秦楓，劉云，夏文龍，吳植，吳雙，王安平，封琦，王永娟，郭長明，朱善元，吳曉潔

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇 泰州 225300; 2.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 2250091)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種急性、接觸性、高度傳染性疾病，通常表現(xiàn)為母豬的繁殖障礙(如晚期流產(chǎn)、死產(chǎn)和木乃伊)以及新生和斷奶仔豬的呼吸系統(tǒng)疾病(如間質(zhì)性肺炎)[1]，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]。目前，控制和預(yù)防該綜合征的主要措施是接種疫苗。滅活苗[3]具有安全、貯存和運輸方便等優(yōu)點，但其免疫次數(shù)多、成本較高；弱毒苗[4]具有免疫力強、免疫期長的優(yōu)點，但其存在污染環(huán)境、毒力返強等問題。因此，迫切需要開發(fā)新的安全、有效且廉價的抗PRRSV的藥物。

在抗病毒研究中，許多中藥及其提取物對抗豬繁殖與呼吸綜合征都表現(xiàn)出了較強的抑制作用。KIDSADAGON等[5]研究了狗牙根提取物抗PRRSV的體外作用，該研究表明，質(zhì)量濃度為0.78 mg ·mL-1的狗牙根粗提物可能使PRRSV失活并在體外抑制PRRSV的復(fù)制。GAO等[6]調(diào)查了隱孔菌子實體提取物是否具有抑制PRRSV感染的能力，結(jié)果表明隱孔菌的提取物在體外和體內(nèi)均抑制PRRSV感染，表明隱孔菌的子實體的水提取物可用作抗病毒治療劑。冼瓊珍等[7]發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根、黃芪、青蒿、蘆根、連翹、穿心蓮和夏枯草均具有抗 PRRSV 作用，并且藍(lán)根、黃芪、青蒿和蘆根的抗病毒作用較顯著。半邊蓮(LobeliaChinensis)，又稱急解索、細(xì)米草、蛇舌草，為桔梗科植物半邊蓮的全草，起載于《滇南本草》，之后李時珍在《本草綱目》中亦有記載，性辛、平，歸心、小腸、肺經(jīng)，其主要含有酚類、生物堿、脂肪酸類、黃酮類和氨基酸等化學(xué)成分，具有清熱解毒、利尿消腫之功效[8]。李家偉等[9]研究發(fā)現(xiàn)，半邊蓮醇提物及其氯仿萃取物均表現(xiàn)出較好的抗H9N2型禽流感病毒(H9N2 AIV)的作用，并且發(fā)現(xiàn)半邊蓮中的生物堿和黃酮類很可能是其抗病毒活性成分。本研究采用水煎煮法和超聲提取法對半邊蓮進行提取，探討半邊蓮水提取物、總黃酮和總生物堿3種不同提取物的體外抗PRRSV的效果，旨在為開發(fā)抗PRRSV藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒與中藥材

Marc-145細(xì)胞、PRRSV SH1705毒株、病毒滴度為105TCID50·mL-1的PRRSV SH1705病毒液、針對PRRSV ORF7編碼序列的特異性引物(F:5’-GGGGAATGGCCAGYCAGTCAA-3’,R:5’-GCCAGRGGAAAATGKGGCTTCTC-3’)、拷貝數(shù)為4.34×109的pMD-ORF7標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒均由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室保存。中藥材半邊蓮購自于安國藥源商貿(mào)有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自于美國Hyclone公司；細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)購自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；青鏈霉素混合液(100倍)、二甲基亞砜(DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，用PBS液配制成2 mg·mL-1,用前新鮮配制。

1.2.2 主要儀器 生物安全柜(MVE公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Bioteck公司)，CO2培養(yǎng)箱(NVAIRE公司)，ABI 7300(Thermo公司)，倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)，-80 ℃ 超低溫冰箱(Thermo公司)

1.3 中藥提取

1.3.1 半邊蓮水提取物的制備 用傳統(tǒng)水煎煮法提取半邊蓮水提液。稱取半邊蓮藥材20 g，粉碎至200目，10倍水浸泡過夜，煎煮2次，30 min·次-1，合并濾液，濃縮至浸膏狀。

1.3.2 半邊蓮總黃酮的制備 參照蔣瓊鳳等[10]的方法并進行改進，使用超聲波提取法提取半邊蓮總黃酮。稱取半邊蓮藥材20 g，粉碎至200目，10倍的60%乙醇浸泡過夜，提取溫度60 ℃，超聲提取2次，30 min·次-1，合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀。

