仇慧靜，沈維軍，朱 媚，宋 陽(yáng)

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 長(zhǎng)沙 410128)

反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究方法主要有體內(nèi)法、半體內(nèi)法和體外法。體內(nèi)法和半體內(nèi)法需要的活體動(dòng)物較多，試驗(yàn)結(jié)果容易受到動(dòng)物個(gè)體、飼養(yǎng)環(huán)境、動(dòng)物疾病等因素的影響，同時(shí)，試驗(yàn)還會(huì)對(duì)動(dòng)物健康造成傷害,因此在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究中經(jīng)常使用體外法代替體內(nèi)與半體內(nèi)法開(kāi)展研究。目前應(yīng)用比較成熟的就是瘤胃模擬技術(shù)，該技術(shù)又有批次培養(yǎng)法和連續(xù)培養(yǎng)法兩種。由于瘤胃模擬技術(shù)具有試驗(yàn)條件可控、重復(fù)性高、快速、重復(fù)數(shù)多等優(yōu)勢(shì)，在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的研究中廣泛應(yīng)用。因此，本文在查閱了大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，就瘤胃模擬技術(shù)在反芻動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定、飼料組合效應(yīng)評(píng)價(jià)、飼料添加劑瘤胃發(fā)酵特性等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 瘤胃模擬技術(shù)

1.1 批次培養(yǎng)法

批次培養(yǎng)法是一種短期的瘤胃模擬培養(yǎng)法，主要包括兩階段法和產(chǎn)氣法。兩階段法又稱為兩步法，由Tilly和Terry[1]于1963年在“一級(jí)離體消化法”的基礎(chǔ)上改進(jìn)后提出，是根據(jù)反芻動(dòng)物消化過(guò)程，先在離心管內(nèi)加入瘤胃液和發(fā)酵底物培養(yǎng)2 d，之后再用胃蛋白酶消化2 d，最后將殘?jiān)M(jìn)行分離，做后續(xù)的分析。兩步法可評(píng)定反芻動(dòng)物飼料消化率，但不能反映飼料降解的動(dòng)態(tài)信息，而且需通過(guò)大量體內(nèi)數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行校正。產(chǎn)氣法由德國(guó)霍恩海姆大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所Menke等[2]于1979年提出，其產(chǎn)氣裝置詳見(jiàn)圖1。主要原理是通過(guò)離體產(chǎn)氣裝置來(lái)模擬瘤胃發(fā)酵，飼料樣品與瘤胃液在體外共同培養(yǎng)，在固定的時(shí)間內(nèi)結(jié)束培養(yǎng)，觀察其動(dòng)態(tài)及總產(chǎn)氣量、揮發(fā)性脂肪酸、氨氮和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消失率等指標(biāo)。

批次培養(yǎng)法具有試驗(yàn)周期短、操作簡(jiǎn)便、成本低廉、一次測(cè)定的樣品數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，但其無(wú)法將除氣體外的發(fā)酵終產(chǎn)物排出，導(dǎo)致瘤胃微生物生存環(huán)境條件發(fā)生改變，進(jìn)而影響測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。并且其只能反映出飼料在短期內(nèi)靜態(tài)發(fā)酵降解的情況，而活體內(nèi)瘤胃發(fā)酵是一種連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程，既有發(fā)酵底物和唾液的連續(xù)進(jìn)入和飼料降解后食糜的連續(xù)排出，同時(shí)還伴有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收等主要問(wèn)題，因而在應(yīng)用上受到一定限制[3]。

圖1 Menke于1979年所設(shè)計(jì)的離體產(chǎn)氣裝置[2]Fig.1 In vitro gas production device designed by Menke in 1979[2]R:轉(zhuǎn)子；P:注射器；D:烘箱；M:電機(jī)； R:Rotor;P:Syringe;D:Oven;M:Motor

