陳奕昭，吳春林，賀慧穎

0 引言

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）是人類遺傳變異中最常見(jiàn)的一種，占所有已知基因多態(tài)性的90%以上。存在于編碼區(qū)及其緊鄰上下游序列的SNPs可能改變基因的表達(dá)水平和表達(dá)產(chǎn)物，從而使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，引起不同個(gè)體對(duì)環(huán)境因素的敏感度不同，對(duì)腫瘤等疾病也存在易感差異。在胃癌人群和健康對(duì)照人群中進(jìn)行SNPs對(duì)比研究，可以確定SNPs和（或）其鄰近變異與胃癌的關(guān)聯(lián)。

有研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions,EMT）密切相關(guān)。緊密連接結(jié)構(gòu)與功能的改變參與EMT過(guò)程，可調(diào)控腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[1-4]。Claudin蛋白是構(gòu)成緊密連接的骨架蛋白，也是緊密連接最主要的功能分子[5]，其編碼基因Claudin基因家族包括24個(gè)成員[6]。研究發(fā)現(xiàn)腸型胃癌的CLDN23基因下調(diào)[7]，可作為一種候選胃癌抑制基因，但其對(duì)胃癌的易感性及預(yù)后的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)應(yīng)用多重PCR-LDR方法檢測(cè)Claudin-23基因CLDN23的SNPs多態(tài)性在福建地區(qū)漢族人群原發(fā)性胃癌發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 資料與方法

1.1 CLDN23 SNPs多態(tài)性研究的對(duì)象

對(duì)照組：福建地區(qū)無(wú)血緣關(guān)系健康體檢者197例，其中男125例，女72例，中位年齡52歲，詢問(wèn)病史及健康體檢排除其他腫瘤病史，取外周血樣提取基因組DNA。病例組：福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1993—2007年間手術(shù)切除的原發(fā)性胃癌存檔蠟塊215例，其中男163例、女52例，中位年齡58歲，所有病例均經(jīng)病理證實(shí)。取非腫瘤性組織蠟塊提取基因組DNA。

按WHO腫瘤病理學(xué)及遺傳學(xué)分類（2010年消化系統(tǒng)腫瘤分冊(cè)）對(duì)所有病例進(jìn)行組織學(xué)分型及TNM分期。215例原發(fā)性胃癌中，早期胃癌（pT1）31例，進(jìn)展期胃癌184例。進(jìn)展期胃癌中高分化14例，中分化39例，低分化及未分化癌90例，黏液腺癌和印戒細(xì)胞癌41例；pT分期為T2者38例、T3者58例，T4者88例；區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者162例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移者22例。對(duì)上述病例進(jìn)行隨訪，獲回訪資料108例，其中死亡病例107例，存活病例1例，隨訪時(shí)間為1～78月。

1.2 試劑

總DNA抽提試劑盒TaKaRa DEXPATTM試劑（日本TaKaRa公司）；AxyPrep-96全血基因組DNA試劑盒（美國(guó)AXYGEN公司）；Qiagen HotStarTaq酶體系（酶5 u/μl，buffer，Q-solution,Mg2+等）（Qiagen德國(guó)生物技術(shù)有限公司）。

1.3 PCR引物及LDR探針合成

PCR引物及LDR探針合成由上海翼和生物應(yīng)用有限公司設(shè)計(jì)并合成。引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度及LDR探針見(jiàn)表1、表2。

表1 CLDN23 SNPs位點(diǎn)DNA片段的PCR引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Table 1 PCR prime sequence and fragment length of CLDN23 SNPs

1.4 CLDN23 SNPs多態(tài)性研究應(yīng)用PCR-LDR法

石蠟包埋組織基因組DNA和對(duì)照組全血基因組DNA的提取按DEXPATTM試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物的完整性。PCR擴(kuò)增SNP位點(diǎn)所在片段：95℃ 15 min，94℃ 30 s，59℃ 1 min，72℃1 min，72℃ 7 min，35個(gè)循環(huán)，3.0%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE電泳分析。PCR產(chǎn)物的連接酶檢測(cè)反應(yīng)（LDR）：取1 μl LDR連接產(chǎn)物與1 μl ABI GS-500 ROX熒光標(biāo)記分子和去離子甲酰胺上樣液混合，95℃加熱變性2 min，冰中驟冷，于5%聚丙烯酰胺和5 mol/L尿素中3000 V電泳2.5 h，應(yīng)用GENESCANTM672軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、泳道線校正、遷移片段大小測(cè)量和校正內(nèi)在分子量標(biāo)準(zhǔn)；應(yīng)用GeneMapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和基因分型。測(cè)序儀測(cè)序檢驗(yàn)PCR-LDR的結(jié)果。

表2 CLDN23 SNPs位點(diǎn)DNA片段的LDR探針序列及片段長(zhǎng)度Table 2 LDR probe sequence and fragment length of CLDN23 SNPs

