李井春，王 碩，李雁冰，魏國(guó)生

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶163319）

早期胚胎體外發(fā)育率低、質(zhì)量差的問(wèn)題一直受到研究人員的廣泛關(guān)注。為了提高早期胚胎體外發(fā)育率和質(zhì)量，研究人員在胚胎培養(yǎng)液成分改良方面做了大量研究，但效果并不理想。有研究人員從物理性因素著手考慮，從機(jī)械性刺激對(duì)早期胚胎體外發(fā)育的影響方面開展創(chuàng)新性研究，取得了較好的效果。文章擬從早期胚胎體外培養(yǎng)存在的問(wèn)題、研究現(xiàn)狀及物理性因素對(duì)早期胚胎發(fā)育影響的途徑等方面做一綜述。

1 早期胚胎體外培養(yǎng)存在的問(wèn)題

近些年，隨著胚胎工程技術(shù)的不斷發(fā)展，國(guó)內(nèi)外對(duì)各項(xiàng)胚胎工程技術(shù)中最基礎(chǔ)、最關(guān)鍵的步驟之一的早期胚胎體外培養(yǎng)進(jìn)行了大量研究；但都面臨胚胎體外囊胚發(fā)育率低（17.4% ～38.1%）及質(zhì)量差的問(wèn)題［1-2］?；谝陨蠁?wèn)題，大多數(shù)的研究主要圍繞早期胚胎所處的化學(xué)環(huán)境，即培養(yǎng)液成分方面，來(lái)提高早期胚胎體外發(fā)育率和胚胎質(zhì)量，卻忽略了早期胚胎在體內(nèi)輸卵管中發(fā)育所需要的物理性因素，即發(fā)育的機(jī)械力刺激及微環(huán)境的影響。胚胎發(fā)育微環(huán)境是一個(gè)由眾多因素組成的復(fù)雜集合，通過(guò)一些物理和生化作用機(jī)制影響胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育。傳統(tǒng)的胚胎體外培養(yǎng)只能提供一種靜態(tài)、宏觀、二維的生長(zhǎng)環(huán)境，與胚胎在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境相差很大，常常會(huì)影響胚胎的生長(zhǎng)速率、形態(tài)、胞內(nèi)代謝活動(dòng)等相關(guān)特性，致使胚胎體外培養(yǎng)的效率仍然遠(yuǎn)低于體內(nèi)［3］。這是當(dāng)前迫切需要解決的問(wèn)題。

2 早期胚胎體外培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀

早期胚胎在輸卵管中除需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，也受到輸卵管蠕動(dòng)及液體流動(dòng)等力的作用。近10年，研究人員從培養(yǎng)方式及胚胎培養(yǎng)裝置上進(jìn)行大量研究，以探討物理性因素對(duì)胚胎發(fā)育的影響，尋找提高胚胎體外發(fā)育質(zhì)量的方法。M.S.Kim等［4］開發(fā)了一個(gè)使用PDMS微流控通道和傾斜機(jī)組合的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)（dynamic culture systems，DCSs，見圖1）。把牛早期胚胎放置在一個(gè)傾斜的裝置中，通過(guò)重力提供胚胎的運(yùn)動(dòng)，結(jié)果表明，在收縮的通道中胚胎發(fā)育到8-cell的比例比在無(wú)收縮直通道中大。

K.Matsuura等［5］和T.Hara等［6］開發(fā)了一個(gè)傾斜的培養(yǎng)系統(tǒng)（tilting embryo culture system，TECS），通過(guò)微滴流體的運(yùn)動(dòng)使小鼠、豬和人的胚胎在液滴中運(yùn)動(dòng)，結(jié)果表明，TECS改善了這些胚胎的囊胚發(fā)育率。通過(guò)溫和的振動(dòng)，豬和人胚胎囊胚形成率提高［7-9］。這些動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)可以結(jié)合微孔和微流控通道進(jìn)行哺乳動(dòng)物胚胎培養(yǎng)，但只是對(duì)胚胎施加了簡(jiǎn)單的振動(dòng)或擺動(dòng)的刺激，使胚胎所處的發(fā)育微環(huán)境有一定程度的改善。

