湯小娟，楊瑤君，羅朝兵，龍文聰，付春

樂山師范學院生命科學學院，竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點實驗室，四川 樂山 614000

地球上每年通過光合作用合成的纖維素約1 000億噸[1]。纖維素是地球上分布最廣、最豐富的可再生生物資源，纖維素的利用和轉(zhuǎn)化對于解決目前世界能源危機、糧食短缺、環(huán)境污染等問題具有十分重要的意義[2]。利用纖維素酶對纖維素進行降解利用是最為有效的方法。近年來，昆蟲纖維素酶在工業(yè)生產(chǎn)和能源領(lǐng)域的潛在利用價值備受關(guān)注[3-4]。

一些昆蟲能夠利用纖維素酶消化食物中的纖維素，以獲得生長發(fā)育所需的營養(yǎng)。昆蟲體內(nèi)共生微生物分泌的纖維素酶最早發(fā)現(xiàn)于白蟻和蜚蠊腸內(nèi)[5-6]，此后在細菌、放線菌、真菌等微生物和其他昆蟲等動物（如白蟻、蝸牛）體內(nèi)也檢測到了纖維素酶的存在[7-8]。研究表明：除了昆蟲腸內(nèi)共生微生物產(chǎn)生纖維素酶以外，一些昆蟲體內(nèi)還存在內(nèi)源的纖維素酶，目前對鞘翅目昆蟲纖維素酶的研究還是較為廣泛，但缺乏同種條件下對鞘翅目昆蟲腸道內(nèi)不同段內(nèi)纖維素酶活性的綜合比較，因此本研究通過研究長足大竹象成蟲各段腸道內(nèi)纖維素酶在不同pH 值和溫度條件下的酶活性變化規(guī)律，為進一步尋找和開發(fā)高效纖維素酶系提供了基礎(chǔ)理論指導。

長足大竹象成蟲是鞘翅目象甲科昆蟲，國內(nèi)主要分布于四川、廣東、重慶、廣西、貴州等省區(qū)。長足大竹象在2003年被我國林業(yè)局列入危害我國林業(yè)有害生物名單，其寄主廣泛，危害大約28 種竹種的竹筍，危害率高達50%～80%[9]。竹子作為我國林業(yè)上的常見物種，其作用也不可小覷，尤其是在食用、醫(yī)藥、建筑、經(jīng)濟等方面。但在林業(yè)上對竹子的使用常常出現(xiàn)嚴重浪費，不能物盡其用。更有甚者還會造成環(huán)境污染。而在長足大竹象成蟲等甲蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的纖維素酶剛好可以降解竹子最主要的竹纖維，使不能被直接使用的竹纖維轉(zhuǎn)化為單糖，繼而制取酒精、食品、單細胞蛋白及其他化學化工原料[10]。現(xiàn)如今我國以原生態(tài)、無污染為根本出發(fā)點來發(fā)展農(nóng)業(yè)與經(jīng)濟，與以往常見的物理、化學轉(zhuǎn)化對竹纖維進行處理上利用纖維素酶對竹纖維的生物轉(zhuǎn)化不僅不會浪費資源，還會保護環(huán)境。本實驗利用長足大竹象成蟲這種害蟲體內(nèi)的纖維素酶進行體外探究最適條件使得體外高效降解竹纖維甚至模擬昆蟲體內(nèi)降解竹纖維的理想條件來生物轉(zhuǎn)化酒精等能源物質(zhì)成為可能，從而達到變害蟲為益蟲的性質(zhì)變化。

由于纖維素酶的活性于受到底物濃度、反應時間等諸多因素的限制，檢測結(jié)果也容易受到蛋白質(zhì)定量方法等因素的影響，很難和其他人的研究結(jié)果直接進行定量比較[11]。因此，在相同反應條件下對昆蟲腸道3 個不同部位內(nèi)纖維素酶活性的比較研究具有重要意義。本文在不同溫度和pH 值條件下檢測了長足大竹象成蟲3 段腸道內(nèi)纖維素酶的活性大小，為尋找生物高效降解竹纖維的最佳條件提供了可靠的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲體來源

長足大竹象（Cyrtotrachelus buqueti）采于四川省樂山市沐川縣大楠鎮(zhèn)。

1.2 試劑來源

羧甲基纖維素(CMC)和水楊素(Salicin)均由Sigma 公司生產(chǎn)，微晶纖維素(MCC)由Fluka 公司生產(chǎn)，其他試劑未有特別說明均為國產(chǎn)分析純。

