陳婷如， 林燕萍， 謝青軒， 藍(lán)銀濤， 邱 婷， 向 湘， 王俐梅， 張 建*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系， 廣州 511436；2.廣東省生物資源應(yīng)用研究所藥物非臨床評價研究中心， 廣州 510260)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的核心目標(biāo)是解決由于疾病、創(chuàng)傷、衰老或遺傳等因素造成的組織器官缺損及功能障礙。再生醫(yī)學(xué)的出現(xiàn)給組織器官的修復(fù)再生和功能重建帶來了希望，是人類醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一次巨大飛躍[1-3]。設(shè)想如果人類有能力將再生醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)無縫銜接，絕大多數(shù)疾病就能治愈，社會老齡化將不再是人類的噩夢，人們就可實現(xiàn)長壽之夢。因此，對再生醫(yī)學(xué)的研究與探討已經(jīng)成為一個重大且熱門的世界醫(yī)學(xué)科學(xué)問題。在再生醫(yī)學(xué)相關(guān)研究中，動物模型發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4-6]。以骨缺損和骨質(zhì)疏松為代表的骨疾病造成的活動失能極大地影響人的生活質(zhì)量，更為嚴(yán)重的是，隨著老齡化的到來，這些骨病的發(fā)病率日益增高，延緩和治療骨疾病目前已經(jīng)成為醫(yī)藥領(lǐng)域科研工作全力解決的問題[7-9]。近年來，斑馬魚已成為一種熱門的脊椎動物模型，被大量地應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、發(fā)育學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥物學(xué)、遺傳學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)及心理學(xué)等學(xué)科方面的研究[10-12]，特別是在再生醫(yī)學(xué)研究方面。與哺乳動物相比，斑馬魚具有繁殖能力強(qiáng)、體外受精、體外發(fā)育、生長發(fā)育快、體型小、胚胎及幼體透明且易于飼養(yǎng)等獨(dú)特優(yōu)勢。更重要的是，斑馬魚基因與人類基因有高達(dá)87%的相似度，且在組織器官發(fā)育起源及發(fā)育過程等方面都具有較高的同源性，因此斑馬魚模型逐漸成為公認(rèn)的一種人類疾病動物模型[13-15]。早在1980年人們就開始用斑馬魚進(jìn)行骨骼特征的研究，且斑馬魚作為骨骼研究模式生物已被得到廣泛的認(rèn)可[16]。目前，國內(nèi)外研究團(tuán)隊紛紛開展以斑馬魚為動物模型的骨疾病研究，并深入對多基因的復(fù)雜性骨疾病的病理機(jī)制和高通量藥物篩選進(jìn)行更細(xì)致的探究。

就目前而言，對斑馬魚骨骼的研究多使用阿辛藍(lán)與茜素紅復(fù)合染色等有創(chuàng)的表征方法，然而這些方法不但繁瑣、耗時、耗材、耗力，更致命的是限制了許多科學(xué)研究進(jìn)程，尤其在再生醫(yī)學(xué)研究方面[17,18]。相關(guān)研究亟需一種可以實現(xiàn)活體動態(tài)觀察骨骼發(fā)育與骨骼疾病發(fā)生發(fā)展的技術(shù)方法。光學(xué)相干層析成像(optical coherence tomography，OCT)是一種可進(jìn)行非接觸式、非侵入性斷層成像的新型光學(xué)成像技術(shù)[19-21]，由于其利用了獨(dú)特的近紅外光散射成像原理，OCT成像深度遠(yuǎn)高于共聚焦顯微鏡和光片顯微鏡為代表的熒光成像技術(shù)。我們前期的研究表明，在透明度較高的瓊脂樣品中，1 325 nm波長的OCT系統(tǒng)具有高達(dá)約7 mm的三維成像能力，且不需要進(jìn)行熒光標(biāo)記[22]?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，我們構(gòu)建了斑馬魚顱骨損傷再生模型，并利用OCT技術(shù)對該模型的顱骨損傷及顱骨再生過程進(jìn)行活體、無損、動態(tài)成像，同時采用病理染色技術(shù)驗證OCT成像結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

本研究選取了13條野生型斑馬魚，其中3條斑馬魚作為正常組，10條斑馬魚作為顱骨缺損自然恢復(fù)組，分別編號并置于不同容器中培養(yǎng)。斑馬魚飼養(yǎng)環(huán)境為(28±0.5)℃的水體，給予的光照周期為14 h光照和10 h黑暗。

