基于鈷60的大鼠BMSCs細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/h1>
2020-07-08 09:30趙路賈駿麒田磊靳丹宗春琳莫宏兵
實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志 2020年3期
趙路 賈駿麒 田磊 靳丹 宗春琳 莫宏兵
放射治療是參與了約70%的惡性腫瘤的治療過程，其中約40%僅通過放療即可達(dá)到根治目的[1]。放射線通過對人體組織細(xì)胞產(chǎn)生電離輻射效應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤的治療作用，但由于放射線并不具有細(xì)胞和組織的特異性，故而常伴隨著一系列并發(fā)癥的發(fā)生，對患者的生存質(zhì)量造成嚴(yán)重危害[2]。常用于放療的射線類型主要包括放射性同位素所產(chǎn)生的α、β、γ射線、以及各類放療機(jī)所產(chǎn)生的X射線等[3]。不同類型的射線因其能量、劑量率等不同，即使在相同的照射劑量下仍可對細(xì)胞和組織造成不同程度的電離輻射作用[4]。目前，放療及其并發(fā)癥研究的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕峭ㄟ^X射線加載實(shí)現(xiàn)的，本研究通過評(píng)估在不同劑量下基于鈷60放射源發(fā)射的γ射線對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)在增殖、凋亡以及相關(guān)細(xì)胞因子合成方面所造成的影響，尋找適用于放療及其并發(fā)癥研究的放射劑量，并與相同劑量及劑量率下X射線的電離輻射損傷能力進(jìn)行比較，建立切實(shí)可行的基于γ射線的大鼠BMSCs細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑸橥悓?shí)驗(yàn)研究提供參考。
1 材料與方法
1.1 細(xì)胞來源、分組及射線加載
BMSCs取自雄性幼年SD大鼠，將P3代細(xì)胞按照每孔2×103個(gè)細(xì)胞和2.5×106個(gè)細(xì)胞分別接種于96 孔板和6 cm培養(yǎng)皿中，在細(xì)胞貼壁后進(jìn)行照射。將細(xì)胞分為空白對照組、γ射線組和X射線組，γ射線組根據(jù)放射加載劑量分為2、 4、 6、 8 Gy亞組(γ2～γ8)，X射線組根據(jù)放射加載劑量分為X2～X8亞組。
γ射線放射源采用西北核技術(shù)研究所的鈷60放射源，通過調(diào)整培養(yǎng)皿與鈷源之間的距離，將射線劑量率控制在2.538 Gy/min，對升降源過程中的邊界效應(yīng)進(jìn)行積分計(jì)算，使細(xì)胞實(shí)際所受的累積劑量達(dá)到0、 2、 4、 6、 8 Gy。 X射線來源于陜核工業(yè)第二一五醫(yī)院放療科VARIAN CX5762型放療機(jī)(瓦里安公司，美國)發(fā)射的高能X射線，劑量率為4 Gy/min，照射劑量與γ射線組保持一致。
1.2 電離輻射相關(guān)指標(biāo)檢測
對γ射線各亞組細(xì)胞分別在照射后1、 2、 3、 4、 5 d進(jìn)行CCK-8染色檢測細(xì)胞增殖能力并繪制生長曲線；在接受放射后第7 天使用倒置顯微鏡對實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察、TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況，并進(jìn)行活/死細(xì)胞雙染實(shí)驗(yàn)測定活細(xì)胞百分比，應(yīng)用免疫熒光激光共聚焦技術(shù)檢測還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶NOX家族亞型NOX4表達(dá)合成情況。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，student-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 細(xì)胞形態(tài)改變
P3代細(xì)胞呈相互連接的梭形，γ射線照射后第7 天起，集落中部分細(xì)胞形態(tài)開始出現(xiàn)不規(guī)則化，其中4、 6、 8 Gy組細(xì)胞可以觀察到碎裂細(xì)胞殘骸明顯增多(圖 1)。
圖1 γ射線照射后第7 天各亞組細(xì)胞形態(tài)變化 (倒置顯微鏡， ×40)