目前隨著微流控技術(shù)的快速發(fā)展，其在生物工程中也得到廣泛應(yīng)用。微流控芯片是組織、器官仿真的有力工具。一方面，微流控通道具有與體內(nèi)微血管相似的尺寸，在這個(gè)尺度下流體所具有的層流特性便于實(shí)現(xiàn)精確的流體控制；另一方面，通過(guò)芯片材料和芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，可以有效模擬組織或器官的結(jié)構(gòu)和功能。微流控裝置在處理生殖細(xì)胞方面也是有力的工具，這些細(xì)胞的大小都在微米級(jí)范圍。一個(gè)哺乳動(dòng)物的精子長(zhǎng)約50μm，哺乳動(dòng)物卵細(xì)胞及早期胚胎的直徑約100μm。目前最流行的用于細(xì)胞生物的制造微流控裝置的技術(shù)是基于在聚二甲基硅氧烷（poly-dimethylsiloxane，PDMS）上進(jìn)行軟刻蝕加工。PDMS是一種透明、高分子硅膠聚合物，對(duì)細(xì)胞無(wú)害，透氣，容易制作，制成的裝置可以用于觀察細(xì)胞。通過(guò)簡(jiǎn)易的鑄造程序，這種材料能在短時(shí)間內(nèi)制作成微流控芯片裝置，并能在數(shù)小時(shí)內(nèi)大量復(fù)制［10］。

在胚胎培養(yǎng)方面，微流控芯片也充分顯示了巨大的應(yīng)用潛力。Y.B.Chae等［11］應(yīng)用微流控培養(yǎng)裝置對(duì)牛胚胎短時(shí)間施加不同大小的壓力刺激，結(jié)果表明，在適當(dāng)機(jī)械力的刺激下能夠明顯增加囊胚發(fā)育率。同時(shí)，LI J.C.等［12］開發(fā)了一個(gè)帶有微通道的空氣驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，通過(guò)變形的0.1 mm厚PDMS膜提供機(jī)械刺激（mechanical stimulation，MS）和評(píng)價(jià)微流控通道內(nèi)的小鼠胚胎發(fā)育。使用的空氣驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)為微流通道內(nèi)的小鼠胚胎實(shí)施機(jī)械力的作用，并根據(jù)胚胎的運(yùn)動(dòng)速度計(jì)算層流剪切力（laminar shear stress，LSS）大小。結(jié)果表明，該培養(yǎng)系統(tǒng)可以研究MS和胚胎發(fā)育分子機(jī)制的關(guān)系。這種培養(yǎng)系統(tǒng)可以直接放在熒光顯微鏡上，在微流控通道的胚胎發(fā)育階段的熒光圖像可被記錄，顯示細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的分布［（Ca2+）i］。MS和（Ca2+）i可以通過(guò)激光共聚焦顯微鏡圖像得到量化。當(dāng)囊胚被壓縮，灰度增加，響應(yīng)于所施加的MS。使用此培養(yǎng)裝置可以研究由于施加MS使胚胎產(chǎn)生的分子反應(yīng)，由此探討胚胎傳感器蛋白功能。此外，李偉萱等［13］報(bào)道，他們發(fā)明了一種基于微流控芯片的人工子宮，其特色在于使用子宮內(nèi)膜細(xì)胞-胚胎共培養(yǎng)機(jī)制，并以連續(xù)灌流方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與外界物質(zhì)交換，獲得與傳統(tǒng)方法相比更高的桑椹胚率和囊胚率。王維等［14］報(bào)道，使用一種基于微流控芯片的胚胎動(dòng)態(tài)培養(yǎng)方法可以顯著改善胚胎質(zhì)量。但是當(dāng)使用DCS時(shí)過(guò)大的SS對(duì)胚胎發(fā)育有不利的影響，可導(dǎo)致培養(yǎng)的胚胎細(xì)胞凋亡。Xie Y.等［15］報(bào)道，剪切力（shear stress，SS）大于1.2 dyn/cm2可能造成卵裂球的損害，增加應(yīng)激信號(hào)通路成分，導(dǎo)致胚胎退化。因此，DCS的運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)的胚胎附近的SS應(yīng)保持低于閾值。

