汪振宇，衛(wèi)紀，廖鴻，楊瑤君，龍文聰

樂山師范學院生命科學學院，竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點實驗室，樂山 614000

長足大竹象（Cyrtotrachelus buquetiGuer）屬鞘翅目象甲科，是目前竹林的最主要有害蟲類之一，對叢生的竹林的危害率達到50%～90%[1]，2003年，長足大竹象已被列為我國林業(yè)危險性有害生物的一種。該蟲主要分布在我國四川、廣東、廣西、貴州等地，國外主要分布泰國、緬甸、越南等東南亞國家[2-3]。在長足大竹象的探究方面，李濤、聶學文等研究了長足大竹象生物學特性及防治試驗[2-3]，鞠瑞亭、玉鵬等分別研究報道了該蟲的在四川地區(qū)、上海地區(qū)及廣西地區(qū)的發(fā)生、危害及防治[4-5]，楊樺等一些學者研究了長足大竹象的繁殖行為和交配行為[6]，忙定澤等人提取和鑒定了長足大竹象成蟲體表的信息化學物質(zhì)[7]，蒲遠鳳等分析和評價了該蟲的營養(yǎng)成分[8]，楊瑤君等研究了長足大竹象的前胸背板、鞘翅、觸角的超微結(jié)構(gòu)及對竹筍揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)，研究了該蟲的生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)，蟲口密度與蟲孔數(shù)、竹筍受害率的關(guān)系以及幼蟲種群動態(tài)對氣候的預測模型等[9-14]。尚未有長足大竹象染色體核型分析的研究報道，而染色體核型分析是遺傳學、分子生物學、分類學等研究的基礎(chǔ)。本研究以長足大竹象精巢為研究材料，研究了長足大竹象染色體的數(shù)目、形態(tài)等，并分析其核型特征，為期為長足大竹象的進一步研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料為長足大竹象成蟲，采集自四川省樂山市沐川縣大楠鎮(zhèn)（經(jīng)度104.00，緯度28.96），在實驗室條件下進行人工飼養(yǎng)。室內(nèi)飼養(yǎng)溫度25℃、相對濕度75%、光周期12L∶12D，以新鮮竹筍進行飼養(yǎng)至性成熟期，每2d 更換1 次竹筍，待解剖用[10]。

1.2 染色體標本的制備

選取10 只性成熟期的長足大竹象雄蟲制作標本，參照汪淑芳的方法[11]，挑取解剖出來的精巢，在盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中除去其他組織，將取得的精巢置于EP 管中，在卡諾固定液（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1）中固定過夜（8～12 h），挑出置于0.1 mol·L-1的醋酸洋紅染液中染色10～15 min，取出置于清潔的載破片上，加一滴制成壓片，用解剖針搗碎，蓋上蓋玻片，用鑷子透輕敲蓋玻片使材料分散如云霧狀，然后用濾紙吸去多余的醋酸洋紅，再進行壓片，使組織進一步分散開。

1.3 觀察與拍照

將制備好的染色體玻片在Olympus BX51 顯微鏡下觀察，在40 倍物鏡下選擇染色體分散良好，形態(tài)清晰的分裂相終變期或中期進行染色體數(shù)目統(tǒng)計，然后轉(zhuǎn)至100 倍油鏡下進行顯微照相。

1.4 染色體計數(shù)及核型分析

每個個體選取10 個以上形態(tài)清晰、分散適度、染色體數(shù)目完整的分裂相細胞進行顯微拍照并計數(shù)[15]，選擇拍攝的比較好的照片放大后測量染色體的臂長（Arm ratio），分析其相對長度（Relative length）實際長度（Physical length）、以及著絲粒指數(shù)（Centromeric index），染色體分類按照Levan、Kuo 提出的標準進行劃分[16-17]，核型對稱性分類按Stebbins 的標準進行劃分[18]，數(shù)據(jù)處理、作圖采用Excel 2003，染色體核型分析采用Adobe photoshop 7.0。性別決定機制是根據(jù)Dias 等通過性染色體的形態(tài)特征分析得出的方法[19]。根據(jù)染色體的長短進行編號。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目統(tǒng)計

通過顯微鏡觀察，共選擇出中期分裂相較好的細胞112 個，染色體計數(shù)統(tǒng)計結(jié)果見表1。結(jié)果表明，染色體數(shù)目低于等于18 條的細胞占總數(shù)的7.4%；染色體數(shù)目介于18 至22 條的細胞有21 個，占總數(shù)的10.7%；而染色體數(shù)目等于22 條的細胞73 個，占總數(shù)的65.2%；而高于22 條的細胞有18 個，所占比例為16.1%。由此可知，長足大竹象的染色體眾數(shù)為22，核型為2n=22，染色體臂數(shù)NF=22。

表1 長足大竹象中期分裂相染色體計數(shù)統(tǒng)計Tab.1 Metaphase chromosome count statictics of Cyrtotrachelusbuqueti Guer

2.2 核型分析

采用Adobe photoshop 7.0 軟件對長足大竹象處理并編號（見圖1B）。長足大竹象核型分析數(shù)據(jù)見表2?？梢钥闯觯L足大竹象的染色體數(shù)目為2n=22，性別決定機制為Xyp型，都有著絲粒結(jié)構(gòu)，此外，在試驗中未觀察到次級縊痕及隨體的特征。其中16 條為中部著絲粒染色體（m），4 條為亞中部著絲粒染色體（sm），核型公式為：2n=22=16 m+4 sm+Xyp，X 染色體為中部著絲粒染色體，屬于中長染色體，在整個染色體組中排第4 位，其相對長度為10.22±0.62 μm，Y 染色體呈圓點狀，相對長度為3.93±0.08 μm，在整個染色體中最?。▓D1 箭頭所示）。1 號染色體相對長度最長，為17.92±0.27 μm，是一對中部著絲粒染色體。染色體中最長與最短染色體比大于4∶1，臂比大于2∶1 的染色體百分比為0.1，故長足大竹象的染色體核型為2C 型。

