黃萍， 王楠， 周紫羽， 王婷， 袁志良， 常介田， 葉永忠

(1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 中牟 451450；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002)

土壤微生物是土壤中最活躍的部分[1]，通過氧化、氨化、硝化等過程促進(jìn)土壤養(yǎng)分的分解與轉(zhuǎn)化[2]，是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)的主要參與者[3-4]。土壤是微生物的“天然培養(yǎng)基”，其中細(xì)菌的種類和數(shù)量最多[5]，占土壤微生物總量的90%以上[6]。土壤細(xì)菌對環(huán)境的變化敏感，土壤的溫度、pH值和性質(zhì)等變化都會對土壤細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[7-9]。相對真菌而言，土壤細(xì)菌在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著更加重要的作用[10]，其群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性更能反映土壤的健康狀況[11]。森林是陸地上最重要，同時也是最復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)類型[12]。自2004年以來，研究學(xué)者陸續(xù)在寶天曼、長白山、古田山、尖峰嶺等地建立多個大型固定監(jiān)測樣地[13-16]，為研究物種多樣性的維持機(jī)制、群落動態(tài)、物種空間分布格局等生態(tài)學(xué)規(guī)律和現(xiàn)象提供了良好的研究平臺[17-19]。目前,在大型森林樣地開展的研究多以木本植物為研究對象，對土壤微生物的研究還相對較少[20]?；诖笮捅O(jiān)測樣地開展土壤細(xì)菌的研究，將是了解土壤細(xì)菌及植物群落多樣性維持機(jī)制的重要途經(jīng)。伏牛山為中國南北區(qū)域最重要分界“秦嶺—淮河”的主要組成部分，位于暖溫帶向北亞熱帶過渡區(qū)域，兼具暖溫帶與北亞熱帶的氣候特征，是進(jìn)行生態(tài)學(xué)研究的理想場所[21]。洛陽白云山國家森林公園位于伏牛山腹地。王雪穎等[22]研究了該區(qū)域大型真菌多樣性；段春燕等[23]調(diào)查了該區(qū)域珍稀瀕危植物資源；歐陽鳳等[24]采用樣線法和踏查法對該區(qū)域兩棲動物進(jìn)行了考察。本研究以洛陽白云山5 hm2長期固定監(jiān)測樣地為研究平臺，主要探討以下三個問題：(1)白云山土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；(2)白云山土壤細(xì)菌在不同分類水平上的主要菌群；(3)白云山森林監(jiān)測樣地中土壤細(xì)菌群落分布與環(huán)境因子的相關(guān)性。通過本研究加深人們對暖溫帶-北亞熱帶過渡區(qū)域土壤細(xì)菌群落多樣性的認(rèn)識，為該區(qū)域土壤細(xì)菌及木本植物群落多樣性維持機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

白云山國家森林公園位于河南省洛陽市嵩縣南部伏牛山腹地(111° 48′～112° 16′E，33° 33′～33°56′N)，總面積168 hm2。白云山位于暖溫帶與北亞熱帶生態(tài)過渡區(qū)，地跨長江、黃河、淮河三大流域，平均海拔1 800 m，玉皇頂海拔2 216 m。該區(qū)域年平均降水量約1 200 mm，年平均氣溫為18 ℃，夏季最高氣溫不超過26 ℃，森林覆蓋率98.5%以上。區(qū)內(nèi)土壤質(zhì)地多以輕壤為主，pH 5.5～6.5。

1.2 樣方設(shè)置與樣品采集

2015年，參照美國史密森研究院的大樣地建設(shè)與監(jiān)測技術(shù)規(guī)范[25-26]，選擇典型落葉闊葉林群落建立東西長250 m、南北長200 m的5 hm2的長期固定監(jiān)測樣地。前期調(diào)查研究表明，樣地內(nèi)共有木本植物34科55屬93種，銳齒槲櫟(Quercusalienavar.acuteserrata)為樣地中的優(yōu)勢物種[27]。