1.2 儀器

本研究采用的是頻域光學(xué)相干層析系統(tǒng)。頻域OCT系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示。本OCT系統(tǒng)的光源是一個中心波長為840 nm、光譜帶寬為40 nm以上的超輻射發(fā)光二極管(InPhenix, 美國)。試驗采用一個焦長為 40 mm的掃描物鏡(大恒光電，中國)，每毫米1 200條刻線的全息光柵(wasatch photonics,美國)和2 048像素的線陣相機(jī)(凌云光電，中國)，用光纖耦合器將寬帶光纖耦合成為50/50的干涉儀。經(jīng)過測量，本系統(tǒng)軸向分辨率約為8 μm，橫向分辨率約為12 μm，該系統(tǒng)對透明物體的成像深度可以達(dá)到4 mm左右，對肌肉等組織的成像深度可達(dá)2 mm左右[23,24]。本系統(tǒng)采用的掃描陣鏡(大族激光，中國)能以18 kHz/s的高成像速度快速采集信息，控制程序是基于C#編寫的，運(yùn)行在臺式計算機(jī)(戴爾,中國)上，該臺計算機(jī)還負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的存儲和后期處理。

圖1 光學(xué)相干層析成像系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of optical coherence tomography system

1.3 試劑配制

配制質(zhì)量濃度為0.01 g/mL的瓊脂溶液：稱取1 g的瓊脂粉(廣州環(huán)凱微生物科技公司)加入到100 mL的蒸餾水中，充分?jǐn)嚢杌靹颍訜嶂镰傊弁耆芙?，倒入玻璃培養(yǎng)皿中，冷卻后形成瓊脂塊，用于固定被麻醉的斑馬魚。

配制質(zhì)量濃度為0.01%的Tricaine溶液(麻醉劑)：Tricaine(西格瑪，A5040，美國)粉末以0.4%質(zhì)量體積比溶于Holtfreter緩沖液中，即為25×儲備液，麻醉過程使用1×(0.01%)的稀釋溶液。

1.4 斑馬魚顱骨損傷再生模型的構(gòu)建

在顱骨缺損造模方面，本研究采用的是一套自行研制的斑馬魚腦部立體定位儀。如圖2a、2b所示，定位儀使用光學(xué)精密滑臺作為運(yùn)動框架，斑馬魚的夾持和電動鉆機(jī)的固定部分均使用3D打印方法進(jìn)行制造。電動鉆機(jī)端可在YZ軸運(yùn)動，夾魚臺端可在XR軸作旋轉(zhuǎn)運(yùn)動，構(gòu)成4軸的斑馬魚腦部定位儀。直流電機(jī)和精密鉆夾裝配使鉆頭的運(yùn)動具有很高的同心度。鉆頭如圖2c、2d所示，直徑為200 μm，材質(zhì)為鎢鋼，保證了其鋒利程度和硬度,且不會隨著使用時間增加而降低。

顱骨損傷斑馬魚操作如下：首先，將斑馬魚用質(zhì)量濃度為0.01%的Tricaine溶液麻醉，再把斑馬魚腦部固定在定位儀上，然后，用同一鉆頭、相同轉(zhuǎn)速(2 000 r/min)對斑馬魚顱骨進(jìn)行開孔操作。基于精確的立體定位裝置，顱骨創(chuàng)傷位置能保持較好的一致性。

1.5 顱骨缺損斑馬魚模型的自然恢復(fù)

開孔造模成功后，自然恢復(fù)組斑馬魚置于常規(guī)飼養(yǎng)水環(huán)境中，水更換周期約為2 d。試驗期間，給予斑馬魚適宜的進(jìn)食量，保持自然恢復(fù)組所有魚的進(jìn)食量一致，以排除進(jìn)食量差異影響顱骨損傷再生速度。

1.6 OCT活體成像斑馬魚顱骨

首先，將已麻醉的斑馬魚用瓊脂塊固定，然后，把斑馬魚放置于OCT系統(tǒng)下，對斑馬魚顱骨損傷前后進(jìn)行OCT活體成像。按試驗設(shè)計方案對骨缺損的斑馬魚顱骨再生情況進(jìn)行活體監(jiān)測，從而獲得顱骨修復(fù)情況的實時數(shù)據(jù)。

圖2 斑馬魚腦部立體定位儀Fig.2 Zebrafish stereotactic apparatus(a)裝置俯視圖；(b)裝置側(cè)視圖；(c)鉆頭照片；(d)鉆頭直徑(a)Vertical view of the equipment;(b)Lateral view of the equipment;(c)Photograph of drill;(d)Diameter of the drill

1.7 病理切片試驗

用冰浴法處死斑馬魚后將其放入Bouin氏液中固定，樣品固定24 h后再置于流水中沖洗24 h。隨后，將經(jīng)過流水沖洗處理的斑馬魚樣品按照標(biāo)準(zhǔn)操作包埋成蠟塊，將包埋好的蠟塊固定于旋轉(zhuǎn)切片機(jī)(Leica，RM 2245，德國)上，切成薄片，厚度為4 μm。染色前將切片放入60 ℃恒溫箱中烤2 h，再用H&E染色標(biāo)準(zhǔn)操作處理切片。最后,利用數(shù)字病理玻片掃描儀(Leica，CS2，德國)對染色后的病理切片進(jìn)行圖像采集。

