劉 偉，林偉國，曾建立，榮峻峰

(中國石化石油化工科學(xué)研究院，北京 100083)

單針藻屬于綠藻門單針藻屬，細胞為不規(guī)則的紡錘形，寬4～8 μm，長12～26 μm。單針藻能夠利用無機碳和廢氣中CO2進行光合作用自養(yǎng)生長，也可以有機碳為碳源異養(yǎng)及混養(yǎng)生長，而且有機碳為碳源時的生長明顯優(yōu)于無機碳源的自養(yǎng)生長[1]。單針藻生長速率快、油脂含量高，在氮、磷缺乏的條件下油脂含量超過50%[2]。油脂中C16和C18短鏈脂肪酸酯總量可達95%，其中C18單不飽和脂肪酸酯含量超過30%，是生物柴油生產(chǎn)的潛在原料之一[3]。單針藻可以用于污水和廢氣的處理，去除有毒酚類物質(zhì)[4]。利用污水和廢水培養(yǎng)單針藻，不僅能夠凈化污水及空氣，還可以利用其中的營養(yǎng)物質(zhì)，降低培養(yǎng)成本[5-6]。

將單針藻中的油脂有效、經(jīng)濟地萃取出來是發(fā)揮其潛力的關(guān)鍵技術(shù)之一[7]。微藻油脂的萃取通常是先對細胞破壁，然后采用物理壓榨法、溶劑法或者超臨界CO2法萃取[8-10]。酶解萃取法技術(shù)是采用對細胞組織及脂多糖、脂蛋白等復(fù)合體有降解作用的酶處理微藻，實現(xiàn)細胞破壁，并對脂蛋白、脂多糖分解，增加微藻中油脂在萃取劑中的流動性，促使油脂萃取出來。酶解法工藝條件溫和，降解產(chǎn)物一般不會與萃取物發(fā)生反應(yīng)，可以有效地保護油脂、蛋白質(zhì)以及膠質(zhì)等可利用成分的品質(zhì)。在得到油的同時有利于回收微藻中的蛋白質(zhì)及多糖等。酶解法操作能耗低，提取的油純度高，磷脂含量、酸值及過氧化值低，色澤淺，廢水中BOD與COD低，易于處理，污染少，符合“安全、高效、綠色”的要求[11-13]。

目前，用于單針藻油脂的萃取大多是Bligh-Dyer法[14-16]或其改進方法[17-18]，萃取前或萃取過程中通過超聲波實現(xiàn)細胞破壁[19]。本課題利用酶解法對自制的單針藻細胞結(jié)構(gòu)及油脂萃取進行研究。

1 實 驗

1.1 原料及試劑

單針藻，中國石化石家莊煉化分公司微藻養(yǎng)殖示范基地養(yǎng)殖，藻種由中國科學(xué)院武漢植物園提供，培養(yǎng)基為BG11，碳源為煉油廠制氫尾氣中的二氧化碳;醋酸、鹽酸、甲醇、乙醇、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三氯甲烷、正己烷，均為分析純，由北京化工廠生產(chǎn)； 溶菌酶，20 000 IU/g，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶，2 000 IU/g，果膠酶，20 000 IU/g，酸性蛋白酶，50 000 IU/g，購于北京鴻潤寶順科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SG23 pH測定儀，由梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn)；3-15 sigma離心機，由Sigma公司生產(chǎn)；SCT-06 Soxhlet提取器，由杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；JEM-1200EX透射電子顯微鏡，由日本電子公司生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

1.3.1 單針藻油脂理論含量單針藻油脂理論含量按Soxhlet萃取法[20]萃取結(jié)果計。取一定量單針藻在105 ℃下干燥2 h、研磨，在Soxhlet 萃取器中萃取至萃取劑無油跡為止?；厥蛰腿?，萃取瓶在105 ℃下干燥至恒重，萃取瓶增加的量計為單針藻油脂質(zhì)量。萃取劑分別為正己烷和三氯甲烷甲醇混合液(體積比2∶1)。單針藻油脂理論含量(w)按式(1)計算。

w=W1W×100%

(1)

