聞澤強 李大朗 宋 玨

（安徽醫(yī)科大學 藥學院， 安徽 合肥230032）

復方玉屏風 出自宋代醫(yī)家張松的《究原方》，全方由黃芪、白術、防風3 味中藥組成，其主要作用為益氣固表止汗、增強免疫［1］?，F(xiàn)多用于治療變應性鼻炎、上呼吸道感染等因表虛不固而染風邪的患者，及支氣管哮喘、慢性蕁麻疹等因感染風邪而至病況反復發(fā)作的患者，甚至用于治療因傷風感冒而誘致腎小球腎炎病況反復的患者［2-3］。

OATs 屬于溶質載體超家族SLC22，主要是分布在腎小管上皮細胞基底膜側的轉運蛋白，有機陰離子（OAs） 可以通過其轉運功能被近端小管上皮細胞從血液中吸收［4-5］。OATs 轉運功能是腎臟排泄機制中非常重要的一步，許多種藥物都是通過OATs 蛋白經腎臟排泄［6-7］。在這一排泄過程中，藥物可能因為OATs 表達量或活性受到改變而蓄積在體內或者使其排泄加快，從而改變療效和毒副作用；抑或是幾種藥物相互競爭OATs 而發(fā)生藥物之間的拮抗作用影響機體［8-9］。本課題前期實驗［10］表明，玉屏風水煎劑中某些組分可能通過抑制黃芪甲苷的排泄，而使其相較于黃芪水煎劑有更好的抗炎免疫作用。因此本實驗通過大鼠及HEK-293 細胞探討玉屏風及其組分對OAT1／3 基因及蛋白表達的影響。

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠，雄性，普通級，體質量（225±30） g，購自安徽醫(yī)科大學動物中心，動物使用許可證號SYXK（皖） 2017-006。所有的動物均處在穩(wěn)定舒適的環(huán)境中生存，室溫控制在25℃左右，相對濕度維持在40%～60%，光照周期12 h／12 h，進食及飲水自由，飼養(yǎng)1 周后用于實驗。動物實驗的福利要求均符合相關的實驗動物管理條例和實驗動物倫理的要求。

1.2 細胞株 HEK-293 細胞（貨號SE0059，ACTT 細胞庫） 購自武漢塞維爾生物科技有限公司，具有穩(wěn)定表達OAT1／3 蛋白的功能，用含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 藥物與試劑黃芪飲片Astragalus membranaceus（Fisch） Beg、白術飲片（炒）Atractylodes macrocephalaKoidz.及防風飲片Saposhnikovia divaricata（Turcz.） Schischk 均購自安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，由安徽醫(yī)科大學藥學院研究員吳婷妮鑒定為正品；DMSO（貨號MFCD00002089）、MTT（貨號EZ2411A401） 購自美國Sigma 公司；全蛋白提取試劑盒（強）（貨號BC3710100T） 購自北京索萊寶科技有限公司；BCA 蛋白定量檢測試劑盒（貨號G2026） 購自武漢塞維爾生物科技有限公司；預染蛋白Marker（貨號26616）、TRIzol Reagent（貨號15596） 購自美國Thermo Scientific 公司；β-actin 抗體（貨號AV0402）、OAT1 抗體（貨號AB08214578）、OAT3抗體（貨號AE081010） 購自北京博奧森生物技術有限公司；二抗（山羊抗兔，貨號133599）、二抗（山羊抗鼠，貨號133499） 購自北京中山金橋生物有限公司；ECL 超敏化學發(fā)光液（貨號161204-34，美國Advansta 公司）；PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒（貨號RR036Q）、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（貨號RR820 A） 購自寶日醫(yī)生物技術（北京） 有限公司。

1.4 儀器 Mini-PROTEAN Tetra 垂直電泳槽、PowerPacTMBasic 電泳儀電源、Bioshine ChemiO 4600 電泳儀電源、CFX ConnectTM熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)均購自美國Bio-Ead 公司；Multiskan MK3 酶標儀、TE Thermo Cycle 逆轉錄儀均購自美國Thermo Scientific 公司。

2 方法

2.1 藥物制備 參考本課題組前期實驗方法［10］，將黃芪、白術、防風按照3∶1∶1（60 g∶20 g∶20 g） 比例混合，加入6 倍體積超純水，浸泡1 h，加熱煮至沸，用文火繼續(xù)煎煮40 min，趁熱用雙層紗布過濾；收集濾渣，加入4 倍體積超純水按相同的方法繼續(xù)煎煮1 次；整合2 次濾液，加中火繼續(xù)煎煮成濃縮液，最后將藥液定量至質量濃度為2 g 生藥／mL（玉屏風水煎劑） 藥液。用相同的方法分別制備黃芪、白術、防風水煎劑（各組水煎劑最終質量濃度為1.2 g 生藥／mL）。

