王麗娜 羅 竹 黃小朵 徐昌君 嚴春蘭 羅進程 楊長福

（貴州中醫(yī)藥大學， 貴州 貴陽550002）

特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）發(fā)病早期，肺組織炎癥細胞浸潤會引起肺間質(zhì)膠原蛋白增生，破壞正常肺泡結(jié)構(gòu)，引起肺泡數(shù)量減少、閉索，加速IPF 的發(fā)展。這種炎癥細胞浸潤形成的纖維化肺組織，可能與焦亡有關(guān)。焦亡是一種炎性程序性細胞死亡的方式，已經(jīng)有報道顯示細胞焦亡可以參與神經(jīng)炎癥［1］、腫瘤［2］、心血管疾?。?］、感染類疾?。?］等的炎性發(fā)展過程。藥物干預能夠抑制焦亡，改善炎癥。

實驗研究提示，黃芪、丹參可抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織NF-κB 活化，有利于減輕氣道重構(gòu)［1］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)由黃芪、黨參、百部、補骨脂、桑白皮、丹參組成的加減補肺湯能改善博來霉素誘導的肺纖維化大鼠炎性細胞浸潤，減輕肺纖維化程度［5］。黃芪甲苷通過增強自噬活性，可以降低焦亡蛋白caspase-1，IL-1β 和IL-18 等的表達，控制IPF 炎癥和纖維化發(fā)生發(fā)展［6］。藥對黃芪-丹參治療肺纖維化是否與抑制焦亡有關(guān)，缺乏研究。因此，本實驗研究藥對黃芪-丹參對IPF 發(fā)病肺泡炎癥、間質(zhì)性纖維化的影響及其對細胞焦亡的調(diào)控作用。

1 材料

1.1 動物 SPF 級C57BL／6 健康雄性小鼠60 只，6 周齡，體質(zhì)量（15±3） g，購自長沙維通利華實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（湘） 2018-0001。適應性喂養(yǎng)1 周，自由飲食、飲水。

1.2 藥物黃芪購自貴州同濟堂中藥飲片有限公司，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學魏升華教授鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge.var.mongholicus（Bge.） Hsiao 干燥根，根據(jù)《中國藥典》 2015 版，稱取黃芪30 g，以1 倍量水量取，8 倍量水浸泡，用武火煮開后文火煎煮30 min，濾過，殘渣加6 倍量水再煎煮2 次，濾過，合并濾液，濃縮過濾藥物至50 mL，取30 ml 備用，藥物濃度為0.6 g 生藥／mL。丹參購自貴州同濟堂中藥飲片有限公司，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學魏升華教授鑒定為唇形科植物Salvia miltiorrhizaBge.干燥根，根據(jù)《中國藥典》 2015 版，稱取丹參15 g，以1 倍量水量取，8 倍量水浸泡，用武火煮開后文火煎煮30 min，濾過，殘渣加6 倍量水再煎煮2 次，濾過，合并濾液，濃縮過濾藥物至50 mL，取30 mL 備用，藥物濃度為0.3 g 生藥／mL。黃芪-丹參藥對（稱取黃芪30 g，丹參15 g，方法同上，藥物濃度為0.45 生藥g／mL）。地塞米松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號131220）。

1.3 試劑 博萊霉素注射劑（日本化藥株式會社，批號730342）；蘇木精伊紅染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號C0105）；Masson 膠原染色試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批號20180424）；羥脯氨酸試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批號20190508）；免疫組化試劑盒（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，批號k152411B）；抗體p-IKK（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，批號72K1671）；抗體NF-κB（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號AF1234）；抗體NLRP3（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，批號315101s）；抗 體IL-1β（英 國Abcam 公司，批號G123187186-2）；DAB 顯色液（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，批號k1556158）；抗體TNF-α（英國Abcam 公司，貨號ab1793）；總蛋白提取試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號P1250）；轉(zhuǎn)膜液（美國Bio-Rad 公司，批號10026938）；10×TBST（北京索萊寶科技有限公司，批號20181101）；膜再生液（北京索萊寶科技有限公司，批號20180508）；PVDF 膜（德國默克公司，批號R8BA4734F）；ECL 超敏發(fā)光液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號1815a01）；5×電泳液（北京索萊寶科技有限公司，批號20181022）；BCA 蛋白定量試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，批號20314）。

