陳東榮，肖 凱，段林偉，張 明

（廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／動(dòng)物繁殖研究所，南寧 530004）

NLRP5［pyrin domain（PYD）containing proteins 5］基因是胚胎需要的母體抗原，也稱為Mater（maternal antigen that embryos require），是在哺乳動(dòng)物中最早被鑒定的母源效應(yīng)基因之一［1］。NLRP5屬于NLRP（nucleotide－binding oligomerization domain，leucine rich repeat and pyrin domain containing proteins）蛋白家族。人類有14 種NLRP成員，分別為NLRP1～NLRP14，在小鼠中已報(bào)道有20個(gè)NLRP成員蛋白［2－3］。NLRP家族成員包括三個(gè)結(jié)構(gòu)域定義，分別是PYD、NACHT、LRR結(jié)構(gòu)域。N末端區(qū)域?yàn)镻YD結(jié)構(gòu)域，主要參與炎癥和細(xì)胞凋亡；LRR結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)不同細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；猜測(cè)NACHT結(jié)構(gòu)域可與ATP／鳥(niǎo)苷三磷酸結(jié)合［2］。NLRP家族基因可以分為免疫相關(guān)基因和生殖相關(guān)基因，免疫相關(guān)基因包括NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRP10 和NLRP12，其他的NLRP是生殖相關(guān)基因［3］。敲除Nlrp5基因后，小鼠的早期胚胎阻滯在2細(xì)胞期，表明Nlrp5在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［1］。在豬卵母細(xì)胞中顯微注射dsRNA干擾NLRP5，胚胎停滯在2～8細(xì)胞階段［4］；沉默獼猴的NLRP5基因，早期胚胎也阻滯在8～16細(xì)胞期［5－6］。此外，NLRP5、FILIA、OOEP（FLOPED）、PADI6和TLE6被確認(rèn)為皮質(zhì)下母源效應(yīng)復(fù)合物（SCMC），是位于卵母細(xì)胞和胚胎皮層下的一種多蛋白復(fù)合物，對(duì)胚胎發(fā)生至關(guān)重要［7－8］。與NLRP5蛋白同家族的NLRP2和NLRP7有可能是皮質(zhì)下母源效應(yīng)復(fù)合物的成員［9－10］。上述研究表明NLRP5是動(dòng)物卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育的相關(guān)基因。

關(guān)于水牛NLRP5基因的研究較少，此外，生物制品市場(chǎng)上缺乏水牛母源基因抗體商品，難以對(duì)它們的功能和定位等機(jī)制進(jìn)行深入研究。本試驗(yàn)以水牛為研究對(duì)象，克隆水牛NLRP5基因序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過(guò)構(gòu)建水牛NLRP5原核表達(dá)載體對(duì)NLRP5蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，然后進(jìn)行純化，制備多克隆抗體，用Western blot分析該基因在水牛各組織的表達(dá)特性，為研究水牛NLRP5在水牛生殖過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水牛組織、質(zhì)粒與試驗(yàn)動(dòng)物

水牛卵巢、心臟和肝臟等組織，取自南寧市肉聯(lián)廠屠宰分廠。原核表達(dá)載體pET－32a（＋）質(zhì)粒，廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。感受態(tài)細(xì)胞5α和BL21（DE3），購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。4周齡昆明小白鼠，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑

2×Rapid Taq Master Mix、2×Phanta Max Master Mix和膠回收試劑盒，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18－T載體、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；堿磷酶馬抗小鼠標(biāo)記IgG，購(gòu)自北京中杉金橋有限公司；預(yù)染蛋白Marker，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI公布的水牛NLRP5基因預(yù)測(cè)序列（XM＿006041797.2），用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。所有引物（見(jiàn)表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 NLRP5基因克隆引物序列

