王紅麗 梁璋成 何志剛* 林曉姿 林向陽(yáng) 陳 慎

（1 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所 福州350003 2 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 福州350180 3 福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州350003）

海帶（Laminaria japonica）是一種兼具食用和藥用的經(jīng)濟(jì)海藻，富含豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物及粗纖維[1-3]，不但可以為人們活動(dòng)提供所需要的能量，而且其中的多糖、粗纖維還能促進(jìn)人們腸胃的蠕動(dòng)，緩解便秘[4]。未經(jīng)脫醒的海帶，會(huì)對(duì)市場(chǎng)消費(fèi)產(chǎn)生影響。 去除海帶的腥味是其深加工的關(guān)鍵技術(shù)問題。

目前，對(duì)于研究海帶脫腥方法的報(bào)道有很多[5]，但主要的脫腥方法有3 種， 即物理脫腥、 化學(xué)脫腥、生物脫腥[6]。 陳婉珠[7]利用酸法、醇法、甘草、β-環(huán)糊精掩蔽法、熱水燙煮法等對(duì)海帶脫腥，認(rèn)為熱水燙煮法脫腥效果最好。肖欣欣等[8]認(rèn)為采用綠茶與甘草按照質(zhì)量比4∶2 混合后對(duì)海帶脫腥效果好。段吳勇[9]采用釀酒酵母和嗜熱鏈球菌復(fù)合發(fā)酵脫腥，研究表明海帶的腥味基本消失，具有淡淡的清香味。比較3 種方法脫腥技術(shù)，以物理脫腥效果較差，化學(xué)脫腥存在安全與污染問題，生物脫腥不僅可實(shí)現(xiàn)海帶的脫腥、改善風(fēng)味，且可提高營(yíng)養(yǎng)。生物脫腥技術(shù)中，在魚類、貝類脫除腥味成分方面的文獻(xiàn)報(bào)道比較多[10-12]，而海帶脫腥方面的研究報(bào)道大多限于脫腥工藝研究， 對(duì)海帶脫除腥味成分方面的文獻(xiàn)報(bào)道鮮少。 常用于生物脫腥的菌種有酵母菌、乳酸菌、醋酸桿菌等，但不同微生物發(fā)酵脫腥的效果及產(chǎn)生的風(fēng)味存在差異。 本試驗(yàn)選用本實(shí)驗(yàn)室自行分離并保藏的副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 和釀酒酵母J4 對(duì)海帶進(jìn)行脫腥， 采用HS-SPME-GC-MS 測(cè)定法， 結(jié)合感觀評(píng)價(jià)分析海帶經(jīng)副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 和釀酒酵母J4 發(fā)酵脫腥前后的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，探討海帶微生物脫腥機(jī)制，為海帶生物脫腥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽漬海帶： 新鮮海帶用35%的食鹽鹽漬24 h后，于-20 ℃速凍保藏所得。 由福建省紅太陽(yáng)精品有限公司提供。

菌種： 副干酪乳桿菌副干酪亞種R37（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）和釀酒酵母J4（Saccharomyces cerevisia）均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

BS110S 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，島津科技有限公司；色譜柱為DB-5 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），SPME 手動(dòng)進(jìn)樣手柄及固定搭載裝置 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，安捷倫科技有限公司；20 mL 頂空進(jìn)樣瓶，美國(guó)Supelco 公司；氨基酸自動(dòng)分析儀，蘇州華美辰儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備 LH18 培養(yǎng)基[13]：蛋白胨1.5%，牛肉膏1.0%，葡萄糖2.0%，酵母膏0.74%，檸檬酸二胺0.2%，硫酸鎂0.036%，硫酸錳0.005%，吐溫-80 0.1%，番茄汁10%，蘋果酸鈉2%，調(diào)整pH 5.5±0.2，121 ℃高壓滅菌20 min。

糖蜜培養(yǎng)基： 將甘蔗糖蜜用凈水?dāng)嚢柘♂屩量扇苄怨绦挝镏?%， 添加1%左右的檸檬酸調(diào)節(jié)pH 至5.0±0.2，115 ℃高壓滅菌30 min。