1.2 連續(xù)培養(yǎng)法

連續(xù)培養(yǎng)法又稱為長(zhǎng)期人工瘤胃模擬技術(shù)，它是利用體外發(fā)酵裝置模擬瘤胃，通過(guò)發(fā)酵底物和人工唾液動(dòng)態(tài)的流入、發(fā)酵產(chǎn)物連續(xù)排出來(lái)實(shí)現(xiàn)持續(xù)發(fā)酵的一種方法。根據(jù)發(fā)酵罐內(nèi)固相和液相外流是否一致而分為單外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)和雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)。雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)是單外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的改進(jìn)版。連續(xù)培養(yǎng)法能準(zhǔn)確地模擬瘤胃內(nèi)環(huán)境，具有穩(wěn)定性好、能實(shí)時(shí)觀察試驗(yàn)動(dòng)態(tài)信息的優(yōu)點(diǎn)[4]。迄今為止，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較多的連續(xù)培養(yǎng)瘤胃模擬系統(tǒng)主要有：Czerkawski等[5]1977年設(shè)計(jì)的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)，如圖2所示；新西蘭2008年公布的、Muetzel等[6]2009年改進(jìn)的自動(dòng)控制連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)；國(guó)內(nèi)主要有王加啟等[7]1993年設(shè)計(jì)的一種瘤胃持續(xù)模擬裝置；孟慶翔等[8]1999年設(shè)計(jì)的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)(continuous culture system，CCS)；伍夢(mèng)楠[4]2012年設(shè)計(jì)，并于2015年改進(jìn)的雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)，如圖3所示。目前，國(guó)內(nèi)外瘤胃模擬技術(shù)普遍采用剛性發(fā)酵罐與攪拌方法來(lái)模擬瘤胃發(fā)酵，雖然在一定程序上能夠模擬瘤胃的消化，但與活體動(dòng)物瘤胃的真實(shí)消化過(guò)程存在著較大的差距。故伍夢(mèng)楠[4]試圖在瘤胃蠕動(dòng)的幾何與運(yùn)動(dòng)學(xué)理論模型的基礎(chǔ)上，探討瘤胃蠕動(dòng)過(guò)程中瘤胃內(nèi)容物動(dòng)力學(xué)與運(yùn)動(dòng)學(xué)規(guī)律，試圖構(gòu)建柔性瘤胃模擬裝置，增加氣體檢測(cè)系統(tǒng)，并開(kāi)展穩(wěn)定性、重復(fù)性等方面的試驗(yàn)研究，使其更具有現(xiàn)實(shí)意義。

圖2 Czerkawski等1977年設(shè)計(jì)的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)[5]Fig.2 Continuous culture system designed by Czerkawski in 1977[5](a)長(zhǎng)期人工瘤胃的個(gè)單位示意圖。S:不銹鋼傳動(dòng)軸;V:取樣閥;G:密封套;F:法蘭;R:主反應(yīng)容器;L:瘤胃液;C:多孔飼料容器;N:尼龍紗布袋;T:剛性管;I:人工唾液入口;O:溢流管;M:氣體收集管;E:溢流瓶；(b)長(zhǎng)期瘤胃模擬裝置驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)示意圖。S:曲軸;M:電機(jī);B:軸承;C:曲柄;N:尼龍導(dǎo)軌;R:往復(fù)桿(a)Schematic diagram of one unit of the long-term artificial rumen. S:Stainless steel driving shaft;V:Sampling valve;G:Gland (gas-tight);F:Flange;R:Main reaction vessel;L:Rumen fluid;C:Perforated food container;N:Nylon gauze bag;T:Rigid tube;I:Inlet of artificial saliva;O:Outlet through overflow;M:Line to gas-collec-tion bag;E:Vessel for collection of effluent；(b)Schematic diagram of the driving mechanism for the long-term rumen simulation apparatus.S:Crank shaft;M:Electric motor;B:Bearings;C:Crank;N:Nylon guides;R:Reciprocating rods;H:Bar with attachmeats to stainless-steel shafts in reaction vessels