1.3.3 半邊蓮總生物堿的制備 參照孫堯等[11]的方法并進行改進，使用超聲波提取法提取半邊蓮總生物堿。稱取半邊蓮藥材20 g，粉碎至200目，10倍的90%乙醇浸泡過夜，提取溫度60 ℃，超聲提取2次，30 min·次-1，合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀。

將上述3種濃縮浸膏-80 ℃預(yù)凍24 h后，冷凍干燥機干燥，稱重，計算得率。

1.4 藥物安全性測定

1.4.1 Marc-145細(xì)胞培養(yǎng) 取出凍存在液氮中的細(xì)胞，立即置于37 ℃ 恒溫水浴鍋中，不停地?fù)u動使其快速融化。后將該細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有預(yù)熱完全的培養(yǎng)基的離心管中，1 500 r·min-1離心，5 min，棄上清液，用預(yù)熱完全的培養(yǎng)基將其重懸后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[12]，細(xì)胞長至單層后進行消化，傳代備用。

1.4.2 藥物安全性試驗 采用MTT法[13]檢測藥物對細(xì)胞的抑制率，測定其在490 nm的光吸收值，根據(jù)OD值計算細(xì)胞生長抑制率。

將細(xì)胞瓶中長至單層的細(xì)胞消化后，計數(shù)，用含10% FBS的DMEM稀釋至約2×105·mL-1，加入96孔板,每孔100 μL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞長至單層后，棄去培養(yǎng)液，第1～10列依次從低質(zhì)量濃度至高質(zhì)量濃度加入以安全質(zhì)量濃度起始的藥液，每個濃度重復(fù)4孔，每孔100 μL，11～12列加入細(xì)胞培養(yǎng)液作為細(xì)胞對照，置于 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)72 h后，棄去藥液，加入MTT溶液(PBS溶解，2 mg·mL-1)，50 μL·孔-1，培養(yǎng)4 h后，棄去MTT溶液，加入DMSO完全溶解結(jié)晶，測OD490值。計算公式如下：生長抑制率=(細(xì)胞對照組OD490值-藥物組OD490值)/細(xì)胞對照組OD490值×100%。

1.5 PRRSV病毒滴度測定

1.5.1 PRRSV的擴增 將細(xì)胞瓶中長至單層的細(xì)胞消化后，棄去舊培養(yǎng)液，用 PBS洗2遍。用含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋 PRRSV，接種病毒液至細(xì)胞中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80%～90%病變時，終止培養(yǎng)。將病變細(xì)胞在-80 ℃與4 ℃反復(fù)凍融3次后，收集細(xì)胞懸液，5 000 r·min-1離心5 min，收集上清液[14]，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝至EP管內(nèi)，標(biāo)注好分裝時間與批次等信息后，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 熒光定量PCR法測定病毒滴度

1.5.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit的操作說明，從PRRSV SH1705病毒液中提取RNA。將提取得到的RNA依據(jù)TaKaRa Prime Script RT Master Mix試劑盒的反應(yīng)體系，進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA模板[15-17]。同時，將實驗室保存的病毒滴度為105TCID50·mL-1的病毒液，提取RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，并得到cDNA模板。

1.5.2.2 實時熒光定量PCR 取拷貝數(shù)為4.34×109的pMD-ORF7標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，配制成濃度為10-1～10-9的稀釋液，依次10倍比稀釋，共9個濃度梯度，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，作為模板，按照TaKaRa SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書的反應(yīng)體系配制反應(yīng)液，將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板以及稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品進行熒光定量PCR反應(yīng)[18]。

1.6 半邊蓮提取物體外抗PRRSV的效果測定

1.6.1 阻斷作用試驗 以各提取物的最大安全質(zhì)量濃度為起始質(zhì)量濃度，用含2% FBS 的DMEM培養(yǎng)液2倍比稀釋成4個質(zhì)量濃度梯度，每個濃度梯度重復(fù)4孔，PRRSV液稀釋度為100 TCID50,另設(shè)利巴韋林陽性對照，病毒對照及細(xì)胞對照，進行阻斷作用試驗、抑制作用試驗和直接滅活試驗。于 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)的情況，待病毒對照組細(xì)胞病變程度達(dá)到80%～90% 后，用MTT法測各孔OD值，計算細(xì)胞保護率[19]。

