李豐田，趙艷嬌，張曉鷹，白文林，黨云龍，郭 丹*

（1.遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，遼寧 遼陽111000；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽110866）

遼寧絨山羊原產(chǎn)于遼寧省東南部山區(qū)，是我國絨山羊品種中產(chǎn)絨量最高的優(yōu)良品種，屬絨肉兼用型品種［1］。遼寧省畜牧科學(xué)研究院新培育的遼寧絨山羊絨肉兼用新品系種羊具有體格高大、遺傳性能穩(wěn)定、生長速度快等優(yōu)勢［2］。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對參與肌肉生長發(fā)育過程基因的研究越來越深入。關(guān)于肌肉的生長發(fā)育機制，國內(nèi)外的研究主要集中在基因?qū)τ诩∪饧毎恼{(diào)控表達等方面［3］。胰島素樣生長因子（IGF2基因）作為調(diào)控肌肉生長發(fā)育的主效基因，對遼寧絨山羊肌肉細胞的生長分化起到關(guān)鍵的調(diào)控作用［4］。文章從分子生物學(xué)的角度闡述了IGF2對遼寧絨山羊肌肉生長發(fā)育的調(diào)節(jié)，為遼寧絨山羊“絨肉兼用”品系分子育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

遼寧絨山羊健康成年公羊13只，由遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心畜牧業(yè)生產(chǎn)加工流通部提供。

1.2 總RNA的提取

對遼寧絨山羊7種不同組織的總RNA采用TRIzol法進行提取。提取后的RNA使用RNAfree Dnase I（TaKaRa，大連）處理，避免產(chǎn)生污染。

1.3 總RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

總RNA反轉(zhuǎn)錄體系：PrimeScript RT Enzyme Mix 2μL，RT Primer Mix 2μL，PrimeScript Buffer 2 8μL，RNase Free Dh 208μL。PCR反應(yīng)程序：37℃15 min，85℃5 s，4℃5 min。后將合成的cDNA于-20℃冷凍保存，備用。

1.4 定量PCR

以NCBI公布的山羊IGF2的編碼區(qū)序列（GenBankNM_001287041.1）為參考設(shè)計特異性引物，對遼寧絨山羊的IGF2基因5′調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)進行擴增，引物序列見表1。

表1 IGF2基因擴增引物序列及退火溫度

1.5 不同物種序列信息及比對分析

測序結(jié)果采用DNAMan 6.0生物軟件進行拼接，得到最終目的序列。將目的序列與GenBank中不同物種的相應(yīng)基因序列進行比對分析，確定基因序列結(jié)構(gòu)。 然后利用DNAStar、DNAMan 6.0、MEGA 7.0、BLAST、BioEdit、SOPMA、Methprimer等軟件與GenBank中其他物種的序列進行比較分析。從GenBank中獲取的部分動物IGF2基因編碼區(qū)的信息見表2，用于物種間序列的比對分析。

表2 部分動物的IGF2基因編碼區(qū)的基本信息

2 結(jié)果與分析

2.1 IGF2基因突變類型及位置

經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，用特異性設(shè)計引物擴增的遼寧絨山羊IGF2基因序列長2 090 bp，包括5′調(diào)控區(qū)、編碼區(qū)，編碼區(qū)長540 bp。將克隆出的遼寧絨山羊序列與山羊序列進行對比發(fā)現(xiàn)，第263 bp處發(fā)生A/T突變，974位發(fā)生堿基缺失突變，A缺失。

2.2 不同物種的IGF2基因分子進化關(guān)系

將克隆出的遼寧絨山羊IGF2序列與其他動物進行對比分析，遼寧絨山羊與山羊的同源性高達99.8%，與其他物種相比IGF2基因的同源性分別是綿羊99.0%、樂至黑山羊99.0%、黃牛98.0%、牦牛97.0%、水牛98.0%、豬93.0%、馬91.0%。通過以上動物之間的比對發(fā)現(xiàn)，作為調(diào)控肌肉生長發(fā)育的基因，IGF2在部分偶蹄目動物和奇蹄目動物中不僅是在物種內(nèi)高度保守，在種間也同樣高度保守，在進化過程中趨于穩(wěn)定。

