郭金銘 周 峰＃ 譚 洋 楊巖濤* 裴 剛

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙410208； 2.湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙410208）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN），糖尿病腎臟病變，是一種以持續(xù)性蛋白尿和腎功能漸進(jìn)性下降為臨床特征的綜合征［1］，常見(jiàn)于發(fā)生嚴(yán)重微血管病變的糖尿病患者中，是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致終末期腎臟病的首要病因［2-4］。我國(guó)由于人口老齡化和糖尿病的高發(fā)病率，糖尿病腎病的患病人數(shù)正呈逐年上升的趨勢(shì)［5］。

中醫(yī)認(rèn)為糖尿病歸屬于“消渴” 范疇，當(dāng)進(jìn)一步發(fā)展至糖尿病腎病時(shí)，其基本病機(jī)轉(zhuǎn)化為脾腎兩臟虧虛，痰、濕、瘀蘊(yùn)結(jié)，日久不化而轉(zhuǎn)為痰毒、濕毒甚至瘀毒，即脾腎虧虛、瘀毒內(nèi)蘊(yùn)［6-7］。因此，健脾固腎法常在臨床上被用于糖尿病腎病的干預(yù)和治療［8］。而茯苓作為中醫(yī)治療糖尿病腎病的常用藥物之一，來(lái)源于多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.） Wolf 的干燥菌核，味甘、淡，藥性平和，具有利水滲濕、健脾寧心的功效，主要用于治療浮腫少尿、頭暈心悸、脾胃虛弱、便溏腹瀉、焦慮失眠等［9］?，F(xiàn)代藥理研究［10-12］表明，茯苓具有抗纖維化、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等多種作用。雖然茯苓治療糖尿病腎病的臨床療效比較明確［13］，但存在作用分子機(jī)制不明確的問(wèn)題，仍需要進(jìn)一步研究探索。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于系統(tǒng)生物學(xué)和經(jīng)典藥理學(xué)等各學(xué)科理論，多角度分析藥物干預(yù)疾病作用靶點(diǎn)及機(jī)制的系統(tǒng)方法［14-15］。合理利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥的作用靶點(diǎn)及機(jī)制，契合中醫(yī)藥的整體觀念，且結(jié)果可信度較高。已有學(xué)者通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究二至丸對(duì)腎臟保護(hù)作用機(jī)制［16］、虎杖治療結(jié)直腸癌作用機(jī)制［17］、厚樸抗抑郁的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制［18］。茯苓的化學(xué)成分主要包括多糖類(lèi)、三萜類(lèi)、甾醇類(lèi)［19］，這些成分的藥理活性較為廣泛，且作用靶點(diǎn)豐富［20］，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究茯苓治療糖尿病腎病的作用靶點(diǎn)和機(jī)制。

本研究通過(guò)TCMSP、DRUGBANK、SWISS、STITCH 等數(shù)據(jù)庫(kù)，首先獲得中藥茯苓的12個(gè)主要活性成分及其預(yù)測(cè)的作用靶點(diǎn)，并結(jié)合TTD、DRUGBANK、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)所包含的糖尿病腎病的疾病相關(guān)靶點(diǎn)，同時(shí)應(yīng)用可視化軟件Cytoscape 3.7.1 構(gòu)建了“成分-靶點(diǎn)-疾病” 的交互網(wǎng)絡(luò)。最終根據(jù)DAVID 信號(hào)通路富集分析茯苓治療糖尿病腎病的潛在作用機(jī)制，為闡明茯苓治療糖尿病腎病的物質(zhì)基礎(chǔ)、作用靶點(diǎn)及機(jī)制提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)工具匯總 如表1 所示，全文涉及的數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件。

表1 本文獻(xiàn)所涉及的數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

1.2 茯苓活性成分的查找及篩選 將“茯苓” 作為檢索詞條，運(yùn)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得其包含的已知化學(xué)成分，基于OB≥30%［21-22］和DL≥0.18［23-24］2 項(xiàng)篩選原則，得到茯苓的活性成分。并在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取這些成分的SMILE 式。

1.3 茯苓活性成分作用靶點(diǎn)和糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 將活性成分的SMILE 式輸入SWISS 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取其作用靶點(diǎn)，并將TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)和STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)所預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)同時(shí)納入研究，經(jīng)過(guò)去重整合后，將靶點(diǎn)名稱(chēng)輸入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得其相應(yīng)靶點(diǎn)的人源的靶點(diǎn)基因名稱(chēng)及其ID。在TTD、DRUGBANK、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“diabetic nephropathy” 為關(guān)鍵詞對(duì)糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行檢索。