1.3.2 總RNA的提取與cDNA的合成 收集GV期的水牛卵母細(xì)胞，直接用微量提取試劑盒提取卵母細(xì)胞總RNA。取高溫滅菌的研缽置于無(wú)菌超凈臺(tái)中，先倒入液氮預(yù)冷研缽，待液氮揮發(fā)完將水牛各組織樣品放研缽中用剪刀剪碎，再加入液氮淹沒(méi)組織；液氮快揮發(fā)完時(shí)用研磨棒研磨組織，組織會(huì)越來(lái)越細(xì)，再加入液氮繼續(xù)研磨。整個(gè)過(guò)程需添加4～5次液氮研磨，最后將組織研磨成粉末，再盛于預(yù)冷的滅菌EP管中。采用TRIzol法提取總RNA，通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將細(xì)胞和各組織的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA樣品，－80℃保存。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，用基因特異性引物進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系：2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，上下游稀釋引物各1μL，DNA模板2μL，RNase－FreeH2O8.5μL。PCR擴(kuò)增程序：第一步預(yù)變性95℃5 min；第二步95℃15 s，60℃15 s，72℃30 s，34個(gè)循環(huán)；第三步72℃5 min。PCR結(jié)束后將產(chǎn)物用2×Rapid Taq Master Mix進(jìn)行72℃20 min加A尾。

擴(kuò)增且添加A尾的產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定目的片段大小。利用膠回收試劑盒回收目的片段，將膠回收產(chǎn)物連接pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于氨芐青霉素LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，取陽(yáng)性菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 水牛NLRP5基因序列的生物信息學(xué)分析用DNAStar軟件的SeqMan將測(cè)序的4段序列拼接成完整的CDS序列。用Megalign軟件將克隆出來(lái)的序列與預(yù)測(cè)序列進(jìn)行同源性比對(duì)，在NCBI上下載其他物種的NLRP5基因進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.3.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)克隆出來(lái)NLRP5序列，對(duì)NLRP5多肽的親水性、疏水性和線性表位等指標(biāo)進(jìn)行分析，選取親水性和免疫原性較好的480 bp片段進(jìn)行原核表達(dá)。再根據(jù)pET－32a（＋）載體圖譜，設(shè)計(jì)分別含有限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的上、下游引物。引物序列：PET32a－NLRP5，F(xiàn)5′－GGCAAGGGAC－3′，R5′－ATTTaagcttgCGGGACCGGGGCGTCCGGCCACTC－3′。以卵母細(xì)胞的cDNA為模板，用帶有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取原核表達(dá)目的片段。連接pMD18－T載體，獲得重組質(zhì)粒pMD18－T－NLRP5，將其雙酶切后亞克隆至原核表達(dá)載體pET－32 a（＋），PCR鑒定和酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序。

1.3.6 重組蛋白的表達(dá)及純化 將pET－32a－NLRP5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，37℃220 r／min培養(yǎng)至菌液光密度值（OD600）達(dá)0.6左右，加入終濃度分別為0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mmol／L的IPTG，30℃誘導(dǎo)6 h。取誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析，以確定目的蛋白所需IPTG最佳濃度誘導(dǎo)。在最佳濃度及30℃條件下分別誘導(dǎo)0，2，4，6，8，10 h，確定目的蛋白最佳誘導(dǎo)時(shí)間。用液氮反復(fù)凍融法裂解菌體，離心后分別收集上清液與菌體沉淀，進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析，鑒定重組蛋白的表達(dá)形式。然后用鎳柱純化包涵體蛋白，將純化后的重組蛋白復(fù)性透析，再用His標(biāo)簽抗體鑒定。

1.3.7 免疫程序及多克隆抗體制備 1）首次免疫：將等體積的重組蛋白與弗氏完全佐劑混合，完全乳化后用注射器注射到小鼠背部皮下，采用多點(diǎn)注射。

2）第14，21，35天用重組蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化，背部多點(diǎn)注射加強(qiáng)免疫。