Fig 1 Cell morphology of the subgroups on the 7th day after γ - ray irradiation (Inverted microscopy, ×40)
2.2 細(xì)胞增殖力比較
在接受γ射線最初的72 h細(xì)胞增殖能力改變不明顯，從第3 天起， 4、 6、 8 Gy組細(xì)胞增殖活變緩，但從第4 天開始出現(xiàn)下降出現(xiàn)明顯下降(圖 2)。
2.3 細(xì)胞凋亡率比較
γ射線造成細(xì)胞的凋亡隨照射劑量增加而增多，γ2組少于γ4組(P<0.05)， γ6、γ8亞組之間無明顯差異(P=0.23)(圖 3)。
2.4 活細(xì)胞比例比較
隨著照射劑量的增大， 2 種射線在大于2 Gy的照射劑量下均可造成活細(xì)胞比例的明顯降低(P<0.05)，劑量相同條件下每亞組間活細(xì)胞比例無顯著性差異(P=0.15)(圖 4)。
2.5 NOX4合成水平比較
接受放射后2 組細(xì)胞均表現(xiàn)為NOX4合成水平的升高， 其中2 Gy組升高不明顯， 4 Gy及以上放射劑量可導(dǎo)致NOX4合成水平顯著增高(P<0.05)， 6 Gy和8 Gy組細(xì)胞實(shí)際的NOX4陽性表達(dá)細(xì)胞與4 Gy組相比并無明顯增多。γ射線組和X射線組之間無顯著差異(P=0.09)。
3 討 論
腫瘤的放射治療是利用放射線對腫瘤進(jìn)行的一種局部治療方法[5]，其射線包括放射性同位素產(chǎn)生的α、β、γ射線和各類X射線治療機(jī)或加速器產(chǎn)生的X射線及各類粒子束等[6-7]。在各種類型的放療射線來源中， 起主要作用的射線主要是X射線和γ射線， 二者均屬電磁波，其區(qū)別在于：γ射線為放射性同位素原子核發(fā)生衰變過程中發(fā)出的核輻射，而X射線則是由高能電子撞擊X線機(jī)球管導(dǎo)致原子核外電子能級(jí)升高，在向低能級(jí)躍遷過程中發(fā)射出的原子核外部輻射[7-8]。由于X射線波長遠(yuǎn)大于γ射線，故而后者的能量和在組織中的穿透性遠(yuǎn)大于前者。目前絕大多數(shù)研究射線對細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ投家訶射線作為輻照加載條件， 但對于在臨床治療中仍大量應(yīng)用的γ射線對生物體組織細(xì)胞造成的輻射損傷研究尚不充分。
圖 2 接受γ射線照射后各亞組細(xì)胞生長曲線
放療可以導(dǎo)致一系列并發(fā)癥的發(fā)生，其中放射性頜骨骨髓炎(osteoradionecrosis of jaws, ORNJ)是頭頸部惡性腫瘤放療后最嚴(yán)重的一類并發(fā)癥，發(fā)生率約8.2%～22%[9]，可導(dǎo)致放療區(qū)內(nèi)的口腔頜面部組織長期不愈、死骨暴露，張口受限、吞咽語言困難、病理性骨折和面部畸形等，使患者生活質(zhì)量大大下降。ORNJ一旦發(fā)生，幾乎無法逆轉(zhuǎn)，目前尚無公認(rèn)有效的預(yù)防和保守治療方法，因此也成為了廣大學(xué)者長期研究的課題。本課題組在前期研究中已經(jīng)成功建立了基于電子直線加速器的ORNJ實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，且研究表明基于X線的放射可導(dǎo)致包括BMSCs、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞發(fā)生增殖活性下降、細(xì)胞凋亡增多、局部氧化應(yīng)激壓力升高、肌成纖維細(xì)胞分化、細(xì)胞外基質(zhì)纖維化等現(xiàn)象[10]。故而本實(shí)驗(yàn)選取細(xì)胞增殖能力、凋亡程度、NOX4合成表達(dá)量等幾個(gè)具有代表性的現(xiàn)象作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。
圖 3 接受γ射線照射后各亞組細(xì)胞TUNEL染色(TUNEL染色， ×100)
Fig 3 TUNEL staining of cells in the subgroups after γ- ray irradiation (TUNEL staining, ×100)
圖 4 接受γ射線和X射線照射后各亞組細(xì)胞活細(xì)胞比例
Fig 4 The proportion of living cells in the subgroups after γ- ray irradiation