1.4 茯苓活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的建立 將依據(jù)“1.3”項(xiàng)整合的茯苓12個(gè)“活性成分” 及其“可能作用靶點(diǎn)”分列輸入Excel 表格中，把它們當(dāng)作兩類(lèi)節(jié)點(diǎn)（node），如若具有相關(guān)性則用邊（edge） 連接。采用Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建中藥茯苓“活性成分-作用靶點(diǎn)” 的交互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 茯苓活性成分-靶點(diǎn)-糖尿病腎病網(wǎng)絡(luò)分析與建立 將已經(jīng)去重整合獲得的茯苓活性成分的作用靶點(diǎn)和糖尿病腎病關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，選定物種為人，進(jìn)行蛋白互作分析。將從String 數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出的蛋白互作分析結(jié)果（tsv 格式） 導(dǎo)入Cytoscape 軟件直接獲取相互作用網(wǎng)絡(luò)。接著通過(guò)該軟件自帶的Tools 分析功能，得到上述網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中的度值（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC） 等數(shù)值，確立DC 大于所有節(jié)點(diǎn)DC 中位數(shù)2 倍的節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)［25］，并在上述網(wǎng)絡(luò)圖中將其歸屬到成分靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)和其他類(lèi)別。同時(shí)打開(kāi)“1.4” 項(xiàng)下建立的茯苓活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，點(diǎn)擊Cytoscape 軟件的關(guān)聯(lián)（Merge） 功能鍵輸出模型，形成最終的“茯苓活性成分-靶點(diǎn)-糖尿病腎病” 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 生物過(guò)程與通路分析 在DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入茯苓與糖尿病腎病相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，選定物種為人，對(duì)上述靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（GO） 分析（生物過(guò)程BP、分子功能MF、和細(xì)胞組成CC） 和KEGG 通路富集分析，下載分析結(jié)果。對(duì)P值（設(shè)定閾值P＜0.01） 從小到大進(jìn)行排序，匯集排在前十名的生物過(guò)程或通路，用GraphPad Prism 7.0 繪圖后，進(jìn)行解析說(shuō)明。

2 結(jié)果

2.1 茯苓活性成分的匯集和篩選 本研究依托TCMSP 平臺(tái)檢索茯苓的化學(xué)成分，共獲得34個(gè)化合物。經(jīng)由OB、DL 值篩選得到化合物15個(gè)，刪除尚未找到作用靶點(diǎn)的化合物3個(gè)，最終得到活性成分12個(gè)，見(jiàn)表2。

表2 茯苓經(jīng)OB 和DL 篩選所得12個(gè)化合物信息

2.2 茯苓活性成分作用靶點(diǎn)和糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 在TCMSP、SWISS、STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)中，輸入上述12個(gè)茯苓活性化合物進(jìn)行檢索，以預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)，剔除重復(fù)的靶點(diǎn)，得到作用靶點(diǎn)共計(jì)279個(gè)。通過(guò)檢索TTD、DRUGBANK、OMIM 等多個(gè)與疾病相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到46個(gè)與糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展具有緊密關(guān)聯(lián)的已知靶點(diǎn)基因。

2.3 茯苓活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在Cytoscape 界面中初步建立茯苓活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。據(jù)軟件統(tǒng)計(jì)分析共有291個(gè)節(jié)點(diǎn)，84 390 條邊，其中正方形代表茯苓的活性成分，圓形代表其作用靶點(diǎn)。多個(gè)茯苓活性成分均可作用于多個(gè)不同的靶點(diǎn)；從而反映出茯苓多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同治療的特點(diǎn)。

圖1 茯苓活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 茯苓活性成分-靶點(diǎn)-糖尿病腎病網(wǎng)絡(luò)分析與建立 通過(guò)計(jì)算每個(gè)蛋白的拓?fù)湫再|(zhì)尋找茯苓治療糖尿病腎病作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，最后獲得42個(gè)DC≥36（即2 倍DC 中位數(shù)）的節(jié)點(diǎn)作為主要節(jié)點(diǎn)，繪制其互作圖（圖2），其中圓形表示活性成分作用靶點(diǎn)，三角形表示糖尿病腎病疾病相關(guān)靶點(diǎn)，菱形表示共同靶點(diǎn)，正方形表示活性成分。