2.2 分組及給藥 將大鼠分為正常組、玉屏風組（10 g 生藥／kg）、白術組（6 g 生藥／kg）、防風組（6 g 生藥／kg）、黃芪組（6 g 生藥／kg），每組6只，灌胃給藥1 次／d，連續(xù)給藥21 d。取腎臟保存。

2.3 MTT 實驗 參考文獻［11］。將細胞懸液接種在96 孔板（100 μL／孔，0.5×104～1×104／孔），邊加細胞懸液邊吹打以確保每孔細胞數均等，培養(yǎng)6 h 貼壁，各組給予不同質量濃度藥物（0、50、60、70、80、90、100 mg 生藥／mL），藥物處理24 h；每孔加入20 μL MTT，避光孵育4 h，棄去上清液；每孔加入150 μL DMSO，放置搖床上震蕩10 min，用酶標儀檢測490 nm 處OD，每組設3個復孔取平均值進行計算。細胞存活率＝［（OD實驗組-OD空白組） ／（OD對照組-OD空白組）］×100%。

2.4 Western blot 法檢測OAT1／3 蛋白表達 參考文獻［12］。大鼠腎臟及細胞樣品總蛋白的提取按照全蛋白提取試劑盒步驟進行提取，采用BCA 蛋白定量檢測試劑盒對樣品進行定量。配置10% 分離膠和5% 濃縮膠進行電泳，80 V 恒壓電泳30 min，電壓120 V 電 泳70 min；轉膜設置為200 mA恒流；一抗（OAT1 為3∶7 000，OAT3 為3∶7 000，β-actin 為1∶4 000） 孵育過夜，次日加入二抗（1∶4 000） 孵育1 h，最后放置于凝膠成像儀內發(fā)光采圖，通過Image-Pro Plus 6.0 測定其灰度值，采用β-actin 作為內參進行相對定量比較。

2.5 RT-PCR 法檢測OAT1／3 mRNA 表達 參考文獻［13］。大鼠腎臟及細胞總RNA 的提取按照RNA 提取試劑盒進行提取，使用Nanodrop 2000 檢測RNA 的濃度及純度。按照PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒進行逆轉錄，反應條件為37℃、14 min，85℃、30 s，1個循環(huán)。PCR 反應進行擴增，反應體系為10 μL，所需正反向引物各加入0.3 μL，無酶水1.4 μL，cDNA 3 μL，TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 5 μL；所需引物序列如表1，每個待檢基因重復做3個反應孔。PCR 反應條件為95℃預變性30 s，然后進入循環(huán)階段，每個循環(huán)包括95℃變性15 s，60℃退火60 s，60℃延伸到95℃，每15 s 升溫0.3℃，共40個循環(huán)。組織RNA 以GAPDH作為內參，細胞RNA 則以ACTB作為內參，用2-△△ct方法計算目的基因的相對表達。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism7 軟件來分析，數據以（） 來表示，多組間比較采用方差分析，以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 不同濃度藥物對HEK-293 細胞存活率的影響 如表2 所示，隨著各藥物濃度增加HEK-293細胞存活率逐漸下降，黃芪、白術24 h 安全給藥濃度為0～60 mg 生藥／mL，玉屏風組、防風組24 h安全給藥濃度為0～70 mg 生藥／mL。

表2 不同濃度藥物對HEK-293 細胞存活率的影響（n＝3）Tab.2 Effects of different concentrations of drugs on the survival rate of HEK-293 cells（n＝3）

3.2 玉屏風水煎劑對HEK-293 細胞OAT1／3 蛋白表達的影響 如圖1 所示，與正常組比較，玉屏風、白術、防風水煎劑能抑制HEK-293 細胞OAT1蛋白表達（P＜0.01），黃芪水煎劑促進HEK-293細胞OAT1 蛋白表達（P＜0.01），并且玉屏風組相較于黃芪組OAT1 蛋白表達下調（P＜0.01）；與正常組比較，玉屏風、防風水煎劑能抑制HEK-293細胞OAT3 蛋白表達（P＜0.01），白術、黃芪水煎劑能促進OAT3 蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01），并且玉屏風組相較于黃芪組OAT3 蛋白表達下調（P＜0.01）。