2018年7月，在每個20 m×20 m的子樣方中選取3個取樣點(取樣點的分布如圖1所示)，并將這3個點的土壤混合為1個樣品，取樣時先將凋落物和腐殖質(zhì)層移除，再用土鉆采集土層0～10 cm的土壤，通過2 mm篩后分為2份，保存在-80 ℃用于DNA提取和后續(xù)試驗。

圖1 3個取樣點的位置分布圖Fig.1 The location distribution of the three sample points

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測序

采用試劑盒提取土壤細(xì)菌宏基因組DNA，16S rRNA基因的V4高變區(qū)擴(kuò)增引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′)。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；16 ℃ 10 min。將質(zhì)量合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA文庫的構(gòu)建，并使用Illumina公司的Miseq臺式測序儀，采用雙末端測序法進(jìn)行高通量測序[28]。

1.4 土壤理化性質(zhì)測定方法

土壤磷含量的測定采用NaHCO3浸提比色法，土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)采用重鉻酸鉀容量法，使用堿解擴(kuò)散法測定土壤堿解氮含量(N)，土壤含水量(WC)采用105 ℃ 24 h烘干法，土壤pH值通過玻璃電極pH計測定，水土質(zhì)量比為2.5∶1。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用序列拼接軟件FLASH[2](Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11)，按照重疊關(guān)系將雙末端測序得到的成對reads拼接成一條序列，所有樣品一共得到7 329 751條Tags，平均每個樣品61 081條，SD值為428；Tag平均長度為253 bp，SD值為1 bp。

利用軟件USEARCH(v7.0.1090)將拼接好的 Tags聚類為OTU(Operational Taxonomic Units)，其主要過程為：(1)利用UPARSE在97%相似度下進(jìn)行聚類，得到OTU的代表序列；(2)利用UCHIME(v4.2.40)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的嵌合體從OTU代表序列中去除；(3)使用usearch-global方法將所有Tags比對回OTU代表序列，得到每個樣品在每個OTU的豐度。

取樣點數(shù)-土壤細(xì)菌類群曲線的制作：從120個樣品中隨機(jī)抽取1個樣品,記下這個樣品中包含的細(xì)菌類群數(shù)目；然后從剩下的119個樣品中再隨機(jī)抽取1個樣品數(shù)據(jù)，和第1次抽到的樣品數(shù)據(jù)合并,記下這2個樣品中包含的細(xì)菌類群數(shù)目，依此類推,直至采樣點的數(shù)目達(dá)到120；重復(fù)多次取平均值，制作取樣點數(shù)-土壤細(xì)菌類群曲線。

覆蓋率指數(shù)表示測序深度指數(shù)，本分析通過mothur(v1.31.2)軟件計算樣品的Alpha多樣性值并用R(3.1.1)軟件做出相應(yīng)的稀釋曲線圖。

冗余分析和相關(guān)性分析在R語言中完成，冗余分析(Redundancy analysis,RDA)是一種回歸分析結(jié)合主成分分析的排序方法，使用的是R語言中的Vegan包[29]，相關(guān)性分析采用的是隨機(jī)化排列檢驗，通過99次數(shù)據(jù)的隨機(jī)排列來分析2類環(huán)境因子對細(xì)菌群落分布影響的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中細(xì)菌多樣性

120個樣品共檢測出12 852個OTU，其中220個OTU為所有樣品共有。120個土壤樣品中平均有3 549±599個OTU，單個樣品中最多的有4 680個，最少的有2 001個，分屬于51門173綱325目482科707屬。當(dāng)取樣點數(shù)在0～20區(qū)間時，檢測到的OTU數(shù)目隨取樣點數(shù)的增加而快速增加；當(dāng)取樣點數(shù)在20～80區(qū)間時，檢測到的OTU數(shù)目增速減慢；當(dāng)取樣點數(shù)大于80時，檢測到的OTU數(shù)目增加極少，曲線平緩(圖2)。采集的120個土壤樣品的覆蓋率指數(shù)平均值為0.971 191，最大值為0.985 501，最小值為0.961 573，隨著檢測到的序列數(shù)目不斷增加，覆蓋率指數(shù)也越來越接近1(圖3)。