2.5 生物過(guò)程與通路分析 生物過(guò)程分析中可以看出，靶點(diǎn)主要涉及蛋白質(zhì)磷酸化、發(fā)熱、NO 生物合成、胞質(zhì)Ca2＋濃度的正向調(diào)控過(guò)程、磷脂酶C 激活G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、痛覺(jué)產(chǎn)生和感知過(guò)程、多種應(yīng)答過(guò)程（脂多糖反應(yīng)、嗎啡反應(yīng)、免疫反應(yīng)）、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑等生物過(guò)程。分子功能分析中可以看出，靶點(diǎn)具備能和酶（磷脂酰肌醇磷脂酶C 等）、激酶（MAP 激酶等）、類(lèi)固醇、類(lèi)固醇激素受體、神經(jīng)肽、藥物、型血管緊張素受體等結(jié)合的分子功能。細(xì)胞組成分析中可以看出，靶點(diǎn)主要分布于細(xì)胞膜（membrane）、質(zhì)膜（plasma membrane）、核內(nèi)體（endosome）、神經(jīng)元胞體（perikaryon）、軸突末端（axon terminus）、樹(shù)突（dendrite） 等。見(jiàn)圖3～4。

通過(guò)對(duì)茯苓治療糖尿病腎病的42個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，得到41 條主要的生物信號(hào)通路，按P值由小到大排序選取與糖尿病腎病相關(guān)的通路10 條（表3），說(shuō)明茯苓活性成分治療糖尿病腎病的作用靶點(diǎn)分布在不同的代謝通路。

3 討論

圖2 茯苓活性成分-靶點(diǎn)-糖尿病腎病關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖3 茯苓活性成分治療糖尿病腎病的GO 分析-柱狀圖

圖4 茯苓活性成分治療糖尿病腎病的GO 分析-氣泡圖

表3 茯苓活性成分治療糖尿病腎病的KEGG 通路分析

糖尿病腎病發(fā)病因素（如遺傳因素、自身免疫性疾病、病毒感染、藥物等） 復(fù)雜，涉及多種機(jī)制之間的相互作用，包括微循環(huán)障礙、糖代謝或脂代謝異常、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及炎癥反應(yīng)等［26-27］。腎小球、腎小管等結(jié)構(gòu)在其疾病發(fā)展過(guò)程中也會(huì)發(fā)生病理學(xué)特征性改變［28］。目前臨床上西醫(yī)對(duì)于糖尿病腎病的治療仍以對(duì)癥治療為主，如調(diào)節(jié)血壓、血糖、血脂，選用的藥物通常受到限制且常伴有不良反應(yīng)［29］；而茯苓作為健脾益腎之佳品，以其為主要藥物的中藥復(fù)方因其獨(dú)特的療效和多成分、多靶點(diǎn)及多途徑的作用特點(diǎn)，在糖尿病腎病的治療中占據(jù)重要地位；然而茯苓是通過(guò)何種途徑、何種機(jī)制抗糖尿病腎病尚不清楚［30］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)多角度系統(tǒng)分析規(guī)律與中醫(yī)整體觀念的用藥原則基本一致，有助于系統(tǒng)地闡釋茯苓治療糖尿病腎病的復(fù)雜作用機(jī)制［31］。

本研究以TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選所得12 種活性成分（主要分為三萜類(lèi)、甾醇類(lèi)） 為基礎(chǔ)，構(gòu)建了茯苓“活性成分-作用靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)圖，體現(xiàn)了茯苓發(fā)揮治療作用的成分多樣、靶點(diǎn)豐富的優(yōu)勢(shì)；而茯苓“活性成分-靶點(diǎn)-糖尿病腎病” 靶點(diǎn)互作圖在一定程度上反映出它們之間存在復(fù)雜交錯(cuò)的相互關(guān)系，并非獨(dú)自發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，氫化松苓酸，啤酒甾醇，常春藤皂苷元，去氫齒孔酸連接靶點(diǎn)數(shù)量較多，在一定程度上推測(cè)它們是茯苓發(fā)揮治療糖尿病腎病作用的主要活性成分。而MAPK3、IL-6、APP、TNF、PTGS2、MAPK8、IL-1β、AGTR1 等度值較大，是茯苓活性成分的主要作用靶點(diǎn)；其中IL-1β、IL-6 和TNF 作為炎性因子，通過(guò)多種途徑參與了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展［32］，例如腎臟內(nèi)炎性細(xì)胞過(guò)度表達(dá)的TNF-α，不僅讓糖尿病患者腎小球微血管通透性得到加強(qiáng)，繼而出現(xiàn)糖尿病腎病的明顯病理特征—蛋白尿；還能加快其腎小管上皮細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，導(dǎo)致患者腎臟早期損傷和腎纖維化［33-34］?，F(xiàn)有體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)［35］表明，茯苓酸作為茯苓的代表化合物之一，不僅能夠通過(guò)下調(diào)心肌細(xì)胞IL-1、IL-6、TNF-α 等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，發(fā)揮其抗炎作用［20］，還能通過(guò)增強(qiáng)胰島素敏感性顯著降低糖尿病小鼠的餐后血糖水平［36］；甚至能通過(guò)減少小鼠細(xì)胞外基質(zhì)形成相關(guān)蛋白及mRNA 表達(dá)，減輕腎臟組織損傷，從而達(dá)到保護(hù)腎臟的目的［37］。因而為茯苓治療糖尿病腎病的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)提供實(shí)驗(yàn)支持。