以上研究結(jié)果充分顯示了微流控芯片在胚胎培養(yǎng)方面具有廣泛的應(yīng)用前景。與傳統(tǒng)的器皿培養(yǎng)和微滴培養(yǎng)相比，這種培養(yǎng)方式的優(yōu)勢(shì)在于類似體內(nèi)胚胎生長(zhǎng)的微環(huán)境，同時(shí)克服了傳統(tǒng)方法的不利因素［14］。使用微流控芯片對(duì)胚胎施加機(jī)械力的刺激后胚胎發(fā)育率及囊胚質(zhì)量都得到不同程度的提高和改善。

3 物理性因素對(duì)早期胚胎發(fā)育影響的途徑及展望

由文獻(xiàn)分析，作者推測(cè)機(jī)械性刺激對(duì)促進(jìn)胚胎體外發(fā)育的可能原因：首先，胚胎在輸卵管中及常規(guī)靜態(tài)培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液養(yǎng)分消耗及胚胎自身代謝的廢棄物聚集，會(huì)在胚胎細(xì)胞周圍形成表面梯度；但胚胎在體內(nèi)植入前由于輸卵管肌肉的收縮和上皮細(xì)胞的纖毛運(yùn)動(dòng)，胚胎不斷移動(dòng)，這種運(yùn)動(dòng)也擾亂了靜態(tài)培養(yǎng)的胚胎細(xì)胞周圍形成的物質(zhì)表面梯度，促進(jìn)胚胎發(fā)育［13］。使用DCSs進(jìn)行胚胎培養(yǎng)時(shí)可能干擾這些梯度，提供更接近于體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境。機(jī)械力刺激有利于胚胎自身分泌的促進(jìn)胚胎發(fā)育因子在胚胎間擴(kuò)散及相互作用，同時(shí)也有利于胚胎代謝產(chǎn)物排出［5］。其次，胚胎在受到機(jī)械力作用時(shí)，如液流剪切力可能通過(guò)促進(jìn)機(jī)械敏感性離子通道與Ca2+結(jié)合及IP3誘導(dǎo)的Ca2+從細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放，以提高Ca2+濃度。而Ca2+和蛋白激酶C可激活細(xì)胞的增殖和分裂，有利于胚胎的發(fā)育［24］。最后，微流控芯片動(dòng)態(tài)培養(yǎng)可能打破了胚胎局部的環(huán)境梯度，清除胚胎生長(zhǎng)過(guò)程中有害產(chǎn)物，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)胚胎上的機(jī)械受體提供機(jī)械力刺激激活營(yíng)養(yǎng)信號(hào)通路等，或者是以上多種因素的綜合作用促進(jìn)了體外受精卵的發(fā)育［14］。具體影響機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

作者前期應(yīng)用微流控芯片技術(shù)構(gòu)建動(dòng)物早期胚胎體外培養(yǎng)的體系，研究發(fā)現(xiàn)，微流控芯片胚胎體外培養(yǎng)裝置模擬輸卵管微環(huán)境有利于小鼠早期胚胎體外發(fā)育，囊胚發(fā)育率及囊胚總細(xì)胞數(shù)均顯著增加［16-17］。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用微流控芯片胚胎體外培養(yǎng)裝置施加0.015 Pa的SS與胚胎發(fā)育密切相關(guān)［12］。

隨著研究的逐步開展，可以大膽設(shè)想，早期胚胎體外發(fā)育除了需要必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還需要必要的機(jī)械力刺激的微環(huán)境，才能促進(jìn)早期胚胎體外的健康發(fā)育。通過(guò)何種途徑影響早期胚胎在體外的發(fā)育過(guò)程？適當(dāng)?shù)臋C(jī)械力刺激是否有利于促進(jìn)早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)或促胚胎發(fā)育生長(zhǎng)因子的分泌？是否有利于胚胎發(fā)育產(chǎn)生的代謝廢棄物排出？這些問(wèn)題都可能成為以后研究的熱點(diǎn)。