李春波，蘇 韞*，龔紅霞，薛 軒，李婷婷，牛世偉，聶 蓬

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000； 3.甘肅省武威腫瘤醫(yī)院 武威醫(yī)學(xué)科學(xué)院胃外科， 甘肅 武威 733000)

胃癌(gastric cancer)是消化道最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)分別居第5位和第3位[1]。炎性反應(yīng)被稱為腫瘤的十大特征之一[2]。長期的慢性炎性反應(yīng)可損傷胃黏膜，進(jìn)而發(fā)展成胃癌[3]。炎性細(xì)胞分泌的各種炎性因子通過不同途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移，因此抑制炎性反應(yīng)是防治胃癌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。白介素-17(interleukin-17,IL-17)是促炎的細(xì)胞因子，可引起核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路激活，引起下游效應(yīng)因子轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖，血管生成，參與機(jī)體的炎性反應(yīng)，促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。本研究擬通過實(shí)驗(yàn)，探討IL-17/NF-κB信號(hào)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象： 根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)收集并篩選2018年1月至2018年12月在甘肅省武威腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的30例胃癌患者及同期于本院進(jìn)行健康體檢的30名健康人,并收集血清。收集胃癌患者的胃癌組織、癌旁組織(距離癌組織5 cm)及遠(yuǎn)離胃癌組織的胃組織各(距離癌組織10 cm)30例。本研究經(jīng)武威腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批文號(hào)：WWZL-LL-2016-0001)。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理組織學(xué)確診的胃癌患者；病歷資料完整者；入選者依從性良好、自愿接受相關(guān)檢查及實(shí)驗(yàn)措施。并簽署書面知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：機(jī)體患有免疫系統(tǒng)疾病的患者；胃癌合并其他部位惡性腫瘤者；無法獲取完整資料的患者。

1.1.2 試劑及試劑盒： IL-17、IL-6、IL-8 ELISA試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司)；兔抗人IL-17、IKK-β、pNF-κB p65和IL-6抗體(GeneTex公司); 鼠抗人NF-κB p65抗體(Immunoway公司)；DAB顯色試劑盒和SP試劑盒(鏈霉卵白素-生物素法檢測(cè)系統(tǒng))(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 胃癌患者胃組織病理學(xué)觀察： 所有患者的組織標(biāo)本取材后，用10%甲醛溶液固定12～24 h，石蠟包埋，制備成4 μm厚的石蠟切片。胃組織切片常規(guī)脫蠟至水后，蘇木精伊紅(HE)染色封片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.2.2 ELISA檢測(cè)血清IL-17、IL-6和IL-8含量： 采集空腹靜脈血，分離血清，-80 ℃保存；用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中IL-17、IL-6和IL-8水平。操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)： 將石蠟切片常規(guī)脫蠟后清洗3次。3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min, PBS緩沖液清洗3次后進(jìn)行抗原修復(fù)，加入一抗，濕盒內(nèi)4 ℃過夜。清洗后加入二抗，37 ℃孵育30 min。DAB顯色，脫水封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察。鏡下順序放大200倍，隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行圖像采集。IL-17、IL-6、IKK-β和NF-κB p65蛋白表達(dá)陽性為胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。用Image J軟件分析平均吸光度(A)值=積分吸光度(A)/陽性目標(biāo)陽性面積(Area)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白： 提取組織蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〉攘康鞍走M(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，按照說明書使用要求加入一抗稀釋液，于4 ℃孵育過夜。TBST洗膜10 min×3次后，加入二抗稀釋液在室溫下?lián)u床孵育1.5 h，TBST洗膜10 min×3次后曝光。使用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行吸光度值計(jì)算，與內(nèi)參比較，分析相對(duì)蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 健康對(duì)照組與胃癌患者一般資料

健康人群與胃癌患者性別及年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 HE染色結(jié)果

正常胃組織上皮排列整齊，著色淺呈透明狀，上皮下陷形成胃小凹，皺襞完整；主細(xì)胞呈柱狀或椎體狀細(xì)胞質(zhì)染成淡藍(lán)色，細(xì)胞核呈卵圓形；壁細(xì)胞呈卵圓形或三角形，細(xì)胞質(zhì)染成紅色，細(xì)胞核呈橢圓形 (圖1A)。

癌旁組織中腺體大小形狀不規(guī)則，排列紊亂，上皮細(xì)胞變薄腺腔增大，伴腸上皮化生，出現(xiàn)杯狀細(xì)胞，有黏液分泌。有少量癌細(xì)胞的浸潤，核出現(xiàn)一定的異型性，間質(zhì)中有少量炎性細(xì)胞浸潤 (圖1B)。

胃癌組織腺腔大小不一，腺上皮層次多，排列紊亂；癌細(xì)胞異型性明顯，突破了黏膜肌層向間質(zhì)浸潤，排列紊亂呈不規(guī)則條索狀或巢狀，細(xì)胞核大小不一，病理性核分裂像多見，血管增多，細(xì)胞間質(zhì)見纖維增生及大量炎性細(xì)胞浸潤 (圖1C)。

2.3 ELISA檢測(cè)結(jié)果

與健康對(duì)照組相比，胃癌患者IL-17、IL-6、IL-8表達(dá)上升(P<0.05)(表1)。

表1 IL-17、IL-6、IL-8在各組中血清濃度

*P<0.05 compared with healthy control group.