1.3 初酶液的制備

取體態(tài)大小相同的蟲體5 只，冰浴解剖，取出腸道，用解剖針將腸道分成前、中、后腸，將其分別放在含有0.01 mol·L-1pH7.4 的檸檬酸緩沖液的研缽中充分勻漿，后于4 ℃10 000 r·min-1離心15 min，上清液即為原酶液。分別取3 mL 五只蟲體的3 段腸道的原酶液與只含相同濃度的檸檬酸緩沖液放入5 mL 的離心管中進行對應編號。分裝好之后放入到-70 ℃的冰箱中保存起來，備用。

1.4 稀釋酶液的蛋白含量

采用Bradford 法[12]測定蛋白質(zhì)的含量。稱取100 mg 考馬斯亮藍G-250，溶于50 mL 95%乙醇中，加入磷酸100 mL，最后用蒸餾水定容到1 000 mL；取50 mg 牛血清白蛋白（BSA），溶于50 mL 0.15 M NaCl 溶液中，配置成1 mg·mL-1標準蛋白溶液。

取11 支試管，分別加入0.00，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.0 ml 的0.06 ml 1 mg·mL-1的標準蛋白溶液（移液管），蒸餾水定容至1 mL，加入2.4 mL 考馬斯亮藍試劑，混勻后（微型旋渦混凝器）在595.0 nm 處測定OD 值，建立蛋白質(zhì)定量標準曲線。

分別取腸道3 段供試酶液0.05 mL，蒸餾水0.05 mL，分別加入2.4 mL 考馬斯亮藍試劑，混勻后在595.0 nm 處測定OD 值（酶標儀），每個樣品重復3 次，根據(jù)標準蛋白曲線計算稀釋后酶液中的蛋白質(zhì)含量。

1.5 葡萄糖標準曲線的繪制

首先配置1 mg·mL-1的標準葡萄糖溶液：取恒重葡萄糖0.1000 g 于50 mL 燒杯中，加蒸餾水稀釋后倒入100 mL 的容量瓶中，定容至100 mL。取8 支試管，分別加入0.00，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.12，0.14 mL 的1 mg·mL-1的標準葡萄糖溶液，用蒸餾水定容至1 mL 后，各瓶中均加1.5 mLDNS 顯色劑，搖勻后置于沸水浴中加熱5 min 后用水冷卻，加蒸餾水0.5 mL，搖勻。以1 號瓶為空白對照在540.0 nm 處測定各管的OD 值。以各瓶中葡萄糖的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

1.6 纖維素酶活性的測定

在5 個溫度和7 個pH 值(共計35 個組合)條件下分別對內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶(CX酶)、外切β-1，4-葡聚糖酶(C1酶)和β-葡萄糖苷酶的活性進行比較測定。

CX酶的測定用1%羧甲基纖維素為底物，C1酶的測定用2%微晶纖維素為底物，β-葡萄糖苷酶的測定用2%水楊素為底物。各底物分別用pH 值為3，4，5，6，7，8 的磷酸二氫鈉一檸檬酸緩沖液(0.2 mol·L-1)和pH 為9 的甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液(0.2 mol·L-1)配制。

取稀釋酶液0.1 mL 與0.3 mL 上述底物充分混勻，分別在30，40，50，60，70 ℃水浴中溫育2 h后，加入DNS 顯色劑2 mL，沸水浴顯色5 min，流水冷卻，在540 nm 下測定OD 值，每測定重復3 次，取平均值，同時設(shè)空白對照。以試驗條件下酶液蛋白含量(mg)在單位時間(min)內(nèi)酶促反應產(chǎn)生的還原糖(葡萄糖)量(μmol)計算酶活性，即μmol·min-1·mg-1。