1.3.2 種子液制備 供試乳酸菌和酵母菌經(jīng)活化后， 分別接種于液體培養(yǎng)基LH18 和糖蜜培養(yǎng)基中， 分別培養(yǎng)24 和18 h 后至菌量達(dá)109和108CFU/mL，采用3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取菌坭加等體積無菌水振蕩懸浮，待用。

1.3.3 樣品制備 海帶經(jīng)清洗脫鹽、切條稱重，將糖鹽水（3%食鹽、3%蔗糖）體積與海帶質(zhì)量以1∶1的比例加入經(jīng)臭氧滅菌后的泡菜壇中， 按試驗(yàn)設(shè)計(jì)接入1.3.1 節(jié)活化好的菌株（見表1），飽和食鹽水封口后于（32±1）℃下發(fā)酵8 d。

表1 發(fā)酵海帶試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of fermented kelp

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

1.3.4.1 固相微萃?。⊿PME）取樣 取海帶樣品4 g 置于20 mL 的頂空進(jìn)樣瓶中進(jìn)行萃取。 萃取條件：萃取頭老化溫度250 ℃；老化時(shí)間15 min；平衡溫度60 ℃； 平衡時(shí)間30 min；250 ℃解吸附3 min。

1.3.4.2 GC-MS 分析條件 GC 條件：DB-5MS（30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm）；采用程序升溫方式，起始溫度50 ℃，保持3 min，以10 ℃/min 的速率上升至90 ℃，保持5 min，以10 ℃/min 的速率上升至230 ℃，保持2 min；以20 ℃/min 的速率上升至280 ℃，保持5 min；載氣為He，流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。

MS 條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～550；發(fā)射電流100 μA。

1.3.5 感官評(píng)價(jià) 采用定量描述感官評(píng)價(jià)法[14-16]，邀請(qǐng)10 位經(jīng)過培訓(xùn)的感官評(píng)定分析員組成評(píng)價(jià)小組，將搜集到的描述詞整理總結(jié)后，用M 值法首次篩選。提供給評(píng)價(jià)員一系列有差別的樣品，對(duì)使用的每一描述詞要求評(píng)價(jià)員在標(biāo)度“0～5”的范圍內(nèi)標(biāo)出評(píng)價(jià)位置，來判斷感受到的強(qiáng)度。以藻腥味為例，定量描述分析評(píng)分圖如圖1 所示。根據(jù)感官評(píng)定小組成員實(shí)際的評(píng)價(jià)情況刪除M 值較低的描述詞[17]。

參考感官剖面分析法計(jì)算M 值，公式如下：

式中：F——描述詞實(shí)際被述及的次數(shù)占該描述詞所有可能被述及總次數(shù)的百分率/%；I——評(píng)價(jià)小組實(shí)際給出的一個(gè)描述詞的強(qiáng)度和占該描述詞最大可能所得強(qiáng)度的百分率/%。

最終整理出的氣味感官描述詞分別是藻腥味、泥土味、乳酸味、水果味、酒精味、花香味。

圖1 定量描述分析評(píng)分圖Fig.1 Quantitative description analysis diagram of earthy

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 GC-MS 數(shù)據(jù)分析 對(duì)不同海帶樣品揮發(fā)性物質(zhì)的定性分析主要采用GC-MS 聯(lián)用儀NIST 14 譜庫(kù)對(duì)照，選擇相似度大于80%的物質(zhì)，另外結(jié)合保留指數(shù)（retention index，RI）進(jìn)行確定。按公式（2）計(jì)算RI：

式中：n 和n+1——分別為未知物流出前、后正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；tn+1和tn——正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min；tr——未知物的保留時(shí)間/min（tn＜tr＜tn+1）。

采用面積歸一化法進(jìn)行定量分析， 求得各揮發(fā)性成分的相對(duì)含量。

1.4.2 其它數(shù)據(jù)分析 利用OriginLab 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海帶感官風(fēng)味評(píng)價(jià)