式中：W1為油脂質(zhì)量，g；W為單針藻質(zhì)量，g。

1.3.2 單針藻的超微結(jié)構(gòu)單針藻冷凍切片，然后通過透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。透射電鏡樣品首先用體積分數(shù)為2.5%的戊二醛水溶液固定后離心，用0.2 mgL 的瓊脂包埋，然后用質(zhì)量分數(shù)為1%的鋨酸水溶液固定，用磷酸緩沖液沖洗、系列乙醇丙酮水溶液脫水、Spurr樹脂包埋、ReichertJung E超薄切片機切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后觀察、拍照[21-23]。

1.3.3 酶解萃取油脂稱取定量的單針藻干粉加入三口燒瓶中，加入適量水，攪拌均勻，水浴加熱。按照200 IUg(藻)的量加入生物酶，50 ℃下酶解12 h。然后，加入計量的萃取劑常溫下萃取1～3次，每次30 min。萃取液在離心機中于轉(zhuǎn)速8 000 rmin下離心分離10 min。離心后置下層溶液到預(yù)先稱重的燒杯中。待有機溶劑揮發(fā)后，把燒杯放入烘箱，60 ℃下干燥1.5 h。燒杯冷卻后稱量，按式(2)計算油脂收率(y)。

y=(m2-m1)m0×100%

(2)

式中：m0為單針藻樣品質(zhì)量，g；m1為燒杯質(zhì)量，g；m2為含油脂燒杯質(zhì)量，g。

單針藻油脂的萃取率(z)按式(3)計算。

z=yw×100%

(3)

1.3.4 單針藻油脂分析皂化物和不皂化物：按照國家標(biāo)準(zhǔn)GBT 5535.2—2008《動植物油脂 不皂化物測定 第2部分：己烷提取法》，先用KOH乙醇(95%)溶液皂化萃取的油脂，然后用正己烷萃取分離不皂化物。再通過鹽酸滴定確定皂化物含量[24]，稱量正己烷萃取物量，計算得到不皂化物量。

脂肪酸組成：先將油脂甲酯化，然后用正己烷萃取收集脂肪酸，經(jīng)GC-MS分析確定其成分[15]。判斷微藻油脂作為生物柴油原料的參數(shù)為不飽和度[25]，按式(4)計算。

DU=MU+2(PU)

(4)

式中：DU為脂肪酸不飽和度，%；MU為單不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)，%；PU為多不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 單針藻油脂理論含量

Soxhlet法通常是在萃取劑沸點下回流，即萃取過程始終為新鮮純凈的冷凝液淋洗、浸泡，保證了濃度梯度最大，溶解擴散速率最快。加上時間較長，萃取更充分，油脂收率更高。Soxhlet法可以作為油脂萃取的基本方法，將其萃取得到的油脂含量當(dāng)作微藻的理論油脂含量，與其他油脂萃取法的結(jié)果進行對比。正己烷和三氯甲烷甲醇混合液萃取單針藻的油脂理論含量分別為15.20%和30.04%，萃取時間為10 h。

2.2 單針藻細胞超微結(jié)構(gòu)

單針藻是具有單層或多層細胞壁的浮游植物。單針藻的超微結(jié)構(gòu)如圖1所示。其中，圖1(b)和圖1(c)分別為單針藻的縱向剖面照片和橫向剖面照片，圖1(d)則顯示單針藻處于分裂狀態(tài)。從圖1可以看出，單針藻呈橢圓形，邊緣光滑，無鞭毛，具有明顯的單細胞特征。橫向剖面顯示出多層細胞壁，細胞壁厚度約50 nm，細胞核處于細胞的前部，具有多個細胞器?？v向剖面顯示，細胞器主要集中在細胞的一側(cè)，另一側(cè)多為類囊體和葉綠素。而細胞分裂時，邊緣變的褶皺不平，存在更多的突起，表現(xiàn)為非等分分裂。

圖1 單針藻細胞超微結(jié)構(gòu)