1.8 測量和統(tǒng)計方法

本研究中顱骨缺損的直徑是使用專業(yè)軟件MATLAB 6.0在OCT圖像上測量獲取，進(jìn)一步使用專業(yè)軟件Originpro-8對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，每一個成像時間點(diǎn)處骨缺損直徑的數(shù)據(jù)都被用于分析斑馬魚顱骨恢復(fù)再生趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 顱骨缺損模型建立過程中斑馬魚行為學(xué)表現(xiàn)

鉆孔試驗完成后，立即將鉆孔導(dǎo)致的顱骨缺損斑馬魚轉(zhuǎn)移到水中，所有斑馬魚模型都在造模后30 s內(nèi)自行蘇醒，然后轉(zhuǎn)移到各自的飼養(yǎng)器中?；谡０唏R魚的OCT結(jié)果和精密的斑馬魚腦定位儀，本研究可以保證鉆孔操作不傷及腦組織。因此，顱骨缺損造模后的斑馬魚都沒有死亡，與正常組相比，顱骨損傷的斑馬魚游動無異常、活力無下降。

2.2 斑馬魚顱骨缺損前后的OCT活體成像結(jié)果及病理試驗結(jié)果

正常斑馬魚顱骨的OCT圖像如圖3a所示，該圖為頭部的冠狀面截圖。圖上可以清晰地看到綠色的虛線箭頭標(biāo)記的連續(xù)帶狀結(jié)構(gòu)，即為斑馬魚顱骨位置。由于骨質(zhì)的高光散射特性，因此表現(xiàn)為較高的信號強(qiáng)度。覆蓋顱骨的是一層較軟的皮質(zhì)，與哺乳動物相似，斑馬魚的皮質(zhì)隨著年齡的增大會顯著增厚?；贠CT圖像結(jié)果可知，3月齡斑馬魚皮質(zhì)厚度約為300 μm，顱骨厚度約為100 μm，這兩個數(shù)據(jù)為顱骨損傷試驗提供了指導(dǎo)。圖3b為對應(yīng)區(qū)域的病理切片結(jié)果，可見顱骨的厚度與OCT圖像結(jié)果吻合得較好。由于制作病理切片過程中的脫水不可避免地會導(dǎo)致部分軟組織萎縮，導(dǎo)致病理結(jié)果中皮質(zhì)的厚度小于OCT圖像中的厚度。圖3c為斑馬魚顱骨損傷后的OCT活體成像，這個結(jié)果清晰地顯示了損傷的位置，見綠色橢圓形虛線標(biāo)記。進(jìn)一步觀察可發(fā)現(xiàn)，由于鉆頭的貫穿動作，皮質(zhì)和顱骨產(chǎn)生了分離間隙，有低密度的液體狀物質(zhì)填充。圖3d為對應(yīng)位置的病理切片，損傷的位置、大小都與OCT結(jié)果吻合，同時還顯示損傷區(qū)域有外溢血液填充，見藍(lán)色矩形虛線標(biāo)記的區(qū)域。

圖3 斑馬魚顱骨損傷前后的OCT圖像與對應(yīng)的病理切片F(xiàn)ig.3 OCT images of zebrafish skulls before and after injury as well as corresponding histological results(a)顱骨損傷前OCT圖；(b)顱骨損傷前病理結(jié)果；(c)顱骨損傷后OCT圖；(d)顱骨損傷后病理結(jié)果。綠色虛線箭頭表示顱骨，綠色虛線圓圈表示顱骨缺損位置，藍(lán)色的虛線矩形標(biāo)記了開孔之后導(dǎo)致的血液滲漏(a)OCT image of normal skull;(b)Histological result of normal skull;(c)OCT image of injured skull;(d)Histological result of injured skull. The green dotted arrow indicates the skull, the green dotted circle shows that the location of the skull defect, and the blue dotted rectangle marks the blood leakage caused by the opening

