王琴

摘 要：本文從分離膠濃度、凝膠厚度和點樣量方面對SDS-PAGE電泳法進行優(yōu)化，探究最適合蜂蜜蛋白質(zhì)分析的SDS-PAGE電泳條件，證明SDS-PAGE電泳法分析蛋白組學的可靠性，為蜂蜜新鮮度和真實性的鑒別提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蜂蜜;蛋白質(zhì);凝膠電泳

中圖分類號：O658.9;S896.1 文獻標識碼：A 文章編號：1003-5168（2020）14-0129-03

Study on the Condition Optimization of SDS-PAGE Analysis of Protein Components in Honey

WANG Qin

（College of Pharmaceutical Engineering， Chongqing Chemical Industry Vocational College， Chongqing 401228）

Abstract： This paper optimized the SDS-PAGE electrophoresis method in terms of separation gel concentration， gel thickness and spot size， explored the SDS-PAGE electrophoresis conditions that were most suitable for honey protein analysis， and proved that the SDS-PAGE electrophoresis analysis was reliable Sex， provided a reference for the identification of honey freshness and authenticity.

Keywords： honey;protein;gel electrophoresis

蜂蜜是蜜蜂采集花蜜或者蜜露在蜂巢中經(jīng)過充分釀造而成的天然甜物質(zhì)，除富含糖類物質(zhì)，還含有少量的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和酚酸類等活性成分[1]，因而具有藥食兩用的功效[2]，深受人們的喜愛。

我國是蜂蜜的生產(chǎn)和消費大國，市場上的蜂蜜主要是由中華蜜蜂和意大利蜜蜂釀制的，蜂蜜品質(zhì)參差不齊，造假摻雜的現(xiàn)象較為普遍。蜂蜜中的蛋白質(zhì)組分主要來自蜂種，少部分來源于蜜源植物。蜂蜜中的蛋白質(zhì)會隨著儲藏時間逐漸降解[3]，也受到商業(yè)加工的破壞，蜂蜜的蛋白組分完整性可以判定蜂蜜的新鮮程度和真實性，進而反映蜂蜜質(zhì)量的優(yōu)劣。SDS-PAGE電泳法可以快速地得出蜂蜜的蛋白組分，可用于蜂蜜質(zhì)量優(yōu)劣的判斷。本研究主要探究最適合蜂蜜蛋白質(zhì)分析的SDS-PAGE電泳條件，驗證SDS-PAGE電泳法分析蜂蜜蛋白質(zhì)的可靠性。

1 試驗材料與試劑

1.1 樣品

油菜蜜，來源于重慶農(nóng)家中華蜜蜂蜂蜜，未經(jīng)加工處理。

1.2 試劑與儀器

主要試劑有氫氧化鈉（NaOH）、三氯乙酸（TCA）、丙酮、β-巰基乙醇、過硫酸銨、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、10% SDS、5×SDS的上樣緩沖液、考馬斯亮藍染色液、脫色液。主要儀器有蛋白質(zhì)電泳儀、彩色圖像掃描儀、電子恒溫水浴鍋。

2 試驗方法

2.1 蜂蜜蛋白質(zhì)的提取

SDS-PAGE法可以分析蜂蜜中蛋白質(zhì)的組分，文獻研究顯示，TCA-丙酮法提取蛋白質(zhì)的含量最高，蛋白條帶種類最多，最適合后續(xù)SDS-PAGE[4]對蛋白質(zhì)的分析。本研究在周莉質(zhì)等人[5]的方法上進行優(yōu)化，將油菜蜜4.0 g放入50 mL的離心管中，并放入4 mL無菌水溶解樣品，3 000 r/min離心3 min，上清液加入10 mL的TCA-丙酮溶液（1∶9）混合均勻，離心獲取蛋白質(zhì)沉淀，再加入1 mL的丙酮-水溶液（1∶1）清洗沉淀，重復清洗3次，純化蛋白沉淀用無菌水定容到1 mL，放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 SDS-PAGE電泳條件的優(yōu)化

取的油菜蜜總蛋白原液，加0.25倍的5×SDS的上樣緩沖液混勻，在沸水浴中煮沸5 min，組裝好電泳裝置，加入1×SDS-PAGE電泳緩沖液準備電泳試驗。電泳其他條件為：5%濃縮膠。點樣后電泳：先80 V恒壓20 min，再120 V恒壓，當溴酚藍移動到離底部約0.5 cm時，停止電泳，凝膠染色、脫色。