海帶原料經(jīng)發(fā)酵處理都可達(dá)到脫除腥味的效果，但不同微生物發(fā)酵處理，其效果產(chǎn)生差異，見圖2。 經(jīng)副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 和釀酒酵母J4 單菌發(fā)酵都可明顯脫除藻腥味，前者具有典型的乳酸發(fā)酵香，后者具有酵母發(fā)酵的醇香、水果香、花香。以副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 及釀酒酵母J4 組合發(fā)酵處理后， 海帶的腥臭味最弱，乳酸發(fā)酵香、果香及花香協(xié)調(diào)，香味愉悅。

圖2 海帶感官剖面圖Fig.2 The sensory section of the kelp

2.2 海帶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組分種類間的比較分析

CK 組和3 組發(fā)酵處理海帶的揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類和相對(duì)含量的差異如圖3 和圖4 所示。 與CK 組相比，R37 發(fā)酵組的醇類、醛類、酮類和酸類化合物物質(zhì)種類和相對(duì)含量均增加， 烴類和酯類化合物物質(zhì)種類未變化，但相對(duì)含量減少；J4 組海帶醇類、醛類、酸類和其它類化合物物質(zhì)種類和相對(duì)含量均增加，烴類、酮類和酯類化合物物質(zhì)種類增加， 但相對(duì)含量下降；R37+J4 組海帶醇類、醛類、酯類和酸類化合物物質(zhì)種類和相對(duì)含量均增加，烴類和酮類化合物物質(zhì)種類增加，但相對(duì)含量下降。不同發(fā)酵處理間，以R37 發(fā)酵組海帶醛類、 酮類化合物物質(zhì)相對(duì)含量最高；J4 組海帶酯類、醛類化合物物質(zhì)種類最多；R37+J4 組的烴類、醛類、酯類、酸類化合物物質(zhì)種類最多，醇類、酯類、酸類化合物物質(zhì)相對(duì)含量最高，酮類化合物物質(zhì)種類和相對(duì)含量最低。 正由于這些風(fēng)味物質(zhì)種類及相對(duì)含量的差異構(gòu)成了不同的發(fā)酵風(fēng)味和脫腥效果。

2.3 海帶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的消長(zhǎng)分析

2.3.1 烴類化合物 海帶經(jīng)發(fā)酵后， 具有藻腥味的碘代辛烷相對(duì)含量明顯下降，1，3-辛二烯、正碘庚烷未檢出，E，Z-3-亞乙基環(huán)己烯、3-甲基-6-（1-甲基乙烯基）-環(huán)己烯、3-乙基-2-甲基-1.3 己二烯、正十六烷也明顯下降。 經(jīng)釀酒酵母J4 發(fā)酵可產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)1，2-二甲基-環(huán)辛烯、1-亞甲基螺[4.4]壬烷，而副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 發(fā)酵產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)2-甲基-6-亞甲基-2-辛烯、反式-1，1，3，4-四甲基-環(huán)戊烷、3-環(huán)氧乙烷基-7-氧雜雙環(huán)[4.1.0]庚烷。 烯烴和芳香烴閾值較低，可賦予海帶特殊香氣[18]。

圖3 海帶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類對(duì)比Fig.3 Comparison of the species of volatile flavor components in kelp

2.3.2 醇類化合物 海帶中具有泥土味、 油脂氣息的正壬醇經(jīng)發(fā)酵后消失，具有蜂蜜味、花香味的β-苯乙醇在海帶經(jīng)釀酒酵母J4 發(fā)酵后產(chǎn)生，而2，6-二甲基-1，7-辛二烯-3-醇、（2Z）-3-戊基-2，4-戊二烯-1-醇和具有脂肪味、 紫羅蘭香的E-2-壬烯-1-醇在海帶經(jīng)副干酪乳桿菌副干酪亞種R37發(fā)酵后產(chǎn)生，它們分別是釀酒酵母J4 和副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 發(fā)酵產(chǎn)生的特征醇類風(fēng)味物質(zhì)。 此外，海帶經(jīng)發(fā)酵后又多檢出了2-乙基-2-己烯-1-醇和具有檸檬味、花香味的正辛醇。