2.3 OCT活體連續(xù)監(jiān)測斑馬魚顱骨損傷后自然恢復(fù)過程

基于OCT技術(shù)無損傷、分辨率高和成像深度大的優(yōu)點(diǎn)，我們進(jìn)一步開展了斑馬魚顱骨損傷后再生過程的活體監(jiān)控和評估性研究。OCT系統(tǒng)可以實時動態(tài)地觀察到，模型組斑馬魚顱骨從兩端相距甚遠(yuǎn)逐漸恢復(fù)到幾近愈合狀態(tài)，斑馬魚顱骨損傷后自然恢復(fù)過程的代表性O(shè)CT結(jié)果如圖4所示。圖4a顯示的是顱骨缺損的初始階段，綠色虛線標(biāo)注的是顱骨缺損的位置，經(jīng)測量缺損直徑均約為218 μm，藍(lán)色箭頭標(biāo)注的是開孔之后導(dǎo)致的血液滲漏。從圖4b中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過2 d的恢復(fù)，顱骨的皮質(zhì)層已經(jīng)有明顯的恢復(fù)，然而顱骨處的外溢血仍然存在，顱骨缺損的直徑約為233 μm，有變大的趨勢。接下來的第5、9和11 天的OCT結(jié)果顯示，皮質(zhì)已經(jīng)完全恢復(fù)，顱骨的缺損也顯著減小，外溢血的圖像強(qiáng)度在圖4c所示的第5天達(dá)到了最大值，但隨后面積逐漸減小。到損傷后的14 d時，如圖4f所示，顱骨缺損基本恢復(fù)，剩余缺口直徑約為103 μm，外溢血完全消失，皮質(zhì)完全恢復(fù)。

圖4 OCT活體監(jiān)控斑馬魚顱骨損傷后的自然恢復(fù)過程Fig.4 OCT in vivo monitoring the natural recovery process of zebrafish skull after injury(a)顱骨損傷時；(b)損傷后2 d；(c)損傷后5 d；(d)損傷后9 d；(e)損傷后11 d；(f)損傷后14 d。綠色虛線標(biāo)注的是顱骨缺損的位置，藍(lán)色箭頭標(biāo)注的是開孔之后導(dǎo)致的血液滲漏(a)0 day;(b)2 days after injury;(c)5 days after injury;(d)9 days after injury;(e)11 days after injury;(f)14 days after injury. The green dotted line indicates the location of the skull defect, and the blue arrow shows the blood leakage caused by the opening

2.4 顱骨缺損自然修復(fù)21 d后的活體OCT和病理切片染色評估

顱骨損傷后修復(fù)是成骨細(xì)胞擴(kuò)增和新骨架形成的過程，然而，現(xiàn)有成像技術(shù)由于存在分辨率低或成像深度不足等問題，難以實現(xiàn)這一過程的活體可視化。我們進(jìn)一步對21 d自然恢復(fù)的顱骨缺損斑馬魚進(jìn)行了活體OCT，成像結(jié)果如圖5所示。圖5a展示了大尺度的斑馬魚頭部OCT結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)骨缺損的直徑進(jìn)一步減小，約為63 μm。圖5b對應(yīng)的是病理切片結(jié)果，與OCT結(jié)果吻合較好。我們進(jìn)一步把OCT圖像和病理圖像中的損失修復(fù)區(qū)域放大，如圖5c、5d所示。可以清晰地發(fā)現(xiàn)，在骨損傷修復(fù)區(qū)域的邊界上有顯著的橋連狀結(jié)構(gòu)，圖中用藍(lán)色箭頭標(biāo)注，病理切片的結(jié)果顯而易見也存在這種結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果較好地反映了斑馬魚作為骨缺損模型的可行性以及OCT評估斑馬魚顱骨缺損模型的準(zhǔn)確性。

2.5 定量分析斑馬魚顱骨缺損自然恢復(fù)效果

定量的數(shù)據(jù)更加有助于評價疾病模型和藥物療效，因此，我們從自然恢復(fù)組的每一個時間點(diǎn)的OCT圖像中將顱骨缺損直徑進(jìn)行了測量，然后作圖分析，結(jié)果如圖6所示。自然恢復(fù)的顱骨缺損會在開始2 d的時候有變大的趨勢，隨后就逐漸變小?？梢杂^察到，斑馬魚在21 d內(nèi)就已經(jīng)能夠修復(fù)再生長度約為115 μm的骨組織。因此，我們根據(jù)數(shù)據(jù)分析，可以推測出斑馬魚的修復(fù)速率呈拋物線改變，顱骨損傷修復(fù)速率由慢到快后變慢，且機(jī)械性損傷后2周左右為修復(fù)期的巔峰。

圖5 顱骨損傷斑馬魚修復(fù)21 d后的OCT圖與其病理切片圖Fig.5 OCT and pathological results of the injured skull of zebrafish after 21 days(a)斑馬魚頭部OCT圖像；(b)斑馬魚頭部病理切片圖；(c)放大的損傷區(qū)域OCT圖像；(d)放大的損傷區(qū)域病理切片圖。綠色虛線圓圈表示損傷修復(fù)區(qū)域的位置，藍(lán)色箭頭表示放大后損傷修復(fù)的位置