圖2 120個土壤樣品中檢測到的細(xì)菌OTU數(shù)目隨取樣點數(shù)增加的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve of the number of bacterial OTU detected in soil samples increasing with the number of sampling points

2.2 土壤細(xì)菌分類

2.2.1 門 120個土壤樣品中平均有細(xì)菌38.76±2.93門，其中單個樣品中最多的有45門，最少的有30門(圖4)。檢測到的51個門中49個門有明確分類名稱信息，僅2個門沒有明確分類名稱信息。相對豐度最高的10個門所占比例總和達(dá)到94.09%(圖5)，前5個門分別是酸桿菌門(Acidobacteria)(28.82%)、變形菌門(Proteobacteria)(24.37%)、疣微菌門(Verrucomicrobia0)(18.76%)、浮霉菌門(Planctomycetes)(6.41%)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)(5.14%)。

圖3 120個土壤樣品的覆蓋率指數(shù)圖Fig.3 Coverage index graph of 120 soil samples

圖4 白云山120個土壤樣品中檢測到的不同分類水平上的細(xì)菌數(shù)量Fig.4 The number of bacteria at different classification levels detected in 120 soil samples of Baiyun mountain

圖5 細(xì)菌在門分類水平上的條形圖(豐度最高的10個門)Fig.5 Bar diagram of bacteria at the phylum level (the ten most abundant phylum)

2.2.2 綱 120個土壤樣品中平均有細(xì)菌124.7±11.87綱，其中單個樣品中最多的有144綱，最少的有93綱(圖4)。檢測到的173個綱中139個綱有明確分類名稱信息，34個綱沒有明確分類名稱信息。在139個有名稱信息的綱中，有50個綱在所有樣品中的相對豐度都大于等于0.5%。相對豐度最高的5個綱所占比例總和達(dá)到48.01%，分別是Spartobacteria (16.05%)、DA052(10.46%)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)(9.29%)、酸桿菌綱(Acidobacteria)(6.41%)和β-變形菌綱(Betaproteobacteria)(5.80%)(圖6)。

2.2.3 目 120個土壤樣品中平均有細(xì)菌223.02±25.00目，其中單個樣品中最多的有263目，最少的有151目(圖3)。檢測到的325個目中194個目有明確分類名稱信息，131個目沒有明確分類名稱信息。在194個有名稱信息的目中，有63個目在所有樣品中的相對豐度都大于等于0.5%。相對豐度最高的10個目所占比例總和達(dá)到57.99%(圖7)，分別是Chthoniobacterales(16.05%)、Ellin6513(10.46%)、酸桿菌目(Acidobacteriales)(6.41%)、硝化螺旋菌目(Nitrospirales)(5.14%)、根瘤菌目(Rhizobiales)(4.23 %)、Gemmatales(3.32%)、互營桿菌目(Syntrophobacterales)(3.29%)、iii1-15(3.24%)、Solibacterales(3.00%)和紅螺菌目(Rhodospirillales)(2.85%)。

圖6 細(xì)菌在綱分類水平上的柱形圖(豐度最高的10個綱)Fig.6 Bar diagram of bacteria at the class level (the ten most abundant class)

圖7 細(xì)菌在目分類水平上的餅圖Fig.7 Pie chart of bacteria at the order level

2.2.4 科 120個土壤樣品中平均有細(xì)菌319.13±35.59科，其中單個樣品中最多的有383科，最少的有219科(圖4)。檢測到的482個科中201個科有明確分類名稱信息，281個科沒有明確分類名稱信息。相對豐度最高的5個科所占比例總和達(dá)到39.61%，分別是Chthoniobacteraceae (16.05%)、Ellin6513目某科(10.46%)、Koribacteraceae(5.74%)、0319-6A21(4.09%)和互營桿菌科(Syntrophobacteraceae)(3.27 %)。