2.3.3 醛類化合物 海帶中具有魚腥味的正庚醛經(jīng)發(fā)酵后含量降低，而新增了5 種醛類化合物。其中，具有脂香、清香味的（E，E）-2，4-庚二烯醛、亞麻油香的Z-2-庚烯醛和水果味的E-2-癸烯醛經(jīng)副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 發(fā)酵后含量明顯增加， 是副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 的特征醛類風(fēng)味物質(zhì)。具有果香、芳香味的桃醛和雞肉香味的E-2-辛烯醛經(jīng)釀酒酵母J4 發(fā)酵后含量明顯增加，是釀酒酵母J4 的特征醛類風(fēng)味物質(zhì)。 此外，海帶經(jīng)發(fā)酵后又新增正辛醛、反-4，5-環(huán)氧基-（E）-2-癸烯醛、十二醛。

2.3.4 酮類化合物 海帶中3-乙酰-2-辛酮經(jīng)發(fā)酵后未檢出，新增了5 種酮類物質(zhì)，其中E-3-壬烯-2-酮、4-羥基-3-甲基-2-（2-丙烯基）-2-環(huán)戊烯-1-酮在發(fā)酵組中均有檢出； 具有堅(jiān)果味的3-辛烯-2-酮，牛奶味、甜香味的2-壬酮僅在R37 組檢出，具有柏木、覆盆子香氣的β-紫羅酮經(jīng)副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 發(fā)酵后含量明顯增加，是副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 的特征酮類風(fēng)味物質(zhì)。 2，6-二（叔丁基）-4-羥基-4-甲基-2，5-環(huán)己二烯-1-酮在J4 和R37+J4 組檢出，是釀酒酵母J4 的特征酮類風(fēng)味物質(zhì)。

圖4 海帶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組分相對(duì)含量對(duì)比Fig.4 Comparison of the relative content of volatile flavor components in kelp

2.3.5 酯類化合物 海帶發(fā)酵后丁酸己酯、 十四酸異丙酯未檢出，但新增了5 種酯類化合物。其中1-甲基-2-氧代環(huán)己基-3-烯羧酸甲酯和具有果香、椰子香味的癸酸乙酯在發(fā)酵組中均有檢出；乙酸苯乙酯具有甜蜜香，月桂酸乙酯具有花果香，十四酸乙酯具有鳶尾油香、油脂香，在J4、R37+J4 組海帶中都有檢出；是釀酒酵母J4 的特征酯類風(fēng)味物質(zhì)；這些物質(zhì)對(duì)海帶良好風(fēng)味均具有很大貢獻(xiàn)。

2.3.6 酸類化合物 海帶發(fā)酵后新增了3 種酸類化合物。 其中癸酸、 辛酸在J4 和R37+J4 組中檢出，是釀酒酵母J4 的特征酸類風(fēng)味物質(zhì)。 豆蔻酸在R37、R37+J4 組檢出， 是副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 的特征酸類風(fēng)味物質(zhì)。 這些酸普遍具有酸臭味，對(duì)海帶的發(fā)酵味具有一定的作用。

2.3.7 其它類化合物 本試驗(yàn)中， 其它類化合物包括2-戊基呋喃和苯并噻唑，2-戊基呋喃具有豆香味、青草味，經(jīng)釀酒酵母J4 發(fā)酵后明顯增加，對(duì)發(fā)酵海帶的風(fēng)味形成具有重要影響。