圖3 伍夢(mèng)楠2015年設(shè)計(jì)的雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)[4]Fig.3 Double outflow continuous culture system designed by WU Mengnan in 2015[4]A:主控模塊;B:單片機(jī);C:pH傳感器;D:溫度傳感器;E:發(fā)酵罐;F:排固裝置;G:注射泵;H:緩沖液瓶;I:液位傳感器; J:排液閥;K:氣體流量計(jì);L:甲烷和二氧化碳檢測(cè)儀;M、N、O、P、Q:電磁閥A:Main control module;B:Single chip microcomputer;C:pH sensor;D:Temperature sensor;E：Fermentor;F:Solid discharge device;G:Injection pump;H:Buffer bottle;I:Liquid level sensor;J:Drain valve;K:Gas flowmeter;L:Methane and carbon dioxide detector;M、N、O、P、Q:Solenoid valves

2 瘤胃模擬技術(shù)在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究中的應(yīng)用

2.1 產(chǎn)氣法的應(yīng)用

2.1.1 單一飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定

瘤胃內(nèi)微生物在消耗碳水化合物和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)會(huì)產(chǎn)生甲烷、氫氣、二氧化碳等氣體，故可通過(guò)檢測(cè)飼料樣品在體外發(fā)酵所產(chǎn)生的氣體來(lái)估計(jì)有機(jī)物消化率[5]。因此，在一定時(shí)間內(nèi)，檢測(cè)累計(jì)產(chǎn)氣量可估計(jì)底物被瘤胃微生物利用的程度，進(jìn)而反映出飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高低。產(chǎn)氣法具有一次性樣本量大、快速的優(yōu)點(diǎn)，大大地提高了飼料評(píng)定效率，如中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)研制的自動(dòng)氣體記錄系統(tǒng)(automated gas recording system,AGRS)[9]和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶生態(tài)研究所研制的體外產(chǎn)氣系統(tǒng)[10]，至少配置48個(gè)發(fā)酵瓶，72 h可完成一次產(chǎn)氣試驗(yàn)。而美國(guó)ANKOM公司所研發(fā)的體外產(chǎn)氣系統(tǒng)[11]可根據(jù)需要自由配置發(fā)酵瓶的數(shù)量。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者常利用產(chǎn)氣法對(duì)單一飼料資源營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行評(píng)定，其主要應(yīng)用有糧食加工副產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定，如大豆皮、菜粕[12,13]；經(jīng)濟(jì)作物副產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定，如豆腐渣[12，14，15]、桑樹(shù)葉[16-20]等；非常規(guī)飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定，如干番茄皮渣[21]；新型飼料資源的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定，如紅麻[22]。以上評(píng)定結(jié)果表明，不同單一飼料資源各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)產(chǎn)氣量差異較大，且隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的增加，累計(jì)產(chǎn)氣量呈遞增的趨勢(shì)。進(jìn)而根據(jù)培養(yǎng)期間各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)產(chǎn)氣量及累計(jì)產(chǎn)氣量，再通過(guò)測(cè)定飼料養(yǎng)分的消失率來(lái)評(píng)定飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.1.2 飼料間組合效應(yīng)的評(píng)價(jià)

飼料間組合效應(yīng)(associative effective，AE)是指來(lái)自不同飼料來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)間互作的整體效應(yīng)。體外產(chǎn)氣量能反映飼料養(yǎng)分消化率，但如果只是單純的利用體外產(chǎn)氣量來(lái)衡量飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，就有可能會(huì)把產(chǎn)氣量低而微生物蛋白(microbial protein，MCP)產(chǎn)量高的組合淘汰掉,這顯然是不合理的。只有通過(guò)同時(shí)測(cè)定體外產(chǎn)氣速率和產(chǎn)氣量，綜合能量消化和蛋白質(zhì)合成兩方面的信息，才有可能較全面準(zhǔn)確地評(píng)估飼料間的互作效應(yīng)[23]。目前，體外產(chǎn)氣法在評(píng)價(jià)不同種類飼料間AE研究較多，其主要應(yīng)用有：不同粗飼料組合研究，如玉米秸稈與南洋櫻組合[24]、全株玉米青貯與谷草組合[25]、稻草和苜蓿組合[26]、甜高粱和紫花苜蓿組合[27]、全株玉米青貯-花生藤和羊草組合[28]、玉米青貯和稻草[29]；不同粗精料組合研究，如油菜稈+玉米豆粕組合[30]、青貯大米草與玉米和豆粕組合[31]、辣木枝+玉米+豆粕組合[32]。這些試驗(yàn)均利用體外產(chǎn)氣法，研究不同飼料以不同比例組合對(duì)體外產(chǎn)氣及人工瘤胃發(fā)酵特性的影響，探究了飼料間的適宜搭配比例，為反芻動(dòng)物飼糧的配制和提高秸稈利用率提供了科學(xué)依據(jù)。為更好地利用和節(jié)約飼料資源，體外產(chǎn)氣法可以作為不同日糧間組合效應(yīng)的一種快速評(píng)價(jià)方法。