1.7 數(shù)據(jù)分析

溫度和pH 值對甲蟲體內(nèi)纖維素酶活性影響采用方差分析法，各甲蟲纖維素酶最適溫度和pH 值條件下的活性值采用多重比較分析。所有數(shù)據(jù)處理均使用統(tǒng)計軟件SPSS18.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 長足大竹象成蟲前腸內(nèi)纖維素酶活性與pH 值和溫度的關(guān)系

pH 值和溫度的變化對長足大竹象成蟲前腸中3 種纖維素酶活性有顯著的影響。β-葡萄糖苷酶的最適溫度范圍為30～60 ℃，最適pH 值為4～6 之間，最高 酶 活 性 為 0.0257 μmol·min-1·mg-1（ pH 值=5，60 ℃），當pH 值處于較酸情況時，溫度高于40 ℃時β-葡萄糖苷酶活性呈上升趨勢。當pH 值處于較堿情況下時，該酶活性隨溫度的升高呈現(xiàn)下降趨勢直至無活性狀態(tài)；CX酶的最適溫度范圍在50～70 ℃之間，最適pH 值為6～8 之間，最高酶活性為0.0258 μmol·min-1·mg-1，當pH 值＜5 時，溫 度 在30～70 ℃之間都呈現(xiàn)無活性狀態(tài)，當5＜pH 值＜7時，各溫度條件下的酶活都呈現(xiàn)上升趨勢。但C1酶在各組合條件下的酶活性都較高，都有活性的存在，其中酶活性最高為0.0349 μmol·min-1·mg-1（pH值=3，40 ℃），最低的酶活為0.0012 μmol·min-1·mg-1（pH 值=9，40 ℃），當4＜pH 值＜7 時，在30～70 ℃的溫度下，酶活性都呈現(xiàn)上升趨勢（見圖1）。

圖1 長足大竹象成蟲前腸纖維素酶活性Fig.1 Cellulase activity in the foregut of Cyrtotrachelus buqueti adults

2.2 長足大竹象成蟲中腸內(nèi)纖維素酶活性與pH 值和溫度的關(guān)系

對于長足大竹象成蟲的中腸而言，β-葡萄糖苷酶活性的最適溫區(qū)為40～60 ℃，最適pH 值為5～6 之間，其 中 酶 活 性 最 高 為0.0228 μmol·min-1·mg-1（pH 值=6，T=50 ℃），當3＜pH 值＜4 等較酸狀態(tài)下時，溫度處于在60～70 ℃之間時酶活性較高，當7＜pH 值＜9 等較堿狀態(tài)下時，溫度在30～50 ℃時酶活性較高。CX酶的最適溫度范圍在40～60 ℃之間，最適pH 值為5～8 之間，其中最佳酶活性為0.031 μmol·min-1·mg-1（pH 值=6，T=50 ℃），當pH 值為3、4、9 時CX酶幾乎沒有酶活性的存在，當5＜pH 值＜8 時，在所實驗的溫度范圍內(nèi)酶活性都是依次遞加的。C1酶的最適溫度范圍為30～70 ℃，最適pH 值為5～8 之間，其中C1酶最適酶活性為0.0337 μmol·min-1·mg-1（pH 值=3，T=40 ℃），當3＜pH 值＜4 與8＜pH 值＜9 之間時，各溫度范圍內(nèi)酶活性都呈現(xiàn)下降趨勢，當pH 值位于5～8 之間時，C1酶活性在各溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢（見圖2）。

圖2 長足大竹象成蟲中腸纖維素酶活性Fig.2 Cellulase activity in the midgut of Cyrtotrachelus buqueti adults

2.3 長足大竹象成蟲后腸內(nèi)纖維素酶活性與pH 值和溫度的關(guān)系

對于長足大竹象成蟲的后腸而言，β-葡萄糖苷酶活性的最適溫區(qū)為30～50 ℃之間，最適pH 值區(qū)間為5～8，其 中 最 佳 酶 活 性 為0.027 μmol·min-1·mg-1（pH 值=6，50 ℃），當pH 值為3～4 與9 時，溫度處于60～70 ℃時酶活性處于較高狀態(tài)，當pH 值為5～8 之間時，溫度處于30～50 ℃β-葡萄糖苷酶處于較高的活性狀態(tài)。當pH 值為3、4 時，除溫度為70 ℃有活性外，其余溫度狀態(tài)下β-葡萄糖苷酶都處于無活性狀態(tài)，當pH 值為7、8 時，溫度處于60～70 ℃下幾乎無活性的存在。CX酶的最適溫區(qū)為30～50 ℃，最適pH 值區(qū)間為6～8，其中CX酶的最適酶活性為0.0263 μmol·min-1·mg-1（ pH 值=7，70 ℃） ，當pH 值為3～5 之間時，在所測的30～70 ℃溫度范圍內(nèi)CX酶幾乎沒有酶活性的存在，當pH 值為5～8 之間時，在30～70 ℃的溫度范圍內(nèi)，CX酶的酶活性都隨著pH 值的增加而增加，當pH 值為8～9 之間時，酶活性隨著pH 值的升高而升高。C1酶的最適溫區(qū)為40～50 ℃，最適pH 值區(qū)間為6～8，其中C1 酶的最 適 酶 活 性 為0.0317 μmol·min-1·mg-1（pH 值=3，40 ℃），在所測條件下除pH 值=9，40 ℃無酶活性外，其余各組合條件下均有酶活性的存在，當pH 值為3～4 之間時，各溫度狀態(tài)下，C1酶的酶活性隨pH 值的增加而減少，當pH 值為4～8 之間時，C1酶的酶活性隨pH 值的升高而升高，當pH 值為8～9 之間時，C1酶的酶活性隨pH 值的增加而減少（見圖3）。