藥物對細(xì)胞的保護率=(加藥孔OD490值-病毒對照組OD490值)/(細(xì)胞對照孔OD490值-病毒對照孔OD490值)×100%

Marc-145細(xì)胞在96孔板中長至單層后，棄去舊培養(yǎng)液，加入以最大安全質(zhì)量濃度為起始質(zhì)量濃度的藥液，每孔100 μL，培養(yǎng)4 h后，棄去藥液，加入100 TCID50PRRSV液，每孔100 μL，培養(yǎng)2 h后，棄去病毒液，加入含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液。

1.6.2 抑制作用試驗 Marc-145細(xì)胞在96孔板中長至單層后，棄去舊培養(yǎng)液，加入100 TCID50PRRSV液，每孔100 μL，培養(yǎng)2 h后，棄去病毒液，加入以最大安全質(zhì)量濃度為起始質(zhì)量濃度的藥液，每孔100 μL，培養(yǎng)4 h后，棄去藥液，加入含2% FBS 的DMEM培養(yǎng)液。

1.6.3 直接滅活試驗 Marc-145細(xì)胞在96孔板中長至單層后，棄去舊培養(yǎng)液，同時加入50 μL藥液和50 μL病毒液(使藥液最高質(zhì)量濃度為最大安全質(zhì)量濃度和病毒液終濃度為100 TCID50)，培養(yǎng)4 h后，棄去藥液，加入含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液。

1.7 數(shù)據(jù)處理

上述各組每天用顯微鏡觀察CPE情況并記錄，且根據(jù)中藥對病毒的抑制率評價其抗病毒的效果，抑制率值越高，說明其抗病毒作用越強。采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 半邊蓮提取物得率

稱得半邊蓮水提取物、半邊蓮總黃酮、半邊蓮總生物堿干燥后粉末質(zhì)量分別為7.18 、5.08 和6.54 g，得率分別為35.9%、25.4%和32.7%。

2.2 半邊蓮提取物對細(xì)胞的安全質(zhì)量濃度測定結(jié)果

細(xì)胞病變觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同藥物對Marc-145細(xì)胞都有著一定程度的毒性作用，并且藥物質(zhì)量濃度越高毒性作用越強，主要表現(xiàn)為細(xì)胞折光性增加，變圓、粘連、破碎，甚至脫落。根據(jù)公式以O(shè)D490值計算藥物對細(xì)胞的生長抑制率，當(dāng)抑制率為0時，則表示在該質(zhì)量濃度下藥物對細(xì)胞沒有毒性作用，從而確定藥物的最大安全質(zhì)量濃度，結(jié)果見表1。由表1可知，半邊蓮水提取物、半邊蓮總黃酮、半邊蓮總生物堿和利巴韋林的最大安全質(zhì)量濃度分別為2.5 、1.25 、0.63 、0.016 mg·mL-1。

注：S、H、G、P分別代表半邊蓮水提取物、半邊蓮總黃酮、半邊蓮總生物堿、利巴韋林。半邊蓮水提取物、半邊蓮總黃酮和半邊蓮總生物堿的起始質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1。利巴韋林的起始質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1。

Note:S,H,G,and P represent the water extract,the total flavonoids,the total alkaloids ofLobeliaChinensisLour,and ribavirin.The initial mass concentration of the water extract,the total flavonoids,the total alkaloids ofLobeliaChinensisLour was 5 mg·mL-1.The initial mass concentration of ribavirin was 1 mg·mL-1.

2.3 PRRSV的TCID50測定結(jié)果

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，已知病毒滴度為105TCID50·mL-1的PRRSV病毒液拷貝數(shù)為1.98×108，擴增所得PRRSV病毒液拷貝數(shù)為5.27×108，根據(jù)拷貝數(shù)與病毒滴度對應(yīng)成比例計算可得，擴增所得PRRSV病毒液滴度為2.66×105TCID50·mL-1。

2.4 半邊蓮提取物抗PRRSV的藥效結(jié)果

2.4.1 PRRSV細(xì)胞形態(tài)觀察 各試驗組3種作用方式下的PRRSV細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1可知，病毒對照組大部分細(xì)胞出現(xiàn)了圓縮、團聚、脫落的現(xiàn)象，而細(xì)胞對照組細(xì)胞保持單層完好。