2.1.3 飼料添加劑

飼料添加劑雖然具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、保證動(dòng)物健康和節(jié)省飼料成本等作用，但飼料添加劑種類繁多，如植物性飼料添加劑、維生素和微量元素等，如果全部采用動(dòng)物活體開(kāi)展劑量與效果研究，則存在試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量多、難度大、成本高等問(wèn)題，因而采用體外發(fā)酵產(chǎn)氣法可快速實(shí)現(xiàn)飼料添加劑劑量與效果的篩選，為動(dòng)物活體試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支撐。現(xiàn)今，研究主要包含以下幾個(gè)方面。1)植物性飼料添加劑對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響：黃酮類植物性飼料添加劑，如柿子皮[33]、石榴皮[34]、葡萄籽提取物[35]；皂苷類植物性飼料添加劑，如綠茶提取物[35]、苦瓜皂苷[36]、常春藤果實(shí)提取物[37，38]、蒺藜皂苷[39]、紅藻提取物[40]、冬凌草皂苷[41]等；揮發(fā)性油類，如牛至油[42]、百里香油[43-45]、大蒜油[46]、柑橘精油[47]等。以上體外產(chǎn)氣法研究結(jié)果均表明，植物提取物可調(diào)控體外發(fā)酵、有效抑制甲烷產(chǎn)生并能提高養(yǎng)分體外發(fā)酵的消失率。2)維生素對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響：維生素B[48]、維生素C[49]、維生素E[48,50]、維生素A[51-53]。以上研究結(jié)果顯示：體外條件下，維生素的添加水平與體外發(fā)酵參數(shù)息息相關(guān)，在高精料日糧下，發(fā)酵瓶中維生素的微生物凈合成量降低，極易發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒，添加水溶性維生素能提高發(fā)酵瓶中pH值、降低乳酸濃度以及調(diào)節(jié)微生物菌群結(jié)構(gòu)來(lái)緩解亞急性瘤胃酸中毒；在低精料日糧下，可以不添加維生素，而添加脂溶性維生素對(duì)奶牛瘤胃體外發(fā)酵的影響較小。3)微量元素對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響：錳[54]、碘[55]、銅[56]等。以上研究學(xué)者均通過(guò)體外瘤胃發(fā)酵技術(shù)發(fā)現(xiàn)，日糧中微量元素含量的升高使乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、總揮發(fā)性脂肪酸的含量都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并給出了生長(zhǎng)期牦牛日糧中微量元素添加的推薦劑量。由于動(dòng)物個(gè)體差異以及動(dòng)物體內(nèi)微生物的多樣性，其生物學(xué)活性及其作用機(jī)制也不盡一致，且體外發(fā)酵產(chǎn)氣試驗(yàn)都是短期效應(yīng)，不能夠完全代表在動(dòng)物生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用效果，因此還需進(jìn)一步開(kāi)展活體試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2 連續(xù)培養(yǎng)瘤胃模擬技術(shù)的應(yīng)用