2.2.1 分離膠濃度試驗。按照凝膠組分配方（見表1）制備8%、12%、15%分離膠，以10 μL點樣量進行蛋白質(zhì)電泳。表1中，各種試劑的單位均為mL。

2.2.2 分離膠厚度試驗。按照制膠板，采用12%的分離膠，制備厚度為0.75 cm和1.0 cm的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，以10 μL點樣量進行蛋白質(zhì)電泳。

2.2.3 點樣量試驗。采用12%分離膠，1.0 cm厚度凝膠，分別在5、10、20 μL點樣量的條件下進行蛋白質(zhì)電泳。

3 試驗結(jié)果

3.1 不同濃度分離膠的SDS-PAGE圖譜效果比較

不同濃度的分離膠的蜂蜜蛋白質(zhì)電泳圖如圖1所示，8%的分離膠電泳中標準蛋白分離效果好，但是蜂蜜的蛋白質(zhì)條帶不夠清晰;15%分離膠的蛋白標準比較集中，不能準確估算蜂蜜的蛋白質(zhì)分子量;12%的分離膠分離效果是最好的，蜂蜜蛋白條帶清晰，易于估算蛋白質(zhì)分子量。

3.2 不同厚度凝膠的SDS-PAGE圖譜效果比較

不同厚度凝膠的蜂蜜蛋白質(zhì)電泳圖如圖2所示，結(jié)果表明，凝膠厚度為1.0的蜂蜜蛋白電泳效果最好，主要是由于蜂蜜中的蛋白質(zhì)分子量在100 kDa以下，蛋白質(zhì)組分的分子量比較相近，凝膠越薄，蜂蜜蛋白質(zhì)遷移越靠近，SDS-PAGE圖上分不開蛋白組分。

3.3 不同點樣量的SDS-PAGE圖譜效果比較

不同點樣量的蜂蜜蛋白質(zhì)電泳圖如圖3所示，結(jié)果表明，點樣量為10 μL的蜂蜜蛋白電泳效果最好。5 μL點樣量的蜂蜜蛋白質(zhì)條帶偏少，偏低的蛋白組分不可見;20 μL點樣量的電泳圖分不開55 kDa處的蛋白組分，表明點樣的蛋白質(zhì)含量過多，蜂蜜中總蛋白的含量為0.1%～0.5%[6]，通過TCA-丙酮提取后的蛋白質(zhì)濃度不高，按照本試驗提取方法，電泳中10 μL點樣量適中。

4 結(jié)論

本研究通過比較分離膠的濃度、凝膠厚度發(fā)現(xiàn)，蜂蜜蛋白質(zhì)的最優(yōu)SDS-PAGE電泳條件是：采用厚度為1.0 cm、濃度為12%的分離膠電泳效果最好。不同方法提取的蜂蜜蛋白質(zhì)濃度不一樣，建議進行點樣量試驗確定最適點樣濃度，排除蛋白質(zhì)含量過低，電泳圖檢測不出蛋白組分。本研究表明，SDS-PAGE電泳法分析蜂蜜蛋白質(zhì)組分，具有可靠性，可從蛋白質(zhì)角度推斷蜂蜜的品質(zhì)。

參考文獻：

[1]孫長波，張晶.蜂蜜化學成分研究概況[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2014（8）：243-248.

[2]馬天琛，王倩，程妮，等.熱加工對蜂蜜質(zhì)量影響的研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2019（14）：245-249.

[3]劉紅云，童富淡，李宜梅等.貯存溫度、時間對蜂王漿水溶性蛋白的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003（6）：1-4.

[4]Carpentier S C，Witters E，Laukens K，et al.Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues：an evaluation of different methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis[J].Proteomics，2005（10）：2497-2507.

[5]周莉質(zhì)，宗凱，呂俠影，等.蜂蜜蛋白提取以及雙向電泳技術(shù)分析蜂蜜蛋白條件優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2016（3）：85-87.

[6]Brudzynski K，Sjaarda C.Honey glycoproteins containing antimicrobial peptides，Jelleins of the Major Royal Jelly Protein 1，are responsible for the cell wall lytic and bactericidal activities of honey[J].Plos One，2015（4）：120238.