陳宏降 劉佳楠 阮洪生 曹 崗 王翰華 彭 昕*

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校， 浙江 寧波315100； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)， 浙江 杭州310053）

中藥魚腥草、三白草分別來源于三白草科植物蕺菜Houttuynia cordataThunb.和三白草Saururus chinensis的新鮮全草或干燥地上部分，均收載于2015 年版《中國藥典》 一部［1］。三白草和魚腥草的藥（食） 用部位均存在一定程度混亂現(xiàn)象，三白草在《中國藥典》 中記載，2000 年版以前用全草或根莖，2005 年版以后僅用地上部分，而在《中藥大辭典》 《中華本草》 等專著中將“三白草根” 單獨(dú)列為一味中藥［2］。魚腥草為藥食兩用常用中藥，為治療肺癰之要藥，已被列入國家衛(wèi)計(jì)委頒布的“按照傳統(tǒng)既是食品又是藥品的物品名單”，目前魚腥草藥用多選用地上部分，云南、貴州、四川、浙江等地居民一直有食用魚腥草的習(xí)慣，然而食用部位存在一定差異，多食用根莖部分。

項(xiàng)目組前期研究表明三白草地上部分和根莖的醇提物對小鼠均具有較強(qiáng)的毒性，LD50分別為 17.15、3.15 g／kg［3］。部分本草專著記載魚腥草有小毒［4］，如《本草綱目》 中記載“魚腥草味辛，性微溫，有小毒”；《名醫(yī)別錄》 中記載“魚腥草多食令人氣喘”?，F(xiàn)代研究表明魚腥草醇提物喂養(yǎng)13 周對正常大鼠具有一定的腎毒性［5］，且從三白草和魚腥草中分離鑒定出馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、BⅡ、FⅡ及三白草內(nèi)酰胺等多種馬兜鈴內(nèi)酰胺類生物堿［6］，馬兜鈴內(nèi)酰胺類生物堿是否存在腎毒性尚存在一定爭議［7-8］。

斑馬魚作為一種新的模式動物，其體積小、高通量、費(fèi)用低、周期短，在藥物研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［9］。目前在中藥的活性部位篩選、安全性評價(jià)、毒性靶器官發(fā)現(xiàn)以及藥物代謝等方面均有廣泛應(yīng)用［10-13］。因此，本文采用斑馬魚模型對魚腥草和三白草不同部位的醇提物進(jìn)行毒性研究，為臨床合理用藥和藥用部位的選擇提供一定參考。

1 材料

1.1 動物 野生型斑馬魚（南京堯舜禹生物科技有限公司），實(shí)驗(yàn)期間，水溫保持在（25 ± 0.5 ）℃，溶解氧≥5 mg／L，pH 為6.8～7.2，光照周期14 L∶10D，每天定時(shí)定量投喂斑馬魚專用飼料。實(shí)驗(yàn)經(jīng)杭州環(huán)特生物科技股份有限公司動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)（001458）。

1.2 藥物與試劑 三白草、魚腥草地上部分和根莖購自安徽亳州中藥材市場，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為三白草科三白草Saururus chinensis和蕺菜Houttuynia cordataThunb.的干燥地上部分和根莖，標(biāo)本存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室藥材室。馬兜鈴內(nèi)酰胺A Ⅱ、三白草內(nèi)酰胺從三白草中分離得到（HPLC 面積歸一化測定純度大于98%）［14］；DMSO（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生科技發(fā)展公司）；Axio Zoom V16型蔡司體式熒光顯微鏡（德國Zeiss 公司）；Sartorius BT125D型電子天平（德國Sartorius 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品制備 取魚腥草地上部分、魚腥草根莖、三白草地上部分和三白草根莖粗粉，分別加10、8 倍量95%乙醇回流提取2 次（第1 次2 h，第2 次1.5 h），過濾，合并提取液減壓濃縮，冷凍干燥，即得，得率分別為7.05%、8.72%、6.74%、7.50%。取各提取物適量，用DMSO 溶解后（DMSO 終濃度不高于0.5%），再用飼養(yǎng)用水稀釋成不同濃度藥液。

2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn) 據(jù)參考文獻(xiàn)［14］報(bào)道。

2.2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 選擇健康活潑、反應(yīng)靈敏、大小一致的斑馬魚，實(shí)驗(yàn)前1 天對斑馬魚進(jìn)行禁食。在同一規(guī)格的玻璃缸中分別加入1 L 飼養(yǎng)用水，每缸放置10 條斑馬魚，再分別加入各不同濃度的藥液。為保證試驗(yàn)濃度的準(zhǔn)確性，受試液每24 h 更換1 次。記錄各劑量組96 h 內(nèi)斑馬魚的死亡數(shù)量和死亡率，確定各藥液的全部死亡的最小濃度（LC100） 和全部存活的最大濃度（LC0）。實(shí)驗(yàn)過程中及時(shí)撈出死魚，以免污染水質(zhì)。

2.2.2 正式實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的LC100和LC0的劑量范圍，設(shè)置5個(gè)濃度和1個(gè)空白組，每個(gè)濃度放置30 條斑馬魚，實(shí)驗(yàn)期間，每24 h 更換1 次藥液或飼養(yǎng)用水。記錄并統(tǒng)計(jì)96 h 內(nèi)斑馬魚的死亡率，及時(shí)撈出死魚。采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算各給藥組半數(shù)致死量（LD50） 及95%可信區(qū)間，結(jié)果見表1。