2.4 免疫組化結(jié)果

與正常、癌旁組織相比，胃癌組織中IL-17和IKK-β陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，IL-6和NF-κB p65陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，為棕黃色或棕褐色顆粒見(圖2～圖5)。IL-17、NF-κB p65、IKK-β和IL-6在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于正常和癌旁組(P<0.05)(表2)。

2.5 Western blot檢測(cè)結(jié)果

與正常胃組織相比，胃癌組織中IL-17、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKK-β和IL-6表達(dá)增加(P<0.05)；癌旁組織中pNF-κB p65、IKK-β和IL-6表達(dá)增加(P<0.05)。與癌旁組織相比，胃癌組織中IL-17、NF-κB p65、pNF-κB p65、IKK-β和IL-6表達(dá)增加(P<0.05)(圖6，表3)。

圖1 正常組織(A)、癌旁組織(B)、胃癌組織(C)組織病理學(xué)變化

圖2 IL-17在正常組織(A)、癌旁組織(B)、胃癌組織(C)中的表達(dá)

圖3 IL-6在正常組織(A)、癌旁組織(B)、胃癌組織(C)中的表達(dá)

圖4 NF-κB p65在正常組織(A)、癌旁組織(B)、胃癌組織(C)中的表達(dá)

圖5 IKK-β 在正常組織(A)、癌旁組織(B)、胃癌組織(C)中的表達(dá)

表2 免疫組化檢測(cè)各組蛋白的表達(dá)

*P<0.05 compared with the normal group;▲P<0.05，comparison with the normal adjacent group.

圖6 IL-17、IL-6、NF-κB p65、pNF-κB p65和IKK-β在各組的表達(dá)

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是多種因素作用的結(jié)果[4]。慢性胃炎被認(rèn)為是胃癌的關(guān)鍵因素之一。近年來，隨著炎性反應(yīng)與腫瘤的深入研究，慢性胃炎的“炎-癌轉(zhuǎn)化”模式已成為研究的熱點(diǎn)[5-6]。因此有效地抑制慢性胃炎向胃癌的進(jìn)展是關(guān)鍵所在。

IL-17是由輔助性T細(xì)胞(Th17)特異性分泌的促炎細(xì)胞因子[7-8]，IL-17可誘導(dǎo)早期免疫介質(zhì)的分泌，使炎性反應(yīng)細(xì)胞聚集到損傷部位。當(dāng)發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，IL-17可與細(xì)胞表面的IL-17R特異性結(jié)合，激活I(lǐng)κB激酶，從而導(dǎo)致IκB蛋白磷酸化，泛素化降解，導(dǎo)致NF-κB二聚體釋放后通過各種翻譯后的修飾作用而被進(jìn)一步激活，進(jìn)入到細(xì)胞核中與目的基因結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用。持續(xù)的炎性反應(yīng)可使NF-κB的表達(dá)增加，激活NF-κB信號(hào)通路下游的效應(yīng)基因IL-6、IL-1、TNF-α、IL-8、COX-2、MMP-9和VEGF等表達(dá)增加[9-10]，參與機(jī)體炎性免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等病理過程，導(dǎo)致胃癌的發(fā)生發(fā)展。本研究選擇了IL-17活化的NF-κB信號(hào)通路中的幾個(gè)關(guān)鍵蛋白作為檢測(cè)指標(biāo)，旨在探索IL-17通過NF-κB信號(hào)通路參與胃癌發(fā)生發(fā)展的免疫調(diào)控機(jī)制。

IL-17在肺癌[11]、肝癌[12]和胃癌[13]中均有明顯表達(dá)，有研究表明，IL-17在胃癌組織中表達(dá)顯著增高[14]。也有研究[15]發(fā)現(xiàn)，胃癌患者外周血中IL-17水平顯著升高, 并且與患者臨床分期有關(guān)。提示，IL-17可能在胃癌發(fā)生發(fā)展的過程中起促進(jìn)的作用。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，不論是胃癌患者的血清中還是癌組織中的IL-17含量均明顯升高，這與報(bào)道的結(jié)果一致。本研究通過對(duì)胃癌患者組織中NF-κB相關(guān)通路蛋白NF-κB p65、pNF-κB p65、IKK-β、IL-6及血清IL-6的檢測(cè)結(jié)果表明，胃癌患者血清中IL-6表達(dá)上升，胃癌組織中NF-κB p65、pNF-κB p65、IKK-β和IL-6表達(dá)增加；癌旁組織中pNF-κB p65、IKK-β和IL-6表達(dá)增加。與正常癌旁組織相比，胃癌組織中IL-17、NF-κB p65、pNF-κB p65、IKK-β和IL-6表達(dá)增加。說明IL-17的含量增高，可激活NF-κB信號(hào)通路，使NF-κB表達(dá)量增加，引發(fā) NF-κB 信號(hào)通路下游的 IL-6表達(dá)增加，導(dǎo)致炎性反應(yīng)的擴(kuò)大及胃癌的發(fā)生與發(fā)展。

表3 IL-17、IL-6、IKK-β、NF-κB p65及p-NF-κB p65的表達(dá)

*P<0.05 compared with the normal group;▲P<0.05 comparison with the adjacent group.

IL-17可通過NF-κB信號(hào)通路刺激下游效應(yīng)因子發(fā)生轉(zhuǎn)錄，參與胃癌的免疫調(diào)控以及促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。因此，研究IL-17及其參與作用的相關(guān)信號(hào)通路在胃癌形成、進(jìn)展及預(yù)后中所起的作用是防治胃癌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，對(duì)胃癌的治療及預(yù)后均具有重要意義。