3）第42天，采集小鼠血液，4℃靜置2 h，4℃12 000 r／min離心10 min，分裝，析出血清，－80℃保存，備用。

1.3.8 鼠抗NLRP5多克隆抗體的鑒定 先用制備的多克隆抗體與重組蛋白進(jìn)行Western blot，檢驗(yàn)抗體效價(jià)，再用抗體血清檢測(cè)水牛NLRP5蛋白在卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的特異性表達(dá)情況。取200個(gè)GV期的卵母細(xì)胞和收集的顆粒細(xì)胞進(jìn)行SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜和脫脂牛奶封閉后，NLRP5抗體37℃孵育2 h，二抗37℃孵育1 h，最后堿性磷酸酯酶顯色，Bio－Rad成像儀曝光分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水牛NLRP5基因克隆和生物信息學(xué)分析

對(duì)以卵母細(xì)胞的cDNA為模板設(shè)計(jì)的4段特異性引物進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)條帶分別為866，942，764，1 002 bp，與預(yù)期片段大小相符，見(jiàn)圖1。用DNAStar的SeqMam軟件將4段序列拼接成完整的CDS序列，共3 297 bp。首次克隆得到水牛NLRP5基因CDS全長(zhǎng)序列，由1 098個(gè)氨基酸編碼。通過(guò)ExPasy在線軟件預(yù)測(cè)出NLRP5蛋白分子質(zhì)量為121.17 kD，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為6.78。

選擇水牛NLRP5（XM＿006041797.2）及NCBI上公布的綿羊（XM＿027978862.1）、山羊（XM＿018063503.1）、牛（XM＿012537380.1）、野豬（XM＿005664875.3）、小鼠（NM＿011860.3）、獼猴（NM＿001127631.1）、倭黑猩猩（XM＿003809864.2）和智人（NM＿153447.4）等物種的NLRP5基因序列，應(yīng)用DNAStar MegAlign構(gòu)建NLRP5序列同源性比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由結(jié)果可見(jiàn)水牛與牛和山羊的基因同源性分別為96.3%和93.9%，最低的同源性也有58.1%，說(shuō)明物種間具有一定的保守性。

2.2 PET32a－NLRP5表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳得到500 bp的目的條帶，與預(yù)期大小（480 bp）相符，見(jiàn)圖3。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ對(duì)重組質(zhì)粒和pET－32a（＋）質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收酶切后的NLRP5目的基因和pET－32a（＋），用T4連接酶16℃連接過(guò)夜，獲得重組質(zhì)粒pET－NLRP5。再用HindⅢ和EcoRⅠ酶切重組質(zhì)粒pET－NLRP5也得到預(yù)期的目的條帶，結(jié)果見(jiàn)圖4。測(cè)序結(jié)果與NCBI預(yù)測(cè)的NLRP5基因序列一致，表明成功構(gòu)建了NLRP5原核表達(dá)載體pET－NLRP5。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

電泳結(jié)果表明，pET－NLRP5重組蛋白在IPTG終濃度為0.5 mmol／L時(shí)表達(dá)量最高，表達(dá)的融合蛋白為36 kD，見(jiàn)圖5。在IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol／L時(shí)，在30℃分別誘導(dǎo)0，2，4，6，8，10 h，每管取菌液1 mL進(jìn)行聲波破碎裂解，分別收集上清液和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE電泳。結(jié)果表明，pET－NLRP5重組蛋白IPTG誘導(dǎo)在10 h的重組蛋白表達(dá)量最高，以包涵體形式表達(dá)，見(jiàn)圖6。

2.4 NLRP5重組蛋白的Western blot鑒定結(jié)果

通過(guò)用Ni柱純化，分別收集洗脫液和純化的NLRP5重組蛋白，結(jié)果見(jiàn)圖7。通過(guò)電泳結(jié)果可以看到純化后的蛋白條帶比未純化的蛋白雜帶少，說(shuō)明NLRP5重組蛋白純化效果較好，見(jiàn)圖8。用Western blot檢驗(yàn)包涵體NLRP5重組蛋白的His標(biāo)簽，結(jié)果獲得36 kD特異性目的條帶，見(jiàn)圖9。說(shuō)明成功純化獲得了NLRP5重組蛋白。