表1 三白草、魚腥草不同部位提取物對斑馬魚成魚的的急性毒性

結(jié)果表明魚腥草地上部分、魚腥草根莖、三白草地上部分和三白草根莖的95%乙醇提取物對斑馬魚成魚均具有一定的毒性，LD50分別為2.85、10.40、2.54、1.19 mg／L，（分別相當(dāng)于生藥量為40.4、119.2、37.7、15.9 mg／L）。根據(jù)魚類急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)（GB／T21281-2207），LC50≤1 mg／L為極高毒；LC50在1～10 mg／L 為高毒；LC50在10～100 mg／L為中毒；LC50＞100 mg／L 為低毒?？梢?，除魚腥草根莖提取物為中毒外，其他均為高毒。

2.3 胚胎發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 胚胎收集 取斑馬魚按1（雌）∶2（雄） 比例放置在魚缸內(nèi)，由隔板分開。次日清晨，取下隔板開始交配，30 min 后，收集胚胎。收集好的魚卵用養(yǎng)魚水沖洗3 遍，置于培養(yǎng)皿中，挑選發(fā)育一致的斑馬魚魚卵備用。

2.3.2 胚胎發(fā)育毒性研究 挑選4 hpf 發(fā)育正常的受精卵，隨機(jī)放入24 孔板中，每孔10 枚胚胎，給藥組分為魚腥草地上部分、魚腥草根莖、三白草地上部分、三白草根莖4種醇提取物組和馬兜鈴內(nèi)酰胺A Ⅱ、三白草內(nèi)酰胺2個(gè)單體化合物組，每種藥物設(shè)置5個(gè)濃度組和空白組，給藥組分別加入1.5 mL 含藥培養(yǎng)液，空白組加入等體積空白培養(yǎng)液，于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，每12 h 觀察1 次，先用胚胎培養(yǎng)液潤洗，再將斑馬魚胚胎放置具有凹槽的載玻片上，用4%甲基纖維素固定，體視顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎畸形率，并進(jìn)行拍照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較，各組提取物對斑馬魚胚胎均表現(xiàn)出較強(qiáng)的胚胎發(fā)育毒性，三白草的胚胎毒性較魚腥草明顯，尤其是三白草根莖乙醇提取物的水浴濃度僅為0.01 mg／L 即可致24 hpf 斑馬魚胚胎出現(xiàn)明顯的畸形，黑色素明顯減少，甚至死亡，無法出苗（見圖1D～F），致畸的主要表現(xiàn)為心包水腫（圖1K） 和卵黃囊水腫（圖1L）。說明三白草根莖醇提取物具有極強(qiáng)的早期胚胎發(fā)育毒性。其他提取物胚胎毒性與三白草根莖相似，相對毒性較小，在0.5 mg／L 的劑量下馬兜鈴內(nèi)酰胺AII 等馬兜鈴內(nèi)酰胺類生物堿單體化合物可導(dǎo)致斑馬魚胚胎腎包膜水腫（圖1M）；不同提取物作用于24 hpf 胚胎期斑馬魚的畸形率測定結(jié)果見圖2。

3 討論

三白草、魚腥草等三白草科藥用植物中均存在一定量馬兜鈴內(nèi)酰胺類生物堿［6，15］，該類成分是否存在肝腎毒性有一定爭議［7-8］，課題組前期研究表明三白草地上部分和根莖醇提物的小鼠急性毒性進(jìn)行研究，表明以上2 者均有較強(qiáng)的毒性，LD50分別為17.15、3.15 g／kg，尤其是根莖醇提物L(fēng)D50僅相當(dāng)于臨床最高劑量（15～30 g，體質(zhì)量按60 kg計(jì)算） 的0.63 倍［3］，本研究中采用斑馬魚模型進(jìn)一步證實(shí)三白草對斑馬魚成魚和胚胎均具有較強(qiáng)毒性，且根莖醇提物比地上部分毒性更強(qiáng)，研究結(jié)果與前期研究結(jié)果相一致。馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ、BⅡ、三白草內(nèi)酰胺等馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分在三白草中含有量較低0.070～0.128 mg／g，且主要分布在三白草地上部分而根莖中含有量更低［16］，然而根莖醇提物的毒性強(qiáng)于三白草地上部分，表明三白草中馬兜鈴內(nèi)酰胺生物堿不是其主要毒性成分，可能還存在其他毒性更強(qiáng)的物質(zhì)，具體毒性成分有待進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)過程中由于馬兜鈴內(nèi)酰胺A Ⅱ和三白草內(nèi)酰胺2個(gè)馬兜鈴內(nèi)酰胺類成分難溶于水（DMSO 終濃度不得高于0.5%），無法準(zhǔn)確測出其對斑馬魚成魚急性毒性的LD50，然而，在0.5 mg／L 劑量下馬兜鈴內(nèi)酰胺A Ⅱ和三白草內(nèi)酰胺均可導(dǎo)致24、48 hpf 斑馬魚胚胎腎包膜水腫，表明馬兜鈴內(nèi)酰胺類物質(zhì)可能存在一定的腎毒性［17］。

圖1 三白草醇提物和馬兜鈴內(nèi)酰胺AII 對24、48 hpf 斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

圖2 三白草、魚腥草醇提物對24 hpf 斑馬魚胚胎畸形率的影響

以魚腥草為原料的中成藥多達(dá)數(shù)十種，其中絕大多數(shù)是提取其揮發(fā)油或雙提法入藥，但也有部分中成藥采用醇提法或直接以魚腥草藥材粗粉入藥，是否也存在一定的毒性有待進(jìn)一步深入研究，在臨床使用過程中應(yīng)加以注意。