采用NJ法構(gòu)建包括遼寧絨山羊在內(nèi)的部分物種的分子系統(tǒng)進化樹（見圖1）和親緣關(guān)系（見圖2）。

整個系統(tǒng)進化樹有三個明顯的大分支：第一類分支包括遼寧絨山羊、藏山羊。樂至黑山羊、山羊、綿羊、黃牛和牦牛均是偶蹄目反芻動物。遼寧絨山羊和藏山羊、樂至黑山羊、山羊均屬于同一分支且遺傳距離非常接近，與綿羊遺傳距離略有差異，但均屬于同一分支。黃牛和牦牛有著較近的遺傳距離，屬第一類分支的一類小分支。而豬和馬分別構(gòu)成了第二類和第三類大分支。遼寧絨山羊和藏山羊從生產(chǎn)性能上均屬于產(chǎn)絨型山羊，按照傳統(tǒng)的系統(tǒng)分類法屬于同一類物種，這個聚類結(jié)果與傳統(tǒng)的生物學(xué)系統(tǒng)分類法基本一致。

2.3 mRNA的二級結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)特征

通過在線網(wǎng)站RNAfold WebServer分析遼寧絨山羊IGF2基因mRNA序列的二級結(jié)構(gòu)。IGF2基因序列最優(yōu)堿基對二級結(jié)構(gòu)自由能為-3 096.13 J/mol，二級結(jié)構(gòu)中心結(jié)構(gòu)的最小自由能為-2 125.82 J/mol，總體結(jié)構(gòu)的自由能熵為-3 212.33 J/mol，整體多樣性指標為476.16。

2.4 IGF2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物信息學(xué)特征

對遼寧絨山羊IGF2編碼區(qū)總長度進行開放閱讀框的分析，編碼區(qū)總長度為540 bp，共編碼179個氨基酸，其構(gòu)成及比例見表3。

表3 遼寧絨山羊IGF2基因編碼區(qū)氨基酸組成

經(jīng)過ExPASy-ProtParam分析結(jié)果表明，IGF2基因編碼蛋白相對分子質(zhì)量為19 654.41，等電點為8.84。序列中Ala使用頻率最高，頻率為11.7%，其次是Leu，使用頻率為10.6%；其他氨基酸使用頻率為0.6%～10.1%；Pyl和Sec均沒有使用。負電荷氨基酸殘基總數(shù)為19個，正電荷氨基酸殘基總數(shù)為24個，原子組成為860個碳原子、1 364個氫原子、250個氮原子、258個氧原子、10個硫原子。根據(jù)軟件預(yù)測，其體外半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為62.91（大于40為不穩(wěn)定蛋白），脂肪族氨基酸指數(shù)為73.18，其蛋白質(zhì)氨基酸殘基親疏水性總和為-0.220，說明遼寧絨山羊IGF2編碼蛋白質(zhì)疏水性較弱且不穩(wěn)定。

2.5 對遼寧絨山羊IGF2的啟動子區(qū)的CpG島進行預(yù)測

遼寧絨山羊IGF2基因序列在-317，-883，-963，-1 908 bp處可能存在潛在啟動子序列，在-1 921 bp處僅發(fā)現(xiàn)1個TAT-box。

利用Methprimer在線分析IGF2的CpG島，發(fā)現(xiàn)IGF2基因5′調(diào)控區(qū)存在明顯的飾CpG島。島區(qū)域GC含量大于50%，長度超過100 bp。這種GC含量的差異性對IGF2基因表達以及調(diào)控、基因突變都可能起著很重要的作用。IGF2的5′調(diào)控區(qū)有3個CpG島，分別在-22～-839 bp、-867～-177 bp、-1 175～-1 773 bp處，大小分別為818，305，599 bp?；蜣D(zhuǎn)錄必備條件之一是啟動子區(qū)中的CPG島處于未甲基化狀態(tài)，而CpG序列中C的甲基化有可能導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄水平受到抑制。說明該CpG島區(qū)域?qū)GF2的基因表達有著重要作用。