2.5 NLRP5多克隆抗體效價(jià)

透析復(fù)性的NLRP5重組蛋白在檢測(cè)純度和濃度均達(dá)到免疫準(zhǔn)則后，將NLRP5重組蛋白液體與等量弗氏佐劑乳化免疫昆明小鼠，抗原免疫結(jié)束后通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行眼球采血，獲取抗體血清。按比例稀釋NLRP5抗體血清作為一抗與NLRP5重組蛋白反應(yīng)，用Western blot檢測(cè)NLRP5抗體效價(jià)。結(jié)果表明，在約36 kD處檢測(cè)到特異性的目的條帶，說(shuō)明成功制備水牛NLRP5多克隆抗體，抗體效價(jià)高達(dá)1∶64 000，見(jiàn)圖10。

2.6 NLRP5在水牛卵母細(xì)胞和顆粒的表達(dá)

以收集的抗水牛NLRP5多克隆抗體血清1∶4 000稀釋作為一抗進(jìn)行Western blot，檢測(cè)了NLRP5在水牛不同組織的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。結(jié)果表明，NLRP5在大腦、心臟、腎臟、肌肉、瘤胃、睪丸、子宮、卵巢和顆粒細(xì)胞中均不表達(dá)，僅在水牛卵母細(xì)胞中表達(dá)，蛋白質(zhì)大小為121 kD，見(jiàn)圖11、圖12。表明抗水牛NLRP5多克隆抗體制備成功，水牛的NLRP5蛋白特異性良好。

3 討論

NLRP5基因是NLRP超大蛋白家族中的一種母源效應(yīng)基因，對(duì)該基因的研究主要集中在人類、小鼠、豬和獼猴的卵母細(xì)胞和早期胚胎中，其中獼猴的卵巢和睪丸都有NLRP5表達(dá)［5－6］。牛的NLRP5蛋白被定位在細(xì)胞質(zhì)中［11］，而小鼠NLRP5位于卵母細(xì)胞的線粒體和核仁及緊密的核孔中［12］。

本試驗(yàn)成功克隆得到水牛NLRP5基因CDS的3 297 bp完整序列，水牛與牛、山羊、綿羊和野豬的同 源性 分別 為96.3%、93.9%、89.1% 和75.5%，其中與牛、山羊具有較高的同源性，說(shuō)明NLRP5蛋白在不同物種間的進(jìn)化具有一定保守性。然而，由于生物制品市場(chǎng)上缺乏水牛母源基因抗體商品，難以對(duì)它們的功能和定位等機(jī)制進(jìn)行深入研究。因此，本試驗(yàn)選取NLRP5基因序列親水性和免疫原性較好的480 bp作為原核表達(dá)的目的片段，采用pET－32a（＋）載體作為原核表達(dá)載體，該載體還攜帶有6×His－tag序列，便于純化目的蛋白且容易鑒定是否成功表達(dá)，可以提高重組蛋白的產(chǎn)量。本試驗(yàn)用His標(biāo)簽鑒定重組蛋白正確表達(dá)，并制備了鼠抗NLRP5多克隆抗體，Western blot測(cè)出該抗體與重組NLRP5蛋白反應(yīng)效價(jià)高達(dá)1∶64 000，且驗(yàn)證了NLRP5蛋白僅在水牛卵母細(xì)胞中表達(dá)而不在其他組織中表達(dá)的特異性。這些結(jié)果將為進(jìn)一步研究母源NLRP5基因在水牛卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功克隆了水牛NLRP5基因，構(gòu)建了pET－NLRP5表達(dá)載體，成功制備了鼠抗NLRP5多克隆抗體，且與NLRP5重組蛋白具有良好反應(yīng)，并驗(yàn)證了該蛋白僅在水牛卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)。