1.4 儀器 DP73＋standard 1.6型顯微鏡攝像CCD 照相系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）；LD4-2型低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；SDS-PAGE 凝膠試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；蛋白凝膠電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；BIO-RAD半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-Rad 公司）；BIO-RAD 凝膠成相系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 造模及分組 雄性C57BL／6 小鼠60 只，采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、地塞米松組、黃芪組、丹參組、黃芪-丹參藥對組，每組10 只。4% 水合氯醛（10 mL／kg） 腹腔注射麻醉小鼠，將小鼠呈仰臥位，固定于鼠臺上。酒精棉球消毒頸部氣管部位，用剪刀和手術(shù)鑷逐層分離頸部氣管部位皮膚，直至暴露氣管，模型組及藥物處理組使用注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入，緩慢注入博萊霉素（5 mg／kg）［3］，假手術(shù)組注入生理鹽水，縫合，待其自然蘇醒。

2.2 給藥 造模后第2 天開始灌胃給藥，參照《中藥藥理與實驗方法》 人與小鼠表皮面積的換算方式確定黃芪組、丹參組、藥對黃芪-丹參組小鼠的給藥劑量分別為6、3、4.5 g／kg，地塞米松組小鼠的給藥劑量為0.125 g／kg，給藥體積為0.1 mL／10 g，假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水灌胃。1 次／d，連續(xù)給藥28 d。

2.3 取材 小鼠給藥灌胃28 d 后，小鼠禁食不禁水12 h，處死小鼠，將肺門部組織左側(cè)肺葉置于4%多聚甲醛固定，右側(cè)肺葉于凍存管中放置于-80℃冰箱備用。

2.4 HE 染色 肺組織按照常規(guī)方法固定、脫水、石蠟包埋后，小鼠肺組織石蠟切片二甲苯脫蠟2 次，按規(guī)定時間進行酒精梯度脫水，蘇木精染色洗滌后，進行伊紅染色，最后乙醇脫水，二甲苯透明2 次，中性樹膠封片，顯微鏡觀察拍片。

2.5 Masson 膠原染色 石蠟切片脫蠟，脫水步驟同“2.4” 項下。麗春紅品紅染色液染色，弱酸洗滌，磷鉬酸溶液染色，弱酸溶液洗滌，苯胺藍染色液染色，弱酸洗滌，酒精常規(guī)脫水脫水，二甲苯透明3 次，中性樹膠封片，晾干后，低溫保存，顯微鏡觀察拍片。

2.6 羥脯氨酸含有量測定 配置相關(guān)試劑，稱取100 mg肺組織，按照堿性水解法裂解進行樣本前處理，調(diào)至合適pH 值。取1 mL 上清按照操作表的操作步驟操作，酶標儀檢測550 nm 波長處OD，計算各組羥脯氨酸含有量。

2.7 免疫組化檢測 脫蠟、脫水步驟同 “2.4” 項下，PBS 洗滌3 次，用檸檬酸緩沖液置于微波爐中進行抗原修復，冷卻后，0.01% Triton 破膜打孔，3% H2O2滅活過氧化氫酶，免疫封閉液進行封閉，加入TNF-α 一抗，置于暗盒中，4℃冰箱孵育過夜。次日，載玻片復溫，加二抗37℃孵育，DAB 顯色，蘇木精染色，常規(guī)方法脫水透明后進行中性樹膠封片，顯微鏡觀察拍片。

2.8 Western blot 檢測 稱取組織約80 mg，加入1 000 μL裂解液，勻漿機4 000 r／min 破碎組織，抽取0.5 mL組織勻漿液，靜置，加入2 倍體積抽提試劑混勻，4℃靜置10 min，10 000 r／min 離心，除去上下相液體，保留中間分離相的蛋白膜，1% SDS 溶解蛋白膜。BCA 蛋白定量檢測，按照蛋白樣品與上樣緩沖液3∶1 的比例加入上樣緩沖液，95℃煮沸蛋白變性。上樣量為50 μg 蛋白質(zhì)，SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，電壓80～120 V，電泳1.5 h，半干轉(zhuǎn)25 V 電壓轉(zhuǎn)膜5 min；5% 脫脂牛奶封閉1 h，加入TNF-α（1∶500）、p-IKK（1∶ 1 000）、NF-κB（1∶ 1 000）、NLRP3（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000） 一抗，4℃孵育過夜，次日，1×TBST 洗滌3 次，5 min／次；加入二抗（1∶5 000），常溫下輕度搖床孵育1 h，1×TBST 洗滌3 次，5 min／次，滴加超敏發(fā)光液，蛋白凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。