通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在2 Gy的低劑量照射條件下，細(xì)胞盡管在照射早期短暫發(fā)生了增殖能力減緩、凋亡水平升高等現(xiàn)象，但這種現(xiàn)象維持時(shí)間過短，細(xì)胞的增殖活性可以在照射后第3 天基本至空白對照組水平，且照射后1 周凋亡細(xì)胞所占比例與空白對照組基本無異。在4 Gy的中等照射劑量下，既可以確保明顯的細(xì)胞增殖能力下降和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，又能保持相對較高比例的活細(xì)胞存量，可以為后續(xù)試驗(yàn)提供較為充足的細(xì)胞量；同時(shí)存在明顯的促NOX4形成現(xiàn)象，與臨床病理表現(xiàn)及前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果貼合度較高。說明4 Gy射線確實(shí)對細(xì)胞造成了明確的電離輻射損傷，又不至于把大部分細(xì)胞殺死，可以為后續(xù)實(shí)驗(yàn)余留足夠的細(xì)胞。而6、 8 Gy照射劑量雖然同樣可造成細(xì)胞增殖能力和凋亡水平的明顯改變，但其促NOX4合成能力較4 Gy未見明顯差異，且活細(xì)胞比例相對較低，如應(yīng)用于細(xì)胞模型的建立可能無法較好滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)量的要求，故綜合考慮選用4 Gy作為理想照射劑量。在不同類型射線電離輻射損傷作用差別方面，無論是細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、還是促NOX4形成能力方面，基于Co60加載的γ射線與基于放療機(jī)加載的高能X射線均未觀察到明顯的組間差異，說明在僅就上述3 個(gè)指標(biāo)而言X射線和γ射線在同等劑量率和劑量加載條件下其電離輻射損傷效果相當(dāng)。
圖 5 γ射線照射后各亞組細(xì)胞NOX4合成水平(CLSM, ×600)
Fig 5 The level of NOX4 synthesis in the subgroup after γ- ray irradiation (CLSM, ×600)
本實(shí)驗(yàn)通過在相同劑量率條件下對BMSCs加載梯度劑量的γ射線和X射線，基本明確了在選定劑量區(qū)間內(nèi)細(xì)胞電離輻射損傷效應(yīng)隨劑量變化的趨勢，篩選出2.538 Gy/min劑量率、 4 Gy劑量這一可較好應(yīng)用于電離輻射損傷相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的理想?yún)?shù)。并且通過實(shí)驗(yàn)證明了在生物放射治療領(lǐng)域的劑量條件下，相同劑量率和劑量的X射線與γ射線其電離輻射損傷效果沒有顯著差異，在放療及其并發(fā)癥研究領(lǐng)域二者可在該劑量區(qū)間實(shí)現(xiàn)等效替換。本實(shí)驗(yàn)所建立的γ射線細(xì)胞輻照模型可為研究放射性損傷提供一個(gè)新的細(xì)胞研究平臺(tái)。
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趙路 賈駿麒 田磊 靳丹 宗春琳 莫宏兵
放射治療是參與了約70%的惡性腫瘤的治療過程，其中約40%僅通過放療即可達(dá)到根治目的[1]。放射線通過對人體組織細(xì)胞產(chǎn)生電離輻射效應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤的治療作用，但由于放射線并不具有細(xì)胞和組織的特異性，故而常伴隨著一系列并發(fā)癥的發(fā)生，對患者的生存質(zhì)量造成嚴(yán)重危害[2]。常用于放療的射線類型主要包括放射性同位素所產(chǎn)生的α、β、γ射線、以及各類放療機(jī)所產(chǎn)生的X射線等[3]。不同類型的射線因其能量、劑量率等不同，即使在相同的照射劑量下仍可對細(xì)胞和組織造成不同程度的電離輻射作用[4]。目前，放療及其并發(fā)癥研究的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕峭ㄟ^X射線加載實(shí)現(xiàn)的，本研究通過評(píng)估在不同劑量下基于鈷60放射源發(fā)射的γ射線對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)在增殖、凋亡以及相關(guān)細(xì)胞因子合成方面所造成的影響，尋找適用于放療及其并發(fā)癥研究的放射劑量，并與相同劑量及劑量率下X射線的電離輻射損傷能力進(jìn)行比較，建立切實(shí)可行的基于γ射線的大鼠BMSCs細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑸橥悓?shí)驗(yàn)研究提供參考。