2.2.1 瘤胃微生物的研究

反芻動(dòng)物的瘤胃發(fā)酵主要依靠瘤胃微生物對(duì)飼料物質(zhì)進(jìn)行降解，瘤胃微生物種類繁多、數(shù)量巨大，包括原蟲(chóng)(主要為纖毛蟲(chóng))、細(xì)菌及部分厭氧真菌。連續(xù)培養(yǎng)法可以通過(guò)觀察雙外流培養(yǎng)系統(tǒng)中微生物群落變化、動(dòng)態(tài)規(guī)律以及發(fā)酵參數(shù)來(lái)得出影響微生物發(fā)酵的因素。此方面的應(yīng)用研究主要有以下幾個(gè)方面。1)稀釋率水平對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響：在體外培養(yǎng)的開(kāi)始幾天，原蟲(chóng)和真菌總數(shù)下降，之后維持一個(gè)相對(duì)恒定的平穩(wěn)階段。原因可能是較高的稀釋率會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵罐內(nèi)的內(nèi)容物流出較快，大量原蟲(chóng)和真菌被快速帶出發(fā)酵罐，當(dāng)稀釋率大到高于原蟲(chóng)和真菌的生長(zhǎng)速度時(shí)，數(shù)量就會(huì)迅速下降，而且稀釋率增大會(huì)導(dǎo)致氨態(tài)氮(NH3-N)濃度和揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)濃度降低，所以在體外發(fā)酵條件下，較低的稀釋率更利于原蟲(chóng)和真菌的繁殖及生長(zhǎng)[57,58]。2)日糧精粗比對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響：隨著發(fā)酵罐中日糧精粗比的提高，原蟲(chóng)總數(shù)以及VFA濃度隨之升高，但真菌數(shù)量隨精料比例提高明顯下降，NH3-N濃度差異不顯著；提高精粗比對(duì)VFA的濃度沒(méi)有明顯改變，說(shuō)明提高精粗比明顯改變了發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵類型，且體外試驗(yàn)的結(jié)果呈現(xiàn)出與體內(nèi)相一致的變化趨勢(shì)[57,58]。3)pH值對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響：瘤胃內(nèi)一些細(xì)菌(如牛鏈球菌)在高pH時(shí)能將淀粉發(fā)酵成乙酸鹽、甲酸鹽和乙醇，但在低pH下丙酮酸甲酸裂解酶被抑制，發(fā)酵變成乳酸[59]。以上結(jié)果均應(yīng)用長(zhǎng)期培養(yǎng)法，這表明不同稀釋率、精粗比、pH與瘤胃內(nèi)微生物的數(shù)量均存在一定關(guān)系，但由于研究目的不同，所應(yīng)用的設(shè)備也不盡相同，從而導(dǎo)致不同設(shè)備間試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有可比性。因此，有必要開(kāi)展標(biāo)準(zhǔn)的體外連續(xù)培養(yǎng)裝置研究，以期為體外模擬技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

2.2.2 飼料添加劑

采用體外發(fā)酵產(chǎn)氣法研究飼料添加劑的應(yīng)用效果存在著短期效應(yīng)，不能較好地反映長(zhǎng)期應(yīng)用效果，故連續(xù)培養(yǎng)法成為了除動(dòng)物活體試驗(yàn)以外的主要研究方法[71]。其研究主要分為以下幾個(gè)方面：1)揮發(fā)油類對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響，如薺藍(lán)籽[60]、亞麻籽[61,62]、黑籽油[63]和橄欖油[64]等。揮發(fā)油類作為植物提取物中最重要的活性成分之一，具有抑菌、抗氧化等功能。以上研究均表明植物揮發(fā)油有顯著降低甲烷產(chǎn)量的作用。2)糖類對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響，如蔗糖[65]、低聚木糖[66]等。在動(dòng)物飼料中添加蔗糖可以改變微生物種群，氨氮濃度呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，添加低聚木糖在24 h時(shí)對(duì)干物質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的降解率均呈現(xiàn)出顯著增加的趨勢(shì)，但在48 h時(shí)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解率沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響。3)酶類對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響，如纖維素酶[67]。長(zhǎng)期發(fā)酵法驗(yàn)證了外源的纖維分解酶可以促進(jìn)瘤胃微生物的附著，從而加快纖維在體內(nèi)的消化速度。而且該酶類制品可以借助瘤胃微生物來(lái)加以利用。4)植物類對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響，如紅豆草和石榴皮提取物[68]、愛(ài)沙木[69]、海藻[70]等。