從半邊蓮提取物對PRRSV的阻斷作用來看，半邊蓮水提取物、半邊蓮總黃酮、半邊蓮總生物堿和陽性藥物利巴韋林處理組均發(fā)生了不同程度的病變。半邊蓮水提取物處理組和半邊蓮總黃酮處理組病變較明顯，PRRSV細(xì)胞發(fā)生明顯圓縮，并伴隨有脫落現(xiàn)象，而半邊蓮總生物堿處理組細(xì)胞病變現(xiàn)象較半邊蓮水提取物處理組和半邊蓮總黃酮處理組較輕微，PRRSV細(xì)胞出現(xiàn)部分團聚現(xiàn)象，但基本保持單層完好。與陽性對照利巴韋林處理組相比，半邊蓮水提取物處理組和半邊蓮總黃酮病變現(xiàn)象與其相近，半邊蓮總生物堿處理組PRRSV細(xì)胞基本無病變。

S：半邊蓮水提取物(2.5 mg·mL-1)；H：半邊蓮總黃酮(1.25 mg·mL-1)；G：半邊蓮總生物堿(0.63 mg·mL-1)；P：陽性對照藥物利巴韋林(0.016 mg·mL-1)S: Water extract of Lobelia Chinensis Lour(2.5 mg·mL-1); H:Total flavonoid of Lobelia Chinensis Lour(1.25 mg·mL-1); G:Total alkaloids of Lobelia Chinensis Lour(0.63 mg·mL-1); P: Positive control drug ribavirin (0.016 mg·mL-1)

從半邊蓮提取物對PRRSV的抑制作用來看，半邊蓮水提取物處理組和半邊蓮總生物堿處理組出現(xiàn)了明顯病變，PRRSV細(xì)胞發(fā)生圓縮、團聚現(xiàn)象，半邊蓮總黃酮處理組病變現(xiàn)象輕微，PRRSV細(xì)胞出現(xiàn)圓縮現(xiàn)象，但也基本保持單層完好。與陽性對照利巴韋林處理組相比，半邊蓮水提取物處理組和半邊蓮總生物堿處理組PRRSV細(xì)胞病變程度略微嚴(yán)重。

從半邊蓮提取物對PRRSV的直接滅活作用來看，半邊蓮總黃酮處理組有輕微病變現(xiàn)象，PRRSV細(xì)胞部分圓縮，但基本保持細(xì)胞單層完好，而半邊蓮水提取物處理組和半邊蓮總生物堿處理組PRRSV細(xì)胞出現(xiàn)了圓縮、團聚及脫落現(xiàn)象，與陽性對照利巴韋林處理組相比，無明顯差異。

2.4.2 半邊蓮提取物對PRRSV的抑制率 MTT檢測中藥OD490值，當(dāng)OD490值越高時，說明藥物對細(xì)胞的保護作用越強，即對PRRSV的抑制作用越強，半邊蓮3種提取物的抗PRRSV的作用抑制率見表2。

由表2～表4可以看出，陽性對照利巴韋林對PRRSV阻斷、抑制和殺滅作用方式下的最高抑制率分別為63.3%、68.9%和65.6%。半邊蓮水提取物對PRRSV阻斷、抑制和殺滅作用方式下的最高抑制率分別為52.1%、60.2%和50.8%，其對PRRSV的抑制作用比其他2種作用方式稍強，但其3種作用方式對PRRSV的抑制率均極顯著低于陽性對照利巴韋林處理組(P<0.01)。半邊蓮總黃酮對PRRSV的抑制和殺滅作用比較強，最高抑制率分別為85.0%、93.9%，與陽性對照利巴韋林處理組相比，其抗病毒效果極顯著(P<0.01)，但其對PRRSV的阻斷作用較弱，最高抑制率為51.1%，極顯著低于陽性對照利巴韋林處理組(P<0.01)。半邊蓮總生物堿對PRRSV的抑制作用和殺滅作用也具有一定的抗病毒效果，最高抑制率分別為57.8%、58.1%，但其對PRRSV的阻斷作用效果較明顯，抑制率為91.2%，與陽性對照利巴韋林處理組，對PRRSV的阻斷作用極顯著(P<0.01)。

表2 不同質(zhì)量濃度半邊蓮提取物在阻斷作用下對PRRSV的抑制率Table 2 Inhibition rate of PRRSV under blocking effect by different mass concentrations of Lobelia Chinensis Lour %

注：C1、C2、C3、C4分別為對應(yīng)藥物的1、0.5、0.25、0.125倍最大安全質(zhì)量濃度。*，**表示每列的藥物組與利巴韋林對照組的差異顯著性分別為P<0.05,P<0.01(增強作用)；a，aa表示每列的藥物組與利巴韋林對照組的差異顯著性分別為P<0.05,P<0.01(減弱作用)。下同。

Note: C1,C2,C3,and C4 are the maximum safe mass concentrations of 1,0.5,0.25,and 0.125 times of the corresponding drugs,respectively.*,** indicates that the difference between the drug group and the ribavirin control group in each column isP<0.05,andP<0.01 (enhancement),respectively;a,aa indicates that the difference between the drug group and the ribavirin control group in each column isP<0.05,andP<0.01 (attenuated effect),respectively.The same as below.