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γ射線放射源采用西北核技術(shù)研究所的鈷60放射源，通過調(diào)整培養(yǎng)皿與鈷源之間的距離，將射線劑量率控制在2.538 Gy/min，對升降源過程中的邊界效應(yīng)進(jìn)行積分計(jì)算，使細(xì)胞實(shí)際所受的累積劑量達(dá)到0、 2、 4、 6、 8 Gy。 X射線來源于陜核工業(yè)第二一五醫(yī)院放療科VARIAN CX5762型放療機(jī)(瓦里安公司，美國)發(fā)射的高能X射線，劑量率為4 Gy/min，照射劑量與γ射線組保持一致。
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2 結(jié) 果
2.1 細(xì)胞形態(tài)改變
P3代細(xì)胞呈相互連接的梭形，γ射線照射后第7 天起，集落中部分細(xì)胞形態(tài)開始出現(xiàn)不規(guī)則化，其中4、 6、 8 Gy組細(xì)胞可以觀察到碎裂細(xì)胞殘骸明顯增多(圖 1)。
圖1 γ射線照射后第7 天各亞組細(xì)胞形態(tài)變化 (倒置顯微鏡， ×40)
Fig 1 Cell morphology of the subgroups on the 7th day after γ - ray irradiation (Inverted microscopy, ×40)
2.2 細(xì)胞增殖力比較
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2.3 細(xì)胞凋亡率比較
γ射線造成細(xì)胞的凋亡隨照射劑量增加而增多，γ2組少于γ4組(P<0.05)， γ6、γ8亞組之間無明顯差異(P=0.23)(圖 3)。
2.4 活細(xì)胞比例比較
隨著照射劑量的增大， 2 種射線在大于2 Gy的照射劑量下均可造成活細(xì)胞比例的明顯降低(P<0.05)，劑量相同條件下每亞組間活細(xì)胞比例無顯著性差異(P=0.15)(圖 4)。
2.5 NOX4合成水平比較
接受放射后2 組細(xì)胞均表現(xiàn)為NOX4合成水平的升高， 其中2 Gy組升高不明顯， 4 Gy及以上放射劑量可導(dǎo)致NOX4合成水平顯著增高(P<0.05)， 6 Gy和8 Gy組細(xì)胞實(shí)際的NOX4陽性表達(dá)細(xì)胞與4 Gy組相比并無明顯增多。γ射線組和X射線組之間無顯著差異(P=0.09)。
3 討 論
腫瘤的放射治療是利用放射線對腫瘤進(jìn)行的一種局部治療方法[5]，其射線包括放射性同位素產(chǎn)生的α、β、γ射線和各類X射線治療機(jī)或加速器產(chǎn)生的X射線及各類粒子束等[6-7]。在各種類型的放療射線來源中， 起主要作用的射線主要是X射線和γ射線， 二者均屬電磁波，其區(qū)別在于：γ射線為放射性同位素原子核發(fā)生衰變過程中發(fā)出的核輻射，而X射線則是由高能電子撞擊X線機(jī)球管導(dǎo)致原子核外電子能級(jí)升高，在向低能級(jí)躍遷過程中發(fā)射出的原子核外部輻射[7-8]。由于X射線波長遠(yuǎn)大于γ射線，故而后者的能量和在組織中的穿透性遠(yuǎn)大于前者。目前絕大多數(shù)研究射線對細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ投家訶射線作為輻照加載條件， 但對于在臨床治療中仍大量應(yīng)用的γ射線對生物體組織細(xì)胞造成的輻射損傷研究尚不充分。
圖 2 接受γ射線照射后各亞組細(xì)胞生長曲線
放療可以導(dǎo)致一系列并發(fā)癥的發(fā)生，其中放射性頜骨骨髓炎(osteoradionecrosis of jaws, ORNJ)是頭頸部惡性腫瘤放療后最嚴(yán)重的一類并發(fā)癥，發(fā)生率約8.2%～22%[9]，可導(dǎo)致放療區(qū)內(nèi)的口腔頜面部組織長期不愈、死骨暴露，張口受限、吞咽語言困難、病理性骨折和面部畸形等，使患者生活質(zhì)量大大下降。ORNJ一旦發(fā)生，幾乎無法逆轉(zhuǎn)，目前尚無公認(rèn)有效的預(yù)防和保守治療方法，因此也成為了廣大學(xué)者長期研究的課題。