2.4 長足大竹象成蟲腸道各段內(nèi)（前、中、后）β-葡萄糖苷酶活性的比較

β-葡萄糖苷酶在長足大竹象成蟲的前腸當中的最適酶活性為0.0257 mol·min-1·mg-1（pH 值=5，60 ℃），當pH 值為3、4、7、8、9 時β-葡萄糖苷酶都存在無活性狀態(tài)。β-葡萄糖苷酶在長足大竹象成蟲的中腸當中的最適酶活性為0.0288 μmol·min-1·mg-1（pH 值=6，50 ℃），當pH 值為3、4、8、9 時β-葡萄糖苷酶存在無活性狀態(tài)。β-葡萄糖苷酶在長足大竹象成蟲的后腸當中的最適酶活性為0.027 μmol·min-1·mg-1（pH值=6，50 ℃），當pH 值為3、4、7、8、9 時β-葡萄糖苷酶存在無活性狀態(tài)。β-葡萄糖苷酶在長足大竹象成蟲腸道各段內(nèi)的酶活性大小依次是中腸＞后腸＞前腸（見圖4）。

2.5 長足大竹象成蟲腸道各段內(nèi)（前、中、后）CX 酶活性的比較

CX酶在長足大竹象成蟲的前腸當中的最適酶活性 為0.0258 μmol·min-1·mg-1（pH 值=6，50 ℃），當pH 值為3、4、5、9 時CX酶都存在無活性狀態(tài)。CX酶在長足大竹象成蟲的中腸當中的最適酶活性為0.031 μmol·min-1·mg-1（pH 值=6，50 ℃），當pH 值為3、4、5、9 時CX酶都存在無活性狀態(tài)。CX酶在長足大竹象成蟲的后腸當中的最適酶活性為0.0263 μmol·min-1·mg-1（ pH 值=7，70 ℃） ，當pH 值為3、4、5、9 時CX酶存在無活性狀態(tài)。CX酶在長足大竹象成蟲腸道各段內(nèi)的酶活性大小依次是中腸＞后腸＞前腸（見圖5）。

圖3 長足大竹象成蟲后腸纖維素酶活性Fig.3 Cellulase activity in the hindgut of Cyrtotrachelus buqueti adults

圖4 長足大竹象腸道3 段中β-葡萄糖苷酶活性比較Fig.4 Comparison of glucosidase activity in three intestine segments of Cyrtotrachelus buqueti

圖5 長足大竹象腸道3 段中CX 酶活性比較Fig.5 Comparison of CX enzyme activity in three intestine segments of Cyrtotrachelus buqueti

2.6 長足大竹象成蟲腸道各段內(nèi)（前、中、后）C1 酶活性的比較

C1酶在長足大竹象成蟲的前腸當中的最適酶活性為0.0349 μmol·min-1·mg-1（pH 值=3，40 ℃），其中C1酶在任何pH 值條件下都有酶活性的存在。C1酶在長足大竹象成蟲的中腸當中的最適酶活性為0.0337 μmol·min-1·mg-1（ pH 值=3，40 ℃） ，當pH 值為4、9 時C1酶都存在無活性狀態(tài)。C1酶在長足大竹象成蟲的后腸當中的最適酶活性為0.0317 μmol·min-1·mg-1（ pH 值=3，40 ℃） ，當pH 值為9 時存在無活性狀態(tài)。C1酶在長足大竹象成蟲腸道各段內(nèi)的酶活性大小依次是前腸＞中腸＞后腸（見圖6）。

