逯陣毫，王玉堂，李林，付光宇，吳學(xué)煒

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450016）

單純皰疹病毒（herpes simplex virus,HSV）是一類嚴(yán)重危害人類健康、引起皮膚病和性病的常見(jiàn)病原體，HSV 共有兩種亞型：HSV-1、HSV-2，HSV-2 主要是通過(guò)性傳播，對(duì)孕婦孕前篩查有重要的臨床意義［1］。臨床檢測(cè)HSV-2IgG 多采用的間接法反應(yīng)模式［2］，其特點(diǎn)是所用酶標(biāo)抗體為特異性動(dòng)物抗人IgG 抗體［3］。磁微?；瘜W(xué)發(fā)光平臺(tái)的反應(yīng)杯材質(zhì)多為聚丙烯，此材料表面疏水性較強(qiáng)［4］，容易與蛋白通過(guò)疏水作用力結(jié)合，導(dǎo)致蛋白吸附到反應(yīng)杯表面［5］，包括血漿中的免疫球蛋白［6］，最終導(dǎo)致酶標(biāo)記的二抗特異性結(jié)合反應(yīng)杯內(nèi)壁的抗體球蛋白，此時(shí)，反應(yīng)杯充當(dāng)了固相載體，導(dǎo)致最終檢測(cè)信號(hào)值異常偏高，出現(xiàn)假陽(yáng)性。有文獻(xiàn)報(bào)道，表面活性劑可起到抑制蛋白對(duì)界面的吸附作用［7］，本文利用非離子表面活性劑Triton X-100 可有效抑制吸附樣本的假陽(yáng)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

標(biāo)本來(lái)源于婦幼保健院2017 年8～10 月優(yōu)生優(yōu)育篩查血漿樣本，于-20℃冷凍保存，共15 份，復(fù)溶后狀態(tài)為黃色澄清液體。

1.2 試劑與儀器

某廠家單純皰疹病毒Ⅱ檢測(cè)試劑盒（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法）及其配套檢測(cè)儀器；Trinity 單純皰疹病毒Ⅱ檢測(cè)試劑盒［酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）］；Triton X-100 （分 子生物 學(xué)），Sigma-Aldrich；NaH2PO42H2O，分 析 純，國(guó) 藥 化 學(xué) 試 劑；Na2HPO412H2O，分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑。

1.3 方法

1.3.1 平臺(tái)對(duì)比 ELISA 法按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行主要步驟有：加樣、孵育、洗板、加酶、底物、顯色、比色。磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法為全自動(dòng)系統(tǒng)，設(shè)計(jì)好標(biāo)本位置、檢測(cè)項(xiàng)目，按開(kāi)始鍵即可。15 份標(biāo)本分別在兩平臺(tái)進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試前標(biāo)本均用生理鹽水（0.9%NaCl 溶液）稀釋30 倍。將平臺(tái)間測(cè)試結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)平臺(tái)間存在差異的樣本。

1.3.2 拆分實(shí)驗(yàn) 配置0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），用來(lái)替換試劑盒中磁微粒組分，試劑盒中其他組分不變，此組合標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組，正常未替換的試劑盒標(biāo)記為對(duì)照組，然后分別利用對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組試劑盒對(duì)15 份樣本進(jìn)行測(cè)試，將兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，重點(diǎn)關(guān)注平臺(tái)差異性標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果。見(jiàn)表1。

表1 拆分實(shí)驗(yàn)方案

1.3.3 添加Triton X-100 驗(yàn)證 配置0.5%Triton X-100 生理鹽水溶液，標(biāo)本按照1∶29 稀釋后，重復(fù)拆分實(shí)驗(yàn)的方法，比較兩組檢測(cè)結(jié)果。

1.3.4 結(jié)果判定 ELISA 平臺(tái)＞0.15 AU/mL 為陽(yáng)性，磁微粒化學(xué)發(fā)光平臺(tái)＞12 AU/mL 為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 平臺(tái)比對(duì)

15 例標(biāo)本分別在磁微粒和ELISA 平臺(tái)檢測(cè)，見(jiàn)表2。

表2 平臺(tái)比對(duì)結(jié)果 (AU/mL)

2.2 拆分實(shí)驗(yàn)

試劑盒中磁微粒組分替換為磷酸鹽緩沖液后，15 例標(biāo)本在磁微?；瘜W(xué)發(fā)光平臺(tái)檢測(cè)，拆分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 拆分實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (AU/mL)

2.3 生理鹽水添加Triton X-100

生理鹽水中添加0.5% Triton X-100 后，按照1∶29 稀釋15 例標(biāo)本，重復(fù)拆分實(shí)驗(yàn)步驟，添加Triton X-100 結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 生理鹽水添加Triton X-100 結(jié)果 （AU/mL）

3 討論

蛋白吸附現(xiàn)象普遍存在于自然界中，已有文獻(xiàn)專門報(bào)道蛋白吸附動(dòng)力學(xué)［7］，抑制蛋白在表面的吸附已成為熱門研究方向。磁微?；瘜W(xué)發(fā)光在應(yīng)用過(guò)程中存在多種干擾因素，免疫球蛋白吸附［8］已成為干擾測(cè)試結(jié)果的重要原因。磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法和ELISA 法都為間接免疫分析法，但由于ELISA 法板孔內(nèi)預(yù)包被了抗原，起到了封閉作用，所以標(biāo)本中的免疫球蛋白無(wú)法吸附到ELISA板上；而磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法中的反應(yīng)杯沒(méi)有經(jīng)過(guò)封閉劑封閉，所以很容易與免疫球蛋白非特異性結(jié)合，同時(shí)本文提到的拆分實(shí)驗(yàn)也排除了酶標(biāo)抗體直接吸附反應(yīng)杯表面的可能，最終與酶標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體特異性結(jié)合，可以簡(jiǎn)單地認(rèn)為是酶標(biāo)記的抗體通過(guò)免疫球蛋白間接固定在反應(yīng)杯表面上，導(dǎo)致的檢測(cè)結(jié)果異常。

標(biāo)本經(jīng)過(guò)含有表面活性劑的生理鹽水稀釋后，原本假陽(yáng)性的標(biāo)本結(jié)果變成了陰性，說(shuō)明加入的表面活性劑抑制了非特異性結(jié)合的數(shù)量，但同時(shí)也有文獻(xiàn)報(bào)道，并非所有的表面活性劑都可以有效的降低吸附的概率［9］，也并非在任何時(shí)間加入表面活性劑都可以抑制非特異性吸附，本文提到的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒酶結(jié)合物中證實(shí)含有Triton X-100，但結(jié)果表明非特異性吸附并未得到有效阻止，這或許與蛋白吸附的不可逆性有直接關(guān)系［10］。