本課題組在前期研究中已經(jīng)成功建立了基于電子直線加速器的ORNJ實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，且研究表明基于X線的放射可導(dǎo)致包括BMSCs、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞發(fā)生增殖活性下降、細(xì)胞凋亡增多、局部氧化應(yīng)激壓力升高、肌成纖維細(xì)胞分化、細(xì)胞外基質(zhì)纖維化等現(xiàn)象[10]。故而本實(shí)驗(yàn)選取細(xì)胞增殖能力、凋亡程度、NOX4合成表達(dá)量等幾個(gè)具有代表性的現(xiàn)象作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。
圖 3 接受γ射線照射后各亞組細(xì)胞TUNEL染色(TUNEL染色， ×100)
Fig 3 TUNEL staining of cells in the subgroups after γ- ray irradiation (TUNEL staining, ×100)
圖 4 接受γ射線和X射線照射后各亞組細(xì)胞活細(xì)胞比例
Fig 4 The proportion of living cells in the subgroups after γ- ray irradiation
通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在2 Gy的低劑量照射條件下，細(xì)胞盡管在照射早期短暫發(fā)生了增殖能力減緩、凋亡水平升高等現(xiàn)象，但這種現(xiàn)象維持時(shí)間過短，細(xì)胞的增殖活性可以在照射后第3 天基本至空白對照組水平，且照射后1 周凋亡細(xì)胞所占比例與空白對照組基本無異。在4 Gy的中等照射劑量下，既可以確保明顯的細(xì)胞增殖能力下降和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，又能保持相對較高比例的活細(xì)胞存量，可以為后續(xù)試驗(yàn)提供較為充足的細(xì)胞量；同時(shí)存在明顯的促NOX4形成現(xiàn)象，與臨床病理表現(xiàn)及前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果貼合度較高。說明4 Gy射線確實(shí)對細(xì)胞造成了明確的電離輻射損傷，又不至于把大部分細(xì)胞殺死，可以為后續(xù)實(shí)驗(yàn)余留足夠的細(xì)胞。而6、 8 Gy照射劑量雖然同樣可造成細(xì)胞增殖能力和凋亡水平的明顯改變，但其促NOX4合成能力較4 Gy未見明顯差異，且活細(xì)胞比例相對較低，如應(yīng)用于細(xì)胞模型的建立可能無法較好滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)量的要求，故綜合考慮選用4 Gy作為理想照射劑量。在不同類型射線電離輻射損傷作用差別方面，無論是細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、還是促NOX4形成能力方面，基于Co60加載的γ射線與基于放療機(jī)加載的高能X射線均未觀察到明顯的組間差異，說明在僅就上述3 個(gè)指標(biāo)而言X射線和γ射線在同等劑量率和劑量加載條件下其電離輻射損傷效果相當(dāng)。
圖 5 γ射線照射后各亞組細(xì)胞NOX4合成水平(CLSM, ×600)
Fig 5 The level of NOX4 synthesis in the subgroup after γ- ray irradiation (CLSM, ×600)
本實(shí)驗(yàn)通過在相同劑量率條件下對BMSCs加載梯度劑量的γ射線和X射線，基本明確了在選定劑量區(qū)間內(nèi)細(xì)胞電離輻射損傷效應(yīng)隨劑量變化的趨勢，篩選出2.538 Gy/min劑量率、 4 Gy劑量這一可較好應(yīng)用于電離輻射損傷相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的理想?yún)?shù)。并且通過實(shí)驗(yàn)證明了在生物放射治療領(lǐng)域的劑量條件下，相同劑量率和劑量的X射線與γ射線其電離輻射損傷效果沒有顯著差異，在放療及其并發(fā)癥研究領(lǐng)域二者可在該劑量區(qū)間實(shí)現(xiàn)等效替換。本實(shí)驗(yàn)所建立的γ射線細(xì)胞輻照模型可為研究放射性損傷提供一個(gè)新的細(xì)胞研究平臺(tái)。
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