由GO 分析結(jié)果推測(cè)，茯苓治療糖尿病腎病涉及到代謝和細(xì)胞應(yīng)激等生物過(guò)程，有細(xì)胞膜、質(zhì)膜、核、軸突、樹(shù)突等細(xì)胞組分的密切參與，主要結(jié)合酶、受體、蛋白質(zhì)等各種物質(zhì)，并且實(shí)際的過(guò)程遠(yuǎn)較本文所預(yù)測(cè)的結(jié)果復(fù)雜。而從KEGG 通路分析中可以看出，茯苓治療糖尿病腎病涉及多條復(fù)雜的信號(hào)通路。NOD 樣受體和Toll 樣受體通路作為激活固有免疫的重要信號(hào)通路［38］，在受到配體刺激后能傳遞信號(hào)觸發(fā)機(jī)體炎性反應(yīng)，促使炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子過(guò)度表達(dá)，因此預(yù)測(cè)兩個(gè)通路在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中起重要作用［39］。叉頭轉(zhuǎn)錄因子（forkhead box O，F(xiàn)oxO） 可在轉(zhuǎn)錄和傳遞大量生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子信號(hào)的同時(shí)，調(diào)節(jié)下游的靶基因表達(dá)，繼而達(dá)到調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)的目的。其中FoxO1 的激活能夠抑制處于高糖狀態(tài)下的上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，改善糖尿病小鼠“蛋白尿” 的病理特征及減輕腎臟損害。越來(lái)越多的研究表明，F(xiàn)oxO1 對(duì)機(jī)體內(nèi)許多重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（如PI3K／Akt 信號(hào)通路） 發(fā)揮了重要的生物學(xué)效應(yīng)。PI3K／Akt信號(hào)通路是FoxO1 蛋白的直接上游，不僅可使FoxO1 蛋白的轉(zhuǎn)錄活性隨著氨基酸殘基的磷酸化修飾、亞細(xì)胞定位、DNA 結(jié)合位點(diǎn)等的變化而發(fā)生改變；還參與了足細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡過(guò)程［40-41］。VEGF 作為一種血管內(nèi)皮生成因子，能夠維持正常的血管密度及通透性。一般情況下，機(jī)體內(nèi)VEGF 的表達(dá)很低，但在腎臟受到損傷時(shí)，VEGF 表達(dá)升高，最終加速血管生成。大量研究表明［42-43］，降低VEGF 的表達(dá)、抑制VEGF 與其受體結(jié)合或者阻斷其下游信號(hào)等途徑均可在一定程度上抑制糖尿病腎病等微血管并發(fā)癥的發(fā)展過(guò)程。綜上所述，本研究結(jié)果顯示茯苓12個(gè)活性化合物可能作用于279個(gè)靶點(diǎn)，關(guān)系到多種過(guò)程、分子和通路，雖然體現(xiàn)了茯苓成分多樣-靶點(diǎn)豐富-途徑復(fù)雜的起效特點(diǎn)，但不足的是茯苓多糖類(lèi)成分由于OB 值和DL 值較低且應(yīng)用該類(lèi)成分的單體化合物治療疾病研究較少，故未能納入研究中［44］。雖然本研究已經(jīng)通過(guò)String 網(wǎng)站預(yù)測(cè)了茯苓治療糖尿病腎病作用的42個(gè)關(guān)鍵靶蛋白，并對(duì)其進(jìn)行生物過(guò)程與通路分析，但仍應(yīng)對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。