3 結(jié)論與討論

本文研究的長足大竹象成蟲腸道3 段（前、中、后）中均存在完整的纖維素酶系，但是各段內(nèi)的纖維素酶系的活性又不盡相同。

在長足大竹象成蟲的前腸當中β-葡萄糖苷酶的最適溫區(qū)為30～60 ℃，最適pH 值為4～6 之間；CX酶的最適溫區(qū)在50～70 ℃，最適pH 值為6～8 之間，而C1酶在任何的pH 值與溫度的組合下都呈現(xiàn)出較高的活性。就長足大竹象成蟲的前腸而言，CX酶比β-葡萄糖苷酶較易耐受高溫以及強堿，這可能是因為長足大竹象成蟲的前腸（包括口器、食道、嗉囊和前胃）主要的功能是鑷取、儲藏、磨碎食物，當長足大竹象成蟲在攝取竹子進入消化道之后，竹子當中所含的豐富的纖維素首先進入前腸被研磨、消化[13]，同時由于纖維素酶系消化纖維素是先由CX酶作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)或羧甲基纖維素，隨機水解β-1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維分子截斷，產(chǎn)生大量的小分子纖維素，再由C1酶作用于纖維素線狀分子末端，水解β-1，4-糖苷鍵，每次從纖維素鏈的非還原端切下一個纖維二糖分子，可以水解微晶纖維素，最后由β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖。而前腸主要起著研磨、分解纖維素的作用[14]，因此CX酶與C1酶較β-葡萄糖苷酶在前腸當中的穩(wěn)定性就較強，在最適條件下的纖維素酶活性也較高。

在長足大竹象成蟲的中腸當中β-葡萄糖苷酶的最適溫區(qū)為40～60 ℃，最適pH 值為5～6 之間。CX酶的最適溫區(qū)在40～60 ℃，最適pH 值為5～8。C1酶的最適溫區(qū)在30～70 ℃，最適pH 值為5～8 之間。其中中腸當中在最適條件下酶活性最大的為C1酶，其次為CX酶，這是由于長足大竹象成蟲中腸前端膨大腸壁密生排列規(guī)則向外突起的乳頭狀盲囊，呈肉色，其數(shù)目不等，目的在于擴大腸壁面積，利于食物消化和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。既然中腸的主要功能是在于食物的消化與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而由于纖維素在水解時由于C1酶水解纖維素之后產(chǎn)生的纖維二糖的積累會抑制CX酶的活性[15]而纖維素酶組分中β-葡萄糖苷酶含量最少、活力普遍較低，一般成為纖維素酶解的瓶頸[8]，因此在中腸當中C1酶的活性較大。

圖6 長足大竹象成蟲腸道3 段中C1 酶活性比較Fig.6 Comparison of C1 enzyme activity in three intestinal segments of Cyrtotrachelus buqueti adults

在長足大竹象成蟲的后腸當中β-葡萄糖苷酶的最適溫區(qū)為30～50 ℃，pH 值為5～8。CX酶的最適溫區(qū)在30～50 ℃，pH 值為6～8 之間。C1酶的最適溫區(qū)在40～50 ℃，最適pH 值為6～8 之間。在長足大竹象成蟲的后腸當中在最適條件下酶活性最大的是C1酶，其次是CX酶，這是由于中腸與后腸以馬氏管為界，分為透明細長管狀的前后腸和發(fā)達的直腸，前后腸在蟲體腹部回折兩次，表面粘附很多氣管，馬氏管呈透明狀，韌性變?nèi)?，易斷裂，直腸直連肛門[16]，其主要功能是回收水分。在后腸當中長足大竹象成蟲攝取的竹纖維在此部位已經(jīng)大致消化完全，因此其酶活性的大小特點就與中腸較為相似。

本實驗從長足大竹象成蟲的腸道各部位去分析其纖維素酶對其所攝食的竹纖維的分解情況，發(fā)現(xiàn)長足大竹象成蟲腸道各段內(nèi)的3 種纖維素酶活性在高溫、強堿條件下均為檢測出酶活性。值得關(guān)注的是，長足大竹象成蟲各段腸道也可以在酸性條件下檢測出酶活，其他一些甲蟲也有著類似的規(guī)律，例如，赤擬谷盜[17]、蕪菁[18]和幾種天牛在酸性條件下酶活性較高[19]。這可能是因為植物中含有的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等結(jié)晶組織需要酸性條件下分解。酸性處理纖維素底物能夠產(chǎn)生非結(jié)晶末端，使纖維素更容易被分解[20]。