通常藻類細胞壁包括內(nèi)外層，其中外層是主要由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)、藻酸鹽、藻多糖和聚半乳糖硫酸酯等多層微纖絲組成的多孔結(jié)構(gòu)，內(nèi)層主要成分是纖維素和半纖維素。此外，細胞外壁還富含藻細胞釋放的以多肽、多糖為主的胞外產(chǎn)物。

生物酶對細胞壁結(jié)構(gòu)有特定的降解作用。表1為纖維素酶和復(fù)合酶(纖維素酶+果膠酶+蛋白酶+溶菌酶B)分別酶解單針藻后油脂萃取結(jié)果。從表1可以看出，纖維素酶酶解可以顯著提高油脂收率，說明纖維素酶破壞了存在纖維素和半纖維素的單針藻的細胞壁。但加入含有其他生物酶的復(fù)合酶酶解后，油脂收率和纖維素酶酶解結(jié)果相差無幾，說明單針藻細胞壁內(nèi)外層主要由纖維素和半纖維素組成。

表1 生物酶對單針藻油脂萃取率的影響

注：萃取劑為三氯甲烷。

2.3 油脂萃取

微藻中的油脂是一種成分復(fù)雜的混合物，包括三酸甘油酯、二酸甘油酯、單酸甘油酯、類固醇等和游離脂肪酸、磷脂、鞘酯等。其中甘油酸酯和游離脂肪酸通過甲醇酯化可以形成脂肪酸甲酯，制備生物柴油。磷脂和類固醇等可以作為保健品和藥品的原料，具有極高的價值。因此，除盡可能多地提取微藻中的甘油酸酯和游離脂肪酸之外，對微藻中的其他成分也應(yīng)加以利用，產(chǎn)生更多的經(jīng)濟效益，降低微藻生產(chǎn)生物柴油的成本。

單針藻具有多層纖維素和半纖維素質(zhì)的細胞壁。要將單針藻中的油脂從細胞中高效地分離出來，首先應(yīng)該破壞細胞壁(破壁)，使得萃取劑易于進入細胞內(nèi)部?？紤]到能量消耗，破壁可以完全破壞也可以產(chǎn)生裂縫的部分破壞。但破壁越徹底，也越容易產(chǎn)生更多的細粉，給后續(xù)分離帶來困難。其次，考慮萃取劑對油脂的溶解能力以及油脂表面環(huán)境影響，優(yōu)化或強化萃取劑極性或非極性實現(xiàn)選擇性的油脂萃取。再次，萃取油脂在萃取體系中的濃度梯度，濃度梯度越大，擴散速率越快，萃取效率也越高。

2.3.1 堿預(yù)處理對單針藻油脂萃取的影響在微藻液中，堿的加入可以調(diào)節(jié)體系的pH、改變藻細胞壁內(nèi)外化學(xué)環(huán)境、軟化或降解纖維素等。堿預(yù)處理條件為：用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到9，在80 ℃反應(yīng)8 h，然后用醋酸調(diào)節(jié)pH到5。其對單針藻油脂萃取效果的影響見表2。從表2可以看出，堿預(yù)處理后，單針藻油脂收率可以提高10%以上。因此以下所有試驗均經(jīng)過堿預(yù)處理。

表2 堿處理對單針藻油脂萃取率的影響

注：溶劑為三氯甲烷。

2.3.2 助溶劑的影響依據(jù)“相似相容”的原理，微藻油脂的萃取效果與萃取劑的極性有很大關(guān)系。在油脂萃取劑中，正己烷、三氯甲烷和乙醇的極性依次增加。極性溶劑更有利于萃取極性油脂，非極性溶劑更利于非極性油脂的萃取。但細胞內(nèi)部通常含有一定量的水分，附著在油脂表面、甚至包裹油脂。強極性的水會阻隔或者影響萃取劑的溶解。因此，在微藻油脂萃取的過程中，與水互溶性較差的有機溶劑作為萃取劑不利于微藻油脂的溶解。加入極性助溶劑有助于萃取劑與水相的有效浸潤、接觸和油脂萃取率的提高。助溶劑乙醇對單針藻油脂萃取效果的影響見表3。