3.3 玉屏風水煎劑對HEK-293 細胞OAT1／3 mRNA 表達的影響 如圖2 所示，與正常組比較，玉屏風、白術、防風水煎劑能抑制HEK-293 細胞OAT1 mRNA 表達（P＜0.01），玉屏風、防風水煎劑能抑制 HEK-293 細 胞OAT3 mRNA 表 達（P＜0.05），白術、黃芪水煎劑能促進HEK-293 細胞OAT3 mRNA 表達（P＜0.05，P＜0.01）；與黃芪組相比較，玉屏風組OAT1／3 mRNA 表達下降（P＜0.05，P＜0.001）。

3.4 玉屏風水煎劑對大鼠腎組織中OAT1／3 蛋白表達的影響 如圖3 所示，與正常組比較，玉屏風、防風、白術水煎劑抑制大鼠腎組織OAT1 蛋白表達（P＜0.05），玉屏風組相較于黃芪組OAT1 蛋白表達下降（P＜0.01）；與正常組比較，玉屏風水煎劑抑制大鼠腎組織OAT3 蛋白表達（P＜0.05），而白術水煎劑促進大鼠腎組織OAT3 蛋白表達（P＜0.01）。

3.5 玉屏風水煎劑對大鼠腎組織中OAT1／3 mRNA表達的影響 如圖4 所示，與正常組比較，玉屏風、防風、白術水煎劑抑制大鼠腎組織OAT1mRNA 表達（P＜0.01）：玉屏風、防風水煎劑抑制大鼠腎組織OAT3 mRNA 表達（P＜0.01），而白術水煎劑促進大鼠腎組織OAT3 mRNA 表達（P＜0.01）。與黃芪組比較，玉屏風組OAT1／3 mRNA 表達下降（P＜0.01）。

圖2 玉屏風及水煎劑對HEK-293 細胞OAT1／3 mRNA表達的影響（n＝3）Fig.2 Effects of YPFD on the expression of OAT1／3 mRNA in HEK-293 cells（n＝3）

4 討論

方劑配伍是中醫(yī)臨床治療疾病的主要用藥方式，臨床實踐表明，中藥復方往往會比單一的中藥材產生更好的療效和更低的毒性作用［14-15］。本課題組前期實驗研究［10］顯示，白術＋黃芪配伍組相較于黃芪組用藥，能明顯增加其主要成分黃芪甲苷在大鼠體內AUC、t1／2，降低黃芪甲苷的清除率。提示這種由藥物相互作用引起的藥動學的改變可能與黃芪甲苷體內排泄有關。由黃芪甲苷的結構解析可以判斷黃芪甲苷在體內可能以陰離子的形式存在，有研究［16］表明，腎臟排泄是黃芪甲苷的重要排泄途徑，協(xié)同效應可能與黃芪甲苷腎臟排泄過程的變化有關。OAT1／3 蛋白在調節(jié)腎臟排泄及內源性和外源性有機陰離子（包括各種藥物及其代謝物）的再吸收方面起著很重要的作用。因此本課題考察了玉屏風及其組分黃芪、白術、防風水煎劑對大鼠腎臟及HEK-293 細胞中OATs 的2個亞型OAT1 和OAT3 的蛋白和基因表達的影響。

圖3 玉屏風水煎劑大鼠腎組織中OAT1／3 蛋白表達的影響（n＝5）Fig.3 Effects of YPFD on OAT1／3 protein expression in kidney tissue of rats（n＝5）

圖4 玉屏風水煎劑對大鼠腎組織中OAT1／3 mRNA 表達的影響（n＝5）Fig.4 Effects of YPFD on OAT1／3 mRNA expression in kidney tissue of rats（n＝5）

根據大鼠腎組織Western blot 結果顯示，與正常組和黃芪組相比，玉屏風組的OAT1／3 蛋白表達出現(xiàn)顯著降低，這與檢測OAT1／3 mRNA 表達結果相同。而且HEK-293 細胞中OAT1／3 蛋白及mRNA表達調節(jié)作用與動物體內相似。這些實驗結果結合前期藥動學實驗結果足以表明，玉屏風可能通過下調腎臟中OAT1／3 mRNA 表達，降低OAT1／3 蛋白表達，從而減少體內黃芪甲苷的腎臟排泄，提高其生物利用度。玉屏風和防風藥物毒性很低，在一定的劑量使用范圍內比較安全，對OATs 抑制作用顯著，因此，在玉屏風、防風聯(lián)合其它藥物使用時，應當考慮藥物相互作用而產生毒副作用。

玉屏風對有機陰離子家族OAT1、OAT3 蛋白抑制作用可能與其組方內黃芪甲苷生物利用度增高、藥效增強有關。但它們對OAT1／3 蛋白和基因所產生抑制作用的機理尚不明確，以及對腎臟其它藥物轉運體的影響有待更進一步研究。