表3 不同質(zhì)量濃度半邊蓮提取物在抑制作用下對PRRSV的抑制率Table 3 Inhibition rate of PRRSV under inhibition effect by different mass concentrations of Lobelia Chinensis Lour %

表4 不同質(zhì)量濃度半邊蓮提取物在直接滅活作用下對PRRSV的抑制率 Table 4 Inhibition rate of PRRSV under direct inactivation by different mass concentrations of Lobelia Chinensis Lour %

3 結(jié)論與討論

本試驗采用煎煮法和超聲提取法2種提取方式對半邊蓮進行提取，得到半邊蓮水提取物、半邊蓮總黃酮和半邊蓮總生物堿，采用MTT法并結(jié)合細(xì)胞病變觀察，以利巴韋林作為陽性對照，研究了這3種提取物體外對PRRSV的抗病毒作用。研究結(jié)果表明，半邊蓮提取物在體外對PRRSV具有阻斷、抑制和殺滅的作用。綜合3種作用方式，這3種半邊蓮提取物均對PRRSV具有抗病毒作用，能給細(xì)胞提供較好的保護作用，且半邊蓮總黃酮抗PRRSV的作用最強，其次是半邊蓮總生物堿，半邊蓮水提取物對PRRSV也具有一定的抗病毒作用，但相比較其它2種提取物，其作用效果較弱。

本試驗主要采用MTT法來評價中藥提取物對細(xì)胞的毒性，并采用MTT法計算藥物對細(xì)胞的最大安全濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，半邊蓮水提物最大安全質(zhì)量濃度最高，為2.5 mg·mL-1，說明其對細(xì)胞的毒性最小，半邊蓮總黃酮和總生物堿的最大安全質(zhì)量濃度分別為1.2、0.63 mg·mL-1。陽性對照藥物利巴韋林的最大安全質(zhì)量濃度為0.016 mg·mL-1，這與趙昕等[20]測定的結(jié)果不同，在趙昕的研究中，其所用的利巴韋林的最大安全質(zhì)量濃度是指在細(xì)胞病變?yōu)?0%的情況下的質(zhì)量濃度，而本研究中所使用的利巴韋林最大安全質(zhì)量濃度是指在該濃度下細(xì)胞完全無病變。

目前測定病毒滴度的方法有很多，如通過酶聯(lián)免疫斑點試驗、Reed-Muench兩氏法、熒光定量PCR等均可獲得病毒滴度[21-23]，但是酶聯(lián)免疫斑點法操作繁瑣，而Reed-Muench兩氏法耗時較長。熒光定量PCR是目前檢測核酸含量以及分析基因表達(dá)水平相對變化的主要技術(shù)[24]，其準(zhǔn)確性高、特異性強、靈敏度高、操作簡便，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)等多個學(xué)科領(lǐng)域。本研究采用熒光定量PCR方法檢測PRRSV病毒液的病毒載量，根據(jù)已知病毒滴度的病毒液，更為快速、準(zhǔn)確地得到擴增后PRRSV病毒液的病毒滴度。鞣質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機酸鹽、生物堿鹽及苷類等都能被水溶出，這些成分可能具有協(xié)同抗病毒的作用，現(xiàn)已有許多研究表明中藥水提取物具有很好的體外抗病毒作用。羅聰?shù)萚25]研究發(fā)現(xiàn)，牛奶菜水提物對中華眼鏡蛇毒神經(jīng)毒性具有抑制作用。黃酮是多種天然藥物的活性成分之一，具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化等多種活性[26]。目前，已經(jīng)有大量的研究表明，黃酮具有抗多種病毒的作用，對流感病毒[27]、乙肝病毒[28]、柯薩奇病毒[29]等都有著顯著的抗病毒效果。生物堿是生物體內(nèi)的堿性含氮有機化合物，具有抗菌、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[30]。有研究報道，苦參堿類生物堿具有抗肝炎病毒、柯薩奇B3病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒等病毒的作用[31]。從半邊蓮3種提取物抗PRRSV的抑制率來看，半邊蓮水提取物抗病毒效果較弱，對病毒的阻斷、抑制和直接滅活作用的最高抑制率分別為52.1%、60.2%、52.6%。半邊蓮總黃酮對PRRSV的抑制和殺滅作用較強，最高抑制率分別為85.0%、96.0%，但其阻斷作用的最高抑制率為51.1%。半邊蓮總生物堿對PRRSV的阻斷作用較強，最高抑制率為91.2%，其他兩種作用方式的最高抑制率均低于60%。與陽性對照利巴韋林相比，半邊蓮總黃酮對PRRSV的抑制和殺滅作用和半邊蓮總生物堿對PRRSV的阻斷作用極顯著(P<0.01)。各試驗組細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，半邊蓮總黃酮在抑制和殺滅病毒作用方式下以及半邊蓮總生物堿在阻斷作用方式下，細(xì)胞只出現(xiàn)部分圓縮情況，基本保持細(xì)胞單層完好，而半邊蓮水提取物3種作用方式下均出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變。