2.9 統(tǒng)計學分析 采用Image-Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件進行免疫組化圖像的分析，Image J 專業(yè)軟件分析Western blot 條帶。SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件進行分析，數(shù)據(jù)以（） 表示，符合正態(tài)分布并且符合方差齊性時，多組間比較采用單因素方差分析。以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 肺組織HE 染色結(jié)果 假手術(shù)組小鼠肺泡間隔無增厚，無充血和水腫，結(jié)構(gòu)清晰，無明顯炎癥改變；模型組小鼠肺泡間隔明顯水腫，毛細血管充血，肺泡壁增厚，肺組織肺泡結(jié)構(gòu)塌陷，肺泡腔內(nèi)有大量炎癥細胞出現(xiàn)，大量肺纖維結(jié)節(jié)存在于肺間質(zhì)內(nèi)，纖維化瘢痕形成；各給藥組與模型組相比炎癥細胞有所減少，地塞米松組與黃芪-丹參藥對組有輕微炎癥反應，肺泡結(jié)構(gòu)相對清晰，纖維增生不明顯，與模型組比較改善作用明。見圖1。

3.2 肺組織Masson 膠原染色結(jié)果 假手術(shù)組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間質(zhì)內(nèi)以氣管為中心的少量膠原藍染色為正常膠原表達的顏色；模型組肺泡塌陷，萎縮，有大量纖維膠原出現(xiàn)，呈實變樣，說明纖維化程度加深。與模型組比較，給藥組膠原纖維表達減少，地塞米松組與黃芪-丹參藥對組肺紋理尚清晰，膠原染色不明顯，與模型組相比較有明顯改善作用。見圖2。

圖1 HE 染色觀察肺組織肺泡炎癥（×200）

圖2 Masson 染色觀察肺組織膠原纖維（×200）

3.3 肺組織羥脯氨酸含有量檢測結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組羥脯氨酸含有量升高（P＜0.01）；與模型組相比，地塞米松組與黃芪-丹參藥對組的羥脯氨酸含有量降低（P＜0.01）。見表1。

表1 黃芪-丹參藥對對肺組織羥脯氨酸含有量的影響（，n＝3）

注：與假手術(shù)組相比，＃＃P＜0.01；與模型組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與黃芪-丹參藥對藥對組比較，△△P＜0.01。

3.4 免疫組化染色結(jié)果 假手術(shù)組小鼠有少量TNF-α 表達，與假手術(shù)組相比，模型組肺泡區(qū)與肺間質(zhì)區(qū)的TNF-α 表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪-丹參藥對組、黃芪組TNF-α 表達均降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3、表2。

3.5 Western blot 測定結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組TNF-α、p-IKK、NF-κB、NLRP3、IL-1β 表達升高（P＜0.01），與模型組相比，黃芪-丹參藥對能抑制上述蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4、表3。

4 討論

我國是一個人口嚴重老齡化的國家，IPF 患病人數(shù)每年都呈增長趨勢，保守估計有50 萬患者。IPF 是一種慢性間質(zhì)性肺病，起病隱匿，病情逐漸加重。IPF 一經(jīng)診斷，平均生存期僅2.8 年，死亡率高于大多數(shù)腫瘤，被稱為一種“類腫瘤疾病”。該疾病嚴重影響患者生活質(zhì)量，因此受到了廣泛的關(guān)注。目前，臨床主要以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等藥物來治療，但激素類藥物存在一定副作用，甚至可導致呼吸道感染，中醫(yī)治療以益氣活血為主，臨床上取得較好療效。

圖3 免疫組化檢測各組小鼠肺組織TNF-α 表達（IHC，×200）

表2 黃芪-丹參藥對對小鼠肺組織TNF-α 表達的影響（， n＝6）

表2 黃芪-丹參藥對對小鼠肺組織TNF-α 表達的影響（， n＝6）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與黃芪-丹參藥對組比較，△△P＜0.01。

圖4 Western blot 測定肺組織TNF-α、p-IKK、NF-κB、NLRP3、IL-1β 蛋白表達

IPF 在中醫(yī)歸屬于“肺痹” “肺萎” 范疇，主要病機為氣滯血瘀。黃芪具有補氣、利尿、排膿、生肌等功效，現(xiàn)代研究［7］發(fā)現(xiàn)黃芪還可以抗病毒、降血糖、抗氧化、改善記憶力和提高免疫力。黃芪中含有多種活性成分，其中黃芪總黃酮和總皂苷能夠干預博萊霉素導致肺纖維化小鼠肺泡炎癥，抑制早期纖維化結(jié)節(jié)的出現(xiàn)［6］。丹參具有活血涼血、化瘀消癰等功效。現(xiàn)代研究［8-9］表明，丹參不僅可以調(diào)節(jié)微循環(huán)、促進肝細胞再生，還可以抗脂質(zhì)過氧化和抗肝纖維化。丹參水提分離得到的丹參素，可緩解大鼠肺泡炎和肺纖維化的進程，防治肺間質(zhì)性纖維化［10-11］。丹參酮ⅡA可以抑制肺纖維化大鼠TGF-β1 蛋白表達，并且能夠影響致纖維化關(guān)鍵性因子Smad2／3 信號通路［12］。藥對是中醫(yī)臨床常用的相對固定的2個藥味的配伍組合，是中藥配伍應用的基本形式。黃芪-丹參藥對可以降低防抗結(jié)核藥物帶來的副作用，從而保護肝功能，其原因可能是丹參能夠協(xié)同黃芪產(chǎn)生抗氧化、清除氧自由基，改善肝臟微循環(huán)等作用［8-9］。