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0軟件包，對(duì)胃癌病例組與健康對(duì)照組各等位基因頻率和基因型頻率差異及胃癌病例組各基因型分布與臨床病理因素差異作χ2及精確概率分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用SHEsis軟件包（http://analysis.bio-x.cn）進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)分析，P＞0.05為符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1 CLDN233個(gè)位點(diǎn)的SNP多態(tài)性在福建漢族人群中的分布

經(jīng)PCR-LDR檢測(cè)，197例中國(guó)福建地區(qū)漢族人群的CLDN23 rs12153、rs1060106和rs11249884的3個(gè)SNP位點(diǎn)，各等位基因頻率和基因型分布頻率見(jiàn)表3。CLDN23 rs12153位點(diǎn)為CC、CG和GG三種基因型，rs1060106位點(diǎn)為CC、CT和TT三種基因型，rs11249884位點(diǎn)為AA、AG和GG三種基因型。各位點(diǎn)SNP基因型經(jīng)PCR產(chǎn)物測(cè)序證實(shí)。

表3 CLDN233個(gè)SNPs位點(diǎn)的等位基因和基因型分布頻率Table 3 Frequencies of alleles and genotypes of CLDN23 SNP loci

2.2 CLDN23 SNP位點(diǎn)rs12153、rs1060106和rs11249884多態(tài)性及與胃癌遺傳易感性的關(guān)系

福建漢族人群中CLDN23 SNP位點(diǎn)rs12153、rs1060106及rs11249884的基因型及等位基因頻率在胃癌患者和健康者之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 CLDN23 SNP位點(diǎn)rs12153、rs1060106和rs11249884的基因型分布與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系

CLDN233個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型分布均與胃癌分化程度、pT分期顯著相關(guān)（均P＜0.01）；rs11249884基因型分布與胃癌臨床分期顯著相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表4；rs12153和rs1060106基因型分布均與胃癌臨床分期無(wú)顯著相關(guān)性（均P＞0.05）。3個(gè)位點(diǎn)的基因型分布與胃癌患者性別、年齡及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 CLDN23 SNP位點(diǎn)rs12153、rs1060106和rs11249884遺傳連鎖不平衡分析

表4 CLDN233個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型分布與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 4 Relation between genotypes distribution of three CLDN23 SNP loci and clinicopathological features of gastric cancer patients

rs12153、rs1060106和rs11249884位點(diǎn)相互鄰近。rs12153和rs1060106、rs12153和rs11249884遺傳連鎖不平衡分析結(jié)果分別為：D’=0.955、r2=0.907和D’=0.972、r2=0.864，兩個(gè)位點(diǎn)之間無(wú)明顯的遺傳連鎖不平衡性；rs1060106和rs11249884遺傳連鎖不平衡分析結(jié)果為：D’=0.967、r2=0.840，兩個(gè)位點(diǎn)之間無(wú)明顯遺傳連鎖不平衡性。

2.5 CLDN23基因SNP位點(diǎn)rs12153、rs1060106和rs11249884單體基因型分析

CLDN23 SNP位點(diǎn)rs12153、rs1060106和rs11249884組合的基因單體型有C-T-A、G-C-G、C-C-G、C-T-G、G-C-A、G-T-A和G-T-G 7種。結(jié)果顯示C-T-G單體型在胃癌病例組與健康對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)意義（χ2=15.691488,P＜0.001），見(jiàn)表5。

表5 CLDN23基因rs12153、rs1060106和rs11249884單體型分析Table 5 Haplotype distribution of CLDN23 SNP rs12153,rs1060106 and rs11249884

2.6 CLDN23 SNP位點(diǎn)rs12153、rs1060106和rs11249884多態(tài)性與胃癌術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系

將有完整隨訪資料的108例原發(fā)性胃癌患者的生存時(shí)間分別和rs12153、rs1060106 和rs11249884的各基因型分布及3個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)建的各單體基因型分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示rs12153位點(diǎn)CC基因型患者術(shù)后生存率高于CG基因型患者（P＜0.01）；而CC基因型患者與GG基因型患者之間、CG基因型患者與GG基因型患者之間術(shù)后生存率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1A。rs1060106位點(diǎn)TT基因型患者和CT基因型患者術(shù)后生存率均高于CC基因型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；而TT基因型患者與CT基因型患者之間術(shù)后生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1B。3個(gè)SNP位點(diǎn)中，只有rs11249884位點(diǎn)的基因型分布與臨床分期高度相關(guān)，而臨床分期可顯著影響生存率。進(jìn)一步分組統(tǒng)計(jì)顯示，無(wú)論是早期胃癌組還是進(jìn)展期胃癌組，rs11249884位點(diǎn)AA、AG與GG基因型患者之間術(shù)后生存率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)圖1C、D。另外，3個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建的GG-CC-GG、CG-CTAG、CC-TT-AA單體基因型患者術(shù)后生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

Claudin基因家族共24個(gè)成員，其序列的一致性為12.5%～69.7%，表明它們?cè)谶M(jìn)化上呈功能高度保守性。人類CLDN23基因位于8q23.1，包含有多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其編碼的蛋白質(zhì)含有292個(gè)氨基酸。位于編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)可能改變基因的表達(dá)水平和表達(dá)產(chǎn)物，從而使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，直接導(dǎo)致腫瘤的易感性。本研究通過(guò)檢測(cè)CLDN23基因3個(gè)外顯子SNP位點(diǎn)的多態(tài)性，探討其與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