綜上所述，通過(guò)長(zhǎng)期發(fā)酵法可以看出，不同種類的飼料添加劑其應(yīng)用的效果各不相同。而且，瘤胃微生物對(duì)不同類型飼料添加劑需要有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程，這種過(guò)程對(duì)開(kāi)發(fā)新型產(chǎn)品作為飼料添加劑的長(zhǎng)效效應(yīng)是一個(gè)挑戰(zhàn)。

2.2.3 過(guò)瘤胃產(chǎn)品

在早期的體內(nèi)試驗(yàn)中，過(guò)瘤胃保護(hù)產(chǎn)品的對(duì)象主要以飼料原料為主，如玉米[72]、豆粕和豆餅[73]等。隨著研究的不斷深入，關(guān)于過(guò)瘤胃產(chǎn)品的研究方向也從飼料原料轉(zhuǎn)換為單一的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸[74]、脂肪[75]和維生素[76]等。而過(guò)瘤胃技術(shù)(主要是包被技術(shù))是處理這些營(yíng)養(yǎng)素的特殊方法，根據(jù)包被材料的不同，可將過(guò)瘤胃包被技術(shù)分為蛋白質(zhì)包被法、脂肪包被法、聚合物包被法等[77]。但目前存在包被產(chǎn)品的有效利用率較低，包被材料價(jià)格昂貴以及種類較少等問(wèn)題。為初步解決此類難題，研究者用長(zhǎng)期培養(yǎng)法研究了不同包被技術(shù)的過(guò)瘤胃氨基酸對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響及其應(yīng)用效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)噴霧冷卻技術(shù)物理包被的過(guò)瘤胃蛋氨酸，對(duì)奶牛瘤胃體外發(fā)酵沒(méi)有顯著影響，但可在一定程度上提高奶牛乳蛋白率、乳脂率和日糧粗蛋白質(zhì)的消化率[78];并且,各類包被形式的氨基酸在雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的釋放率與瘤胃內(nèi)釋放率之間存在高度正相關(guān)性[79]。還有學(xué)者應(yīng)用瘤胃尼龍袋法和雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)檢驗(yàn)過(guò)瘤胃氨基酸在瘤胃中的穩(wěn)定性，得出不同形式保護(hù)性氨基酸在雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中的降解趨勢(shì)與在瘤胃中的降解趨勢(shì)相似，且應(yīng)用雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)測(cè)定不同時(shí)間段過(guò)瘤胃氨基酸的釋放率比較簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，與瘤胃尼龍袋法相比，不同時(shí)間段的釋放率均存在強(qiáng)相關(guān)[80]。從以上各結(jié)果可看出，連續(xù)培養(yǎng)法更適合做篩選氨基酸保護(hù)方法的研究，并為開(kāi)發(fā)更加低廉、安全、有效的包被材料以及驗(yàn)證被包被產(chǎn)品在體內(nèi)的有效利用率，提供了理論基礎(chǔ)。

3 瘤胃模擬系統(tǒng)的不足與改進(jìn)

3.1 試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定性

各瘤胃模擬裝置的運(yùn)行參數(shù)不盡相同，造成試驗(yàn)結(jié)果變異系數(shù)較大。經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵罐內(nèi)總揮發(fā)性脂肪酸的濃度遠(yuǎn)低于動(dòng)物瘤胃內(nèi)的濃度，且原蟲(chóng)的數(shù)量也會(huì)隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而急劇下降，甚至部分發(fā)酵裝置中原蟲(chóng)的數(shù)量會(huì)完全消失。此外，出現(xiàn)了有機(jī)物以及中性洗滌纖維的消化率也比動(dòng)物瘤胃內(nèi)的消化率低等結(jié)果。因此，可通過(guò)形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，來(lái)避免運(yùn)行參數(shù)不一致導(dǎo)致的試驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定性。