細胞焦亡是在細胞感染過程中參與多種疾病炎癥過程的一種炎性細胞程序性死亡過程。當細胞受到外界微生物感染時，模式識別受 體（pattern-recognition receptors，PRRs） 識別相關(guān)分子模式，啟動免疫反應，炎癥細胞突破免疫應答，會誘導血液中的單核細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞，巨噬細胞在促炎因子TNF-α 的刺激下激活NF-κB 相關(guān)通路，通過接頭蛋白ASC 募集半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶酶原（pro-caspase-1），形成多蛋白復合體，稱為炎癥小體（inflammasome）［13］，其中以 NLRP3 炎癥小體研究報道最多［14-15］。在焦亡激活信號通路中，pro-IL-1β／pro-IL-18 的表達是通過細胞膜上的Toll 樣受體（Toll-likereceptors，TLR） TLR4 識別細菌脂多糖（LPS），激活NF-κB 信號通路而引起的。隨后，細胞內(nèi)的NLRP3 炎性小體可以識別相關(guān)分子模式，與接頭蛋白ASC組裝后，招募pro-caspase-1［16］，pro-caspase-1 發(fā)生自體剪切，活化成caspase-1［17］。caspase-1 激活pro-IL-1β／pro-IL-18，釋放至胞外，從而引起細胞焦亡［18-19］。焦亡發(fā)生后，細胞膜崩解，釋放胞質(zhì)內(nèi)毒素分子，引起炎癥細胞趨化，并促進炎癥細胞釋放細胞因子。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，細胞焦亡過程對肺纖維化發(fā)生發(fā)展具有一定意義。TNF-α 作為激活細胞焦亡相關(guān)蛋白的關(guān)鍵促炎因子，重點參與了IPF 疾病過程中的細胞焦亡。

表3 黃芪-丹參藥對對肺組織TNF-α、p-IKK、NF-κB、NLRP3、IL-1β 的表達（， n＝3）

表3 黃芪-丹參藥對對肺組織TNF-α、p-IKK、NF-κB、NLRP3、IL-1β 的表達（， n＝3）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與黃芪-丹參藥對組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

TNF-α 是一種生物活性廣泛的胞漿性促炎因子，它可以參與多種病理過程，例如炎性反應、免疫應答和內(nèi)毒素性休克等，并且可以產(chǎn)生抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫力和抗感染的作用［20］。研究發(fā)現(xiàn)肺纖維化的形成與毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞［21］的損傷有關(guān)，而這一過程，促炎因子TNF-α 發(fā)揮了重要作用，它刺激NF-κB 信號通路，使血管內(nèi)的單核細胞轉(zhuǎn)化為肺泡巨噬細胞（alveolar macrophage，AM）。刺激活化后的AM 可以釋放大量的炎性介質(zhì)，從而損傷、破壞正常肺泡結(jié)構(gòu)，引起肺泡數(shù)量減少、閉索，形成肺纖維化。在這一過程中，TNF-α 可以直接或間接激活NF-κB 信號通路，引 起 NLRP3 的蛋白表達，調(diào) 控caspase-1，引起細胞焦亡［22-23］。由此可見，細胞焦亡與肺泡炎癥及間質(zhì)性纖維化之間存在可能性的機制，有待進一步的探討。

本實驗在IPF 模型小鼠中觀察黃芪-丹參藥對對焦亡相關(guān)通路的調(diào)控作用。實驗模型組的炎癥反應和纖維化結(jié)節(jié)大量增生，肺纖維實變區(qū)TNF-α、p-IKK、NF-κB、NLRP3、IL-1β 呈現(xiàn)高表達。黃芪、丹參、黃芪-丹參藥對可不同程度下調(diào)TNF-α、p-IKK、NF-κB、NLRP3、IL-1β 表達，其中黃芪丹參藥對組較藥物單獨使用的治療效果更佳。綜上所述，藥對黃芪丹參對IPF 有治療作用，其作用機制可能通過抑制TNF-α、p-IKK、NF-κB、NLRP3、IL-1β 等焦亡相關(guān)蛋白的表達，減輕炎癥反應，最終調(diào)控IPF 的發(fā)生發(fā)展。