圖1 長足大竹象中期分裂相染色體（A）及染色體核型（B）圖譜Fig.1 Chromosome (A) and karyotype (B) of metaphase of Cyrtotrachelus buqueti Guer

表2 長足大竹象核型指數(shù)Tab.2 Karyotype index of Cyrtotrachelus buqueti Guer

2.3 四分體時期染色體

長足大竹象細胞在減數(shù)第一次分裂的四分體時期，顯微鏡明場和熒光觀察可以清晰的看到11 對同源染色體正在聯(lián)會（見圖2：A、B、C、D），同時在聯(lián)會時，同源染色體表現(xiàn)為明顯的“8”“0”“X”等形狀（見圖2E、F）。

圖2 長足大竹象精母細胞中期核型Fig.2 Chromosome kyrotype of spermatospore in mitotic metaphase of Cyrtotrachelus buqueti Guer

2.4 多倍體細胞

在實驗材料的篩選過程中發(fā)現(xiàn)一些多倍體（見圖3），特別是幼蟲的組織，其中成蟲精巢組織中也有相應(yīng)數(shù)量的多倍體細胞，可能是脂肪體細胞，脂肪體細胞是昆蟲的營養(yǎng)物質(zhì)貯存的主要器官，也是中間代謝的主要組織，與生長、變態(tài)和生殖等生理機能密切相關(guān)[20]。

圖3 長足大竹象脂肪體細胞Fig.3 Fat body cell of Cyrtotrachelus buqueti Guer

3 結(jié)論與討論

昆蟲染色體壓片制備的選擇很重要，不同種類的昆蟲其染色體壓片材料的制備方法也不盡相同。很多人在制備染色體標本時選用神經(jīng)節(jié)、胚胎等組織勻漿后離心處理[21-22]，由于精巢（卵巢）相比其他組織而言，更容易勻漿，而繁殖期雌蟲體內(nèi)存在大量的受精卵，使解剖卵巢存在很大難度。因此，根據(jù)前期預實驗對實驗材料的篩選，選擇成蟲的精巢作為最佳的實驗材料。

通過對長足大竹象染色體的制片、鏡檢、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析得出：長足大竹象染色體數(shù)目2n=22，其中常染色體10 對，性染色體1 對，均為中部/亞中部著絲粒染色體，NF=22；性別決定機制為Xyp 型，核型公式為：2n=22=16 m+4 sm+Xyp；最長染色體與最短染色體比大于4∶1，臂比大于2∶1 的染色體百分比為0.1，故長足大竹象的染色體核型為2C 型，未觀察到次級縊痕及隨體的特征。這一結(jié)果與Alexandra A 等人在2015年對四個地區(qū)的玉米象的核型分析是一致的[23]，但試驗中發(fā)現(xiàn)有少數(shù)細胞的染色體多于或少于2n=22，可能是在制片過程中少數(shù)染色體丟失或者染色體分散不好造成的，由于除此之外，在某些細胞中發(fā)現(xiàn)一些非正倍體，（1～2 個較小的染色體）(見圖1)，推斷這可能是B 染色體，B 染色體的存在會對A 染色體的形態(tài)和行為產(chǎn)生影響，對特定基因的表達具備積極意義，同時B 染色體數(shù)量會影響生物個體的生長、發(fā)育等。Silva 等研究了不同地區(qū)玉米象的核型分析，并發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的玉米象中B 染色體的數(shù)目不同[23]。B 染色體數(shù)目的差異在一定程度上會影響種群密度的變化，在不同的地區(qū)，B 染色體的數(shù)量不定。這一觀點Moraes 研究一致[24]。但不同物種的染色體的組成，著絲粒的位置以及染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)存在一定差別。由于本試驗的實驗材料沒有相應(yīng)的比對庫，所以不能對其進行熒光顯帶技術(shù)處理。

本研究發(fā)現(xiàn)長足大竹象具有大量的多倍體細胞，這一現(xiàn)象與七星瓢蟲成蟲脂肪體細胞核具有多倍性一致[25]，同時也與白蟻脂肪體核有多倍體相應(yīng)證[26]。脂肪體能儲存蛋白質(zhì)、糖類和脂肪等養(yǎng)分，供形成成蟲出土之前的休眠中、蛹期和成蟲期的需求，因此，幼蟲以及蛹含有豐富的脂肪體與長足大竹象的生活史中11 個月生活在地下有大的關(guān)系。

長足大竹象的細胞在減數(shù)第一次分裂的四分體期間，同源染色體間的聯(lián)會，其形態(tài)表現(xiàn)為“0”、“8”、“X”等形狀。這一結(jié)論與甜菜夜蛾細胞分裂期染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及蝗蟲減數(shù)分裂時期的染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)是一致的[27-28]。同源染色體形成環(huán)狀、端部交叉、尾尾對的構(gòu)型（見圖2E、F）。染色體交叉頻率越高，說明在減數(shù)分裂過程中，姐妹染色體及姐妹染色單體的互換頻率越高，染色體行為越復雜，越活躍，反之染色體越穩(wěn)定[28]。這一細胞生物學現(xiàn)象對研究生物的遺傳多樣性以及進化具有十分重要的作用。