3.2 不能有效模擬動(dòng)物瘤胃內(nèi)蠕動(dòng)規(guī)律

目前，國(guó)內(nèi)外的瘤胃模擬裝置均采用玻璃、有機(jī)玻璃或不銹鋼制作的剛性發(fā)酵罐來(lái)模擬動(dòng)物瘤胃，如王加啟等[7]和孟慶翔[8]采用有機(jī)玻璃發(fā)酵罐，Teather等[81]采用玻璃發(fā)酵罐，伍夢(mèng)楠[4]采用不銹鋼發(fā)酵罐。這些瘤胃模擬裝置雖在一定程度上能夠模擬瘤胃的蠕動(dòng)和消化，但與活體動(dòng)物瘤胃的蠕動(dòng)規(guī)律仍然存在著較大的差距。因此，可以嘗試用柔性發(fā)酵罐來(lái)代替硬性發(fā)酵罐，摸索出更符合瘤胃蠕動(dòng)規(guī)律的攪拌方式，以達(dá)到更接近動(dòng)物活體瘤胃內(nèi)環(huán)境的目的。但目前在反芻動(dòng)物瘤胃體外重構(gòu)領(lǐng)域和柔性人工瘤胃開(kāi)發(fā)研究方面還鮮有人關(guān)注，因此，可利用三維重建及有限元法更深入地對(duì)山羊瘤胃進(jìn)行體外重構(gòu)研究，為柔性人工瘤胃的開(kāi)發(fā)研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3.3 發(fā)酵罐內(nèi)底物積聚

在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，需要不斷地向發(fā)酵罐加入發(fā)酵底物來(lái)模擬動(dòng)物的采食行為，同時(shí)要快速地將底物浸入發(fā)酵罐內(nèi)容物中，并與之均勻混合。然而，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)底物積聚且不能盡快排出，從而造成罐內(nèi)出現(xiàn)堵塞的情況，目前還沒(méi)有得到合理的解決方案。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，人工瘤胃技術(shù)可以有效模擬瘤胃發(fā)酵，是研究反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)微生物學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等較為理想的模型，可廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外反芻動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定、不同飼料組合效應(yīng)評(píng)價(jià)、飼料添加劑瘤胃發(fā)酵特性評(píng)定以及瘤胃微生物的研究。批次培養(yǎng)法具有試驗(yàn)周期短、操作簡(jiǎn)便、成本低廉以及一次測(cè)定的樣品數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用涉及廣泛。目前，關(guān)于短期發(fā)酵所開(kāi)展的研究多集中于植物提取物、新型飼料資源和新型藥品在瘤胃中的降解情況，并可對(duì)其劑量以及效果進(jìn)行快速篩選，但仍需大量活體試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。長(zhǎng)期發(fā)酵人工瘤胃能更加真實(shí)地模擬瘤胃發(fā)酵特征，應(yīng)用于動(dòng)物難以操作的領(lǐng)域，開(kāi)展的研究多集中在非常規(guī)添加劑等對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響。但單純利用長(zhǎng)期發(fā)酵人工瘤胃來(lái)評(píng)定飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究比較少見(jiàn)，而且，長(zhǎng)期發(fā)酵人工瘤胃還可多用作于研究反芻動(dòng)物瘤胃生理學(xué)、發(fā)酵生物化學(xué)等機(jī)理研究，也可用于部分特殊飼料的評(píng)價(jià)，為動(dòng)物活體試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支撐，以此對(duì)今后在實(shí)際研究中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。但人工瘤胃技術(shù)現(xiàn)存在運(yùn)行參數(shù)不一致所導(dǎo)致的試驗(yàn)不穩(wěn)定性問(wèn)題，不能有效模擬動(dòng)物瘤胃內(nèi)蠕動(dòng)規(guī)律以及發(fā)酵罐內(nèi)底物積聚等問(wèn)題，還需做進(jìn)一步深入研究。