn)值為1×1011CFU/g，以r=0.25設(shè)定理論加標(biāo)范圍[18]。由表1可知，經(jīng)平板計(jì)數(shù)后實(shí)測(cè)值均落在理論加標(biāo)范圍，因此，該方法的準(zhǔn)確性較好。同一加標(biāo)樣品6 個(gè)檢測(cè)結(jié)果對(duì)數(shù)值的絕對(duì)差值，均未超過(guò)重復(fù)性限（r=0.25），因此可以判定，該方法的重復(fù)性較好。

2.2 本方法與國(guó)標(biāo)方法比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取菌粉和乳粉加標(biāo)樣品共20 份，利用本方法和國(guó)標(biāo)（GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》）方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表 2 本方法與國(guó)標(biāo)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比Table 2 Comparison of experimental results obtained using this method and the national standard method

將表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用雙樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，可以得出P=0.127＞0.05，說(shuō)明本研究建立的方法測(cè)定結(jié)果與GB 4789.35—2016無(wú)顯著性差異。

2.3 方法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

目前添加于嬰幼兒乳粉的益生菌主要為雙歧桿菌屬細(xì)菌，因此選擇含雙歧桿菌乳粉制成加標(biāo)樣，同時(shí)用不含乳酸菌乳粉加標(biāo)作為對(duì)照樣，按本研究建立方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表3所示，菌落形態(tài)如圖1所示。

表 3 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Specificity of this method

由表3可知，本研究建立的方法能獨(dú)立進(jìn)行發(fā)酵乳桿菌計(jì)數(shù)，在一定程度上具有優(yōu)勢(shì)。由圖1A可知，發(fā)酵乳桿菌CECT5716在MRS平板上生長(zhǎng)旺盛，菌落較大，呈圓形、乳白色、不透明，表面光滑、隆起、邊緣整齊，而雙歧桿菌屬細(xì)菌生長(zhǎng)較慢，菌落較小，二者易于區(qū)分。由圖1B可知，國(guó)標(biāo)法傾注培養(yǎng)后菌落分布于培養(yǎng)基內(nèi)部和表面，大小不一，通過(guò)形態(tài)無(wú)法對(duì)發(fā)酵乳桿菌和雙歧桿菌進(jìn)行區(qū)分。盡管通過(guò)菌落形態(tài)特征對(duì)2 種已知添加菌進(jìn)行了初步分類(lèi)，但其種屬信息還需通過(guò)革蘭氏染色和16S rDNA序列分析進(jìn)一步確定。

2.4 發(fā)酵乳桿菌菌種鑒定

挑取2.3節(jié)MRS平板上樣品1的單個(gè)大菌落（典型菌落）和小菌落進(jìn)行染色鏡檢。由圖2可知：典型菌落經(jīng)革蘭氏染色為陽(yáng)性，呈短桿狀，無(wú)芽孢桿菌；小菌落經(jīng)革蘭氏染色為陽(yáng)性，呈短桿狀、長(zhǎng)彎桿狀、分叉桿狀、棍棒狀或匙狀。

將上述菌落純培養(yǎng)后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用在線分析網(wǎng)站NCBI和EzBioCloud進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果表明：MRS平板上典型菌落與發(fā)酵乳桿菌具有100%的相似度，確定為發(fā)酵乳桿菌。MRS平板上小菌落與動(dòng)物雙歧桿菌具有100%的相似度，確定為動(dòng)物雙歧桿菌。

綜合菌株的鏡檢、菌落形態(tài)特征和16S rDNA分析結(jié)果，確定菌粉中菌株為發(fā)酵乳桿菌。

3 結(jié) 論

采用傳統(tǒng)微生物方法對(duì)嬰幼兒乳粉中發(fā)酵乳桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，涂布法測(cè)定結(jié)果表明，發(fā)酵乳桿菌與雙歧桿菌在MRS平板上易于區(qū)分，MRS平板上發(fā)酵乳桿菌菌落明顯大于雙歧桿菌，且乳脂狀更明顯；而傾注法測(cè)定結(jié)果表明，菌落分布于培養(yǎng)基內(nèi)部和表面，且菌落形態(tài)及大小不一，造成發(fā)酵乳桿菌和雙歧桿菌區(qū)分不明顯。涂布法和傾注法對(duì)于食品中乳酸菌的檢測(cè)結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異[19-21]，通過(guò)本方法與GB 4789.35—2016進(jìn)行對(duì)比也獲得了相同結(jié)果。本方法選用涂布培養(yǎng)法實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳粉中發(fā)酵乳桿菌的獨(dú)立計(jì)數(shù)，增加了菌株16S rDNA序列測(cè)定，結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)進(jìn)一步對(duì)添加菌粉的真實(shí)性進(jìn)行確認(rèn)，彌補(bǔ)了國(guó)標(biāo)檢測(cè)中不能確定菌株種屬信息的不足。另外，該方法培養(yǎng)時(shí)間較國(guó)標(biāo)方法減少24 h，節(jié)省了時(shí)間成本。對(duì)乳粉加標(biāo)樣品進(jìn)行6 次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，其準(zhǔn)確性和重復(fù)性均較好。綜上所述，本方法較國(guó)標(biāo)法更適合發(fā)酵乳桿菌CECT5716的計(jì)數(shù)，具有區(qū)分度高、培養(yǎng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)；本方法能檢測(cè)乳粉中發(fā)酵乳桿菌CECT5716的活菌數(shù)，并確定發(fā)酵乳桿菌種屬信息，對(duì)發(fā)酵乳桿菌CECT5716菌粉及添加有發(fā)酵乳桿菌CECT5716菌種的乳粉中發(fā)酵乳桿菌的計(jì)數(shù)具有重要參考意義，在一定程度上保證了產(chǎn)品的質(zhì)量和安全，進(jìn)一步推動(dòng)了發(fā)酵乳桿菌CECT5716在嬰幼兒配方乳粉中的應(yīng)用。