2.2.5 屬 120個土壤樣品中平均有細(xì)菌417.29±47.35屬，其中單個樣品中最多的有506屬，最少的有288屬(圖4)。檢測到的707個屬中267個屬有明確分類名稱信息，440個屬沒有明確分類名稱信息。相對豐度最高的5個屬所占比例總和達(dá)到37.09%，分別是DA101 (14.13%)、Ellin6513目某屬(10.46%)、Koribacteraceae科某屬 (5.14%)、0319-6A21科某屬(4.09%)和互營桿菌科某屬(3.27 %)。

2.3 細(xì)菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性

圖8為土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子的冗余分析(RDA)結(jié)果排序圖，第一主軸解釋了48.98%的細(xì)菌群落分布變異，第一主軸解釋了22%的細(xì)菌群落分布變異。其中土壤pH值、坡度(SL)、海拔(EL)、土壤N、P和含水量(WC)對細(xì)菌群落分布影響顯著，凹凸度(CC)和土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)對細(xì)菌群落分布影響不顯著(表1)。

圖8 土壤細(xì)菌群落分布與環(huán)境因子的冗余分析Fig.8 Redundancy analysis of soil bacterial community distribution and environmental factors

表1 細(xì)菌群落分布與環(huán)境因子之間的相關(guān)性Table 1 Correlation between bacterial community distribution and environmental factors

注：*相關(guān)性在0.05 水平上顯著；**相關(guān)性在0.01 水平上顯著。

Note: *means significant correlation at 0.05 level；**means significant correlation at 0.01 level.

3 結(jié)論與討論

土壤細(xì)菌通過和下層植物相互作用，促進(jìn)森林生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)交換和能量流動[30-31]。稀釋曲線結(jié)果顯示，本研究取樣合理。白云山土壤細(xì)菌在門和綱水平上的分類名稱信息明確，為后續(xù)更深入的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

土壤細(xì)菌群落組成在不同土壤樣中有一定差異，本研究檢測到的細(xì)菌類群為51門173綱325目482科707屬，其中酸桿菌門所占比例最多，其次為變形菌門，驗證了FIERER等[32]的觀點，即在溫帶森林中酸桿菌是土壤中含量最豐富的細(xì)菌類群。然而鄧嬌嬌等[33]通過研究溫帶土壤細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)得出變形菌門為豐度最高的門，趙愛花等[28]也發(fā)現(xiàn)變形菌門是落葉闊葉林土壤中相對豐度最高的門。已有研究表明，變形菌門的豐度隨著有機(jī)質(zhì)的增加而增加[34]，本研究中雖然沒有證明這一觀點，但是變形菌門的豐度僅次于酸桿菌門，是參與有機(jī)質(zhì)分解的主要細(xì)菌。酸桿菌門細(xì)菌多為嗜酸菌，酸桿菌門的相對豐度能夠表明土壤的酸性條件。

土壤pH值在土壤生物地球化學(xué)循環(huán)過程中起重要作用,是影響細(xì)菌分布的重要因子[7]。相關(guān)性分析表明土壤pH對細(xì)菌群落分布影響顯著。鄧嬌嬌等[33]通過研究也表明酸桿菌門細(xì)菌相對豐度與pH呈極顯著負(fù)相關(guān)。酸桿菌門是該樣地的優(yōu)勢菌群，結(jié)果顯示土壤pH對細(xì)菌分布影響最大。另外，坡度、海拔以及土壤N、P和含水量都顯著影響土壤細(xì)菌群落，這與劉洋等[2]的研究結(jié)果基本一致。土壤有機(jī)質(zhì)是驅(qū)動土壤微生物分布的主要原因。然而，在本研究中土壤有機(jī)質(zhì)對土壤細(xì)菌群落影響并不顯著，可能是由于整個樣地土壤中有機(jī)質(zhì)含量差異較小，才導(dǎo)致這樣的結(jié)果。