病毒的增殖過程可分為吸附、穿入、脫殼、基因組轉(zhuǎn)錄、基因組復(fù)制、基因表達(dá)、裝配、成熟與釋放。在病毒增殖周期中，病毒吸附于宿主細(xì)胞表面并與之結(jié)合，之后穿過細(xì)胞膜進入細(xì)胞，在細(xì)胞溶酶作用下，脫去衣殼蛋白釋放病毒核酸入細(xì)胞內(nèi)，之后進入病毒的生物合成階段，包括病毒核酸復(fù)制和基因表達(dá)，最終病毒核酸與蛋白質(zhì)合成之后，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)組裝成成熟的病毒顆粒。推測半邊蓮生物堿可能通過阻止病毒顆粒對宿主細(xì)胞的吸附過程，增加Marc-145細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，而發(fā)揮抗病毒作用，半邊蓮總黃酮可能通過抑制病毒基因組轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄的修飾，抑制病毒基因組核酸的復(fù)制，以及抑制病毒蛋白質(zhì)合成及轉(zhuǎn)運等來實現(xiàn)其抑制作用[32-33]。在國內(nèi)外研究中，至今尚未見半邊蓮抗PRRSV的報道，但有相關(guān)研究證明了其抗其他病毒及抑制腫瘤細(xì)胞的作用。李家偉等[9]發(fā)現(xiàn)，半邊蓮醇提物及其氯仿萃取物在體內(nèi)、體外感染模型都表現(xiàn)出H9N2 AIV活性，并且初步確定半邊蓮中抗流感病毒的成分很有可能是生物堿。其推測半邊蓮氯仿萃取物不僅對病毒感染對細(xì)胞的吸附有抑制作用外，可能對病毒的復(fù)制也有抑制作用，并且推測半邊蓮醇提物氯仿萃取物中抗病毒活性成分是容易透過細(xì)胞膜進入細(xì)胞的小分子物質(zhì)。何珊等[34]研究表明半邊蓮生物堿對骨髓瘤細(xì)胞U266有明顯的抑制作用，且其黃酮類的主要成分木犀草素對人宮頸癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞有顯著的抑制作用。大量流行病學(xué)證據(jù)表明，病毒基因能夠與正常細(xì)胞DNA進行整合，使其逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)控和清除作用，從而誘發(fā)腫瘤。鑒于病毒和癌癥較大的相關(guān)性，也間接證明了半邊蓮生物堿和總黃酮可能具有抗病毒作用[35]。

本研究表明，半邊蓮提取物具有體外抗PRRSV的作用且初步明確了其抗病毒的有效部位。其體內(nèi)抗病毒研究也有報道，熊菲等[36]發(fā)現(xiàn)半枝蓮注射液對人工感染鴨病毒性肝炎有較好治療作用。何恒清等[37]發(fā)現(xiàn)半邊蓮具有防控雞瘟的效果。杜麗華等[38]研究證明，含有半邊蓮的中藥復(fù)方制劑對于治療宮頸人乳頭瘤病毒感染的具有一定的療效。上述研究表明半邊蓮及其制劑能防控鴨肝炎、雞新城疫、人乳頭瘤病毒等。