3 討論與結(jié)論

海帶腥味成分復(fù)雜， 一般是由多種物質(zhì)共同作用導(dǎo)致的， 主要由2-丁烯醛、2-己烯醛、1-辛烯-3-醇、己醛、反-2-辛烯醛、反-2-癸烯醛、碘代辛烷等物質(zhì)組成，其組成會(huì)因海帶的品種、生產(chǎn)季節(jié)與區(qū)位、加工與保藏方法的不同而有所差異。陳婉珠等[22]通過DB-l 色譜柱檢測(cè)脫鹽海帶勻漿液，認(rèn)為2-羥基-2-對(duì)甲氧苯基-3-羧基-3-甲基丁烷、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸、乙酸、二惡二硅代烷、碘代辛烷、愈創(chuàng)藍(lán)油烴、腈基十六烷等羧酸類、 烷烴類及芳香環(huán)基類共同形成了海帶特殊的藻腥味。 劉智禹[23]通過DB-WAX 色譜柱檢測(cè)福建省干海帶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)， 認(rèn)為2-丁烯醛、2-己烯醛、1-辛烯-3-醇等化合物對(duì)海帶藻腥味有一定貢獻(xiàn)。崔晨茜等[24]通過VOCOL 色譜柱初步探究認(rèn)為己醛、反-2-辛烯醛、反-2-癸烯醛及1-辛烯-3-醇對(duì)生鮮海帶腥味的形成起一定作用。本試驗(yàn)通過DB-5 色譜柱檢測(cè)經(jīng)熱燙、預(yù)腌脫水、冷凍保藏海帶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)， 認(rèn)為1，3-辛二烯、E，Z-3-亞乙基環(huán)己烯、正壬醇、正庚醛、碘代辛烷、1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、E-2-辛烯醇對(duì)海帶藻腥味的形成起主要作用?？梢?，對(duì)海帶腥味起主要作用的物質(zhì)因預(yù)處理方式和檢測(cè)所用色譜柱不同而結(jié)果不同[25]。

表2 海帶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)HS-SPME-GC-MS 分析結(jié)果Table 2 Analysis of volatile flavor components in kelp by HS-SPME-GC-MS

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

海帶經(jīng)微生物發(fā)酵后形成的風(fēng)味物質(zhì)， 主要是由菌種及其產(chǎn)生的酶類分解、代謝基質(zhì)中的糖、脂肪、蛋白質(zhì)及烴、醇、酮、醛、酯等一系列生物化學(xué)過程而形成的[26-28]。 微生物發(fā)酵的脫腥作用，主要是通過微生物代謝對(duì)腥味物質(zhì)實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化以及產(chǎn)生愉快風(fēng)味物質(zhì)， 以達(dá)到消除或掩蔽腥味效果，乳酸菌及酵母菌都有良好的生物脫腥作用，由于不同微生物代謝的底物及產(chǎn)物不同， 其發(fā)酵后的脫腥效果及風(fēng)味也存在差異[29]。 在本試驗(yàn)中，海帶經(jīng)副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 和釀酒酵母J4 發(fā)酵后1，3-辛二烯、E，Z-3-亞乙基環(huán)己烯、正壬醇、正庚醛、碘代辛烷等腥味物質(zhì)經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化利用，其相對(duì)含量明顯下降或未檢出，產(chǎn)生了次生代謝產(chǎn)物，如：β-苯乙醇、桃醛、十四酸乙酯、十二醛、E-2-壬烯-1-醇等， 這些物質(zhì)大多具有果香味，對(duì)發(fā)酵海帶風(fēng)味的形成具有很大貢獻(xiàn)。而海帶經(jīng)釀酒酵母J4 和副干酪乳桿菌副干酪亞種R37發(fā)酵后產(chǎn)生的風(fēng)味不同， 副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 的代謝產(chǎn)物是Z-2-庚烯醛、E-2-癸烯醛、E-2-壬烯-1-醇、β-紫羅酮、2-壬酮等， 釀酒酵母J4 的代謝產(chǎn)物是β-苯乙醇、桃醛、十四酸乙酯、E-2-辛烯醛等，組合后風(fēng)味更柔和，更協(xié)調(diào)。 釀酒酵母J4 和副干酪乳桿菌副干酪亞種R37 組合的效果不論在感官還是風(fēng)味上都優(yōu)于單菌發(fā)酵， 這是因?yàn)榻M合生物發(fā)酵代謝所利用的底物面寬和產(chǎn)生的產(chǎn)物更豐富。 因此，進(jìn)行海帶的生物發(fā)酵脫腥，選擇適宜的微生物菌種是關(guān)鍵。