表3 助溶劑對單針藻油脂萃取率的影響

注：纖維素酶酶解，雙組分萃取劑體積比為1∶1。

從表3可以看出，正己烷的油脂收率較三氯甲烷更小，即正己烷萃取物中更偏重于極性更小的油脂。加入極性更強的助溶劑乙醇后，雙組分的萃取劑體系對單針藻的油脂收率均有所提高。

2.3.3 萃取次數(shù)的影響微藻油脂萃取時，萃取劑首先穿過細胞壁擴散到油脂表面，溶解油脂，形成表面含油脂萃取液。然后含油脂萃取液經(jīng)過細胞壁向萃取劑主體擴散，擴散速率取決于表面萃取液油脂濃度和主體萃取劑含油脂濃度差。萃取開始時，萃取劑主體油脂濃度為零，此時濃度差最大，擴散速率最快。隨著萃取的進行，萃取劑主體油脂濃度增加，濃度差越來越小，擴散速率越來越慢，萃取效率也不斷降低。增加萃取次數(shù)將提高油脂收率，即萃取一定時間后，過濾分離，分離后的微藻加入新鮮萃取劑在同樣的條件下繼續(xù)萃取，結(jié)果如圖2所示。

圖2 萃取次數(shù)對油脂收率和萃取率的影響溶劑為正己烷乙醇?！觥椭章?； ●—萃取率

從圖2可以看出，隨著萃取次數(shù)的增加，單針藻油脂收率和萃取率先快速增加，然后趨于平緩。萃取3次后，油脂萃取率即可超過80%?？紤]到萃取劑的使用量、萃取時間等因素，萃取次數(shù)一般以不超過3次為宜。

2.4 單針藻油脂分析

2.4.1 皂化物和不皂化物表4為不同萃取劑萃取得到的油脂中皂化物和不皂化物含量。從表4可以看出，三氯甲烷萃取油脂收率較高，但油脂中皂化物含量則較低。說明極性更強的三氯甲烷萃取了更多的不皂化物。而以正己烷為萃取劑萃取的油脂含有更多的中性脂，皂化物含量更高，更適宜于生物柴油的制備。而不皂化物中含有高級脂肪醇、甾醇、色素及生育酚等高附加值成分，即極性更強的萃取劑萃取更有利于提高單針藻油脂的綜合價值。

表4 不同溶劑萃取的微藻油脂收率及皂化物含量

2.4.2 油脂中脂肪酸成分脂肪酸的組成特別是碳鏈長度和不飽和脂肪酸含量對于能否適合制備生物柴油以及制備的生物柴油性質(zhì)有重要影響。碳鏈越長、飽和脂肪酸含量越多，十六烷值越高。表5為單針藻油脂經(jīng)過甲酯化后得到的脂肪酸的組成。

表5 單針藻油脂中的脂肪酸組成 w，%

從表5可以看出，單針藻油脂包含的脂肪酸種類較多，主要成分是棕櫚酸(C16∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、十八碳烯酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)及亞麻酸(C18∶3)等，其中C18∶1含量最高。因此，用于制備生物柴油，單針藻油脂會改善生物柴油低溫流動性，有效降低多不飽和脂肪酸的易氧化性。同時，較高的C16∶0和C18∶1含量可降低不飽和度，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)之和達71.59%，不飽和度為97.20%，比較適于制備生物柴油。另外，單針藻油脂還含有一定量C20以上的長鏈脂肪酸，這些物質(zhì)是普通動植物油脂不能提供的對人體健康有益的成分。

3 結(jié) 論

(1)單針藻具有明顯的單細胞特征，細胞壁主要由纖維素和半纖維素組成，壁厚大約50 nm。

(2)纖維素酶酶解可以實現(xiàn)單針藻細胞的破壁。酶解法可以在較低的溫度下萃取單針藻油脂，油脂收率大于13%，萃取率可達80%以上。

(3)單針藻油脂中脂肪酸主要由C16～C22組成，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)之和達71.59%，不飽和度為97.20%，顯示單針藻油脂可以用于制備生物柴油。