2.6 IGF2信號肽預(yù)測

根據(jù)IGF2蛋白質(zhì)信號肽分析發(fā)現(xiàn)，存在明顯的信號肽序列，在第24和25氨基酸之間的C值最大，信號肽切割概率為45%。S值是蛋白質(zhì)序列信號肽區(qū)域與其他區(qū)域的評估值，高分值區(qū)域是信號肽切割位點前的區(qū)域，而低分值區(qū)域是信號肽切割位點后大約30個氨基酸殘基區(qū)域或者是非分泌蛋白的N-末端區(qū)域。Mature Chain Sequence預(yù)測位置在19～179 bp處，屬于分泌性蛋白，判斷遼寧絨山羊的IGF2基因存在信號肽序列。

2.7 IGF2編碼蛋白疏水區(qū)

對遼寧絨山羊IGF2基因編碼的179個氨基酸的蛋白成熟序列進行疏水區(qū)預(yù)測，遼寧絨山羊IGF2基因編碼蛋白的而C端有一定的疏水性，N端具很強親水性，位于分子內(nèi)部；中間部分親水性較強。從總體上講，該蛋白的親水性比疏水性強，而疏水區(qū)相對較少。推測這些親水區(qū)對IGF2蛋白形成重要的功能結(jié)構(gòu)域發(fā)揮一定的作用［5］。

2.8 IGF2編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的預(yù)測

對遼寧絨山羊IGF2編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測。在179個氨基酸殘基組成的IGF2編碼蛋白的序列中，存在67個氨基酸殘基組成的轉(zhuǎn)錄生長因子前肽超家族的基序以及56個氨基酸殘基組成的轉(zhuǎn)錄生長因子超家族的基序，都有很高的保守性。

2.9 IGF2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過在線軟件SOPMA對IGF2編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：序列預(yù)測圖中IGF2蛋白二級結(jié)構(gòu)中主要是由38.50%α螺旋（h）、11.73%伸展鏈（e）、11.17%β轉(zhuǎn)角（t）和38.55%隨機線圈螺旋（c）組成。從氨基酸的對應(yīng)序列可以看出，整個蛋白結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了2個大峰，可見α螺旋結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的集中區(qū)域相對比較明顯。

2.10 IGF2蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

將測序推導(dǎo)出的含有179個氨基酸殘基的遼寧絨山羊IGF2基因編碼的蛋白序列，用SWISSMODEL軟件進行同源性搜索，利用高同源性建立三維結(jié)構(gòu)模板。結(jié)果表明：與遼寧絨山羊IGF2蛋白同源性最高的是蛋白因子D11 bound IGF-II（5131.1.A）同源性達到94.03%?；?131.1.A的三維結(jié)構(gòu)建立三維結(jié)構(gòu)模型，其含有多個α螺旋結(jié)構(gòu)域，該三維空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

遼寧絨山羊IGF2基因編碼區(qū)序列總長度為540 bp?？寺⌒蛄兄械?63 bp處發(fā)生A/T突變，974位發(fā)生A堿基缺失突變。通過不同物種之間的親緣關(guān)系進化樹分析發(fā)現(xiàn)，IGF2基因在物種之間是比較保守的，不同目之間的也有80%以上的相似度。對IGF2的啟動子序列和CpG島進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)IGF2僅含有一個TATA-box，3個CpG島；并預(yù)測了mRNA的二級結(jié)構(gòu)的化學(xué)性質(zhì)。利用軟件對IGF2的信號肽和蛋白質(zhì)親水性進行分析發(fā)現(xiàn)，IGF2有信號肽序列，屬于分泌蛋白。IGF2基因編碼179個氨基酸序列，構(gòu)成的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量是19 654.41。對其二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其固定的結(jié)構(gòu)域具有高度保守的特點，并預(yù)測了三維結(jié)構(gòu)。