對(duì)于Claudin基因多態(tài)性的研究，Liao等通過(guò)基因測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)CLDN10基因SNP位點(diǎn)的多態(tài)性與乳腺癌的患癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[8]；Perdomo-Ramirez等發(fā)現(xiàn)CLDN19基因的多態(tài)性與低鎂血癥相關(guān)[9]；而CLDN1基因SNP位點(diǎn)的多態(tài)性則與血管性癡呆及三陰性乳腺癌相關(guān)[10-11]。這些均提示Claudin基因的多態(tài)性可影響Claudin蛋白功能和表達(dá)，從而與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

本研究應(yīng)用PCR-LDR法檢測(cè)CLDN23基因3個(gè)SNP位點(diǎn)rs12153、rs1060106和rs11249884在原發(fā)性胃癌病例組和健康對(duì)照組中的基因型，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性與胃癌遺傳易感性無(wú)關(guān)，但與胃癌組織學(xué)分化程度、pT分期相關(guān)；rs12153、rs1060106的多態(tài)性與胃癌患者的預(yù)后有關(guān)；3個(gè)SNP位點(diǎn)之間無(wú)連鎖不平衡，且存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因單體型分布。

圖1 CLDN23基因3個(gè)SNPs位點(diǎn)各基因型胃癌患者的Kaplan-Meier生存曲線Figure 1 Kaplan-Meier survival curves of gastric carcinoma patients with different genotypes of CLDN23 SNP loci

緊密連接蛋白的表達(dá)異?；蛘呓Y(jié)構(gòu)功能異常是EMT過(guò)程中的關(guān)鍵，也是參與腺癌進(jìn)展的重要病理變化[12]。Claudin分子在維持緊密連接結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用[13]，其異常表達(dá)可以促進(jìn)癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲能力和生存[14-15]。如前所述，研究發(fā)現(xiàn)在腸型胃癌中CLDN23基因下調(diào)，可作為一種候選胃癌抑制基因。本研究結(jié)果也顯示，胃癌患者中CLDN23基因rs12153、rs1060106和rs11249884的多態(tài)性與組織學(xué)分化、pT分期有關(guān)，提示SNPs可能對(duì)Claudin-23的差異表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。CLDN23基因表達(dá)調(diào)節(jié)的機(jī)制鮮有報(bào)道，有研究顯示組蛋白甲基化水平，包括H3K27me3（H3 lysine 27 trimethylation）和H3K4me3（H3 lysine 4 trimethylation）的相互平衡是調(diào)節(jié)CLDN23基因表達(dá)的基礎(chǔ)；并且在大腸癌中EZH2（enhancer of zeste homolog 2）誘導(dǎo)下的H3K27me3過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致CLDN23基因表達(dá)下調(diào)[16]；此外轉(zhuǎn)錄因子Tcf7l2/Hnf4a可上調(diào)CLDN23的基因表達(dá)[17]。CLDN23的SNP是否通過(guò)上述分子發(fā)揮對(duì)其表達(dá)的調(diào)節(jié)作用還未知。

rs12153、rs1060106和rs11249884在CLDN23基因上鄰近，本研究發(fā)現(xiàn)C-T-G單體型在胃癌病例組與健康對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果提示C-T-G單體型與胃癌易感性相關(guān)，還需要更多的標(biāo)簽SNPs位點(diǎn)或擴(kuò)大樣本數(shù)量分析加以驗(yàn)證。有研究[18-19]認(rèn)為腫瘤相關(guān)基因中，包含某些SNP位點(diǎn)的單體型可影響該基因的轉(zhuǎn)錄，引起轉(zhuǎn)錄后蛋白的空間結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的改變，影響蛋白的功能，從而與腫瘤易感性相關(guān)。我們推測(cè)C-T-G單體型或影響CLDN23基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Claudin-23表達(dá)下調(diào)并引起細(xì)胞間緊密連接異常，與胃癌的發(fā)生相關(guān)。

胃癌發(fā)生發(fā)展是多基因綜合作用的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，CLDN23基因rs12153、rs1060106的多態(tài)性與胃癌術(shù)后生存率具有明顯相關(guān)性，這可能為評(píng)估胃癌患者的預(yù)后提供新的參考指標(biāo)。

綜上，我們首次研究了CLDN23基因SNPs位點(diǎn)多態(tài)性與中國(guó)人群胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，認(rèn)為CLDN23基因SNPs多態(tài)性可能與胃癌的進(jìn)展相關(guān)。盡管本研究病例組及對(duì)照組的基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，說(shuō)明選擇的樣本具有群體代表性，但樣本數(shù)量較小、選取位點(diǎn)數(shù)較少，未來(lái)研究需要增加樣本數(shù)量及SNP位點(diǎn)數(shù)，以得到更多CLDN23基因SNP多態(tài)性與胃癌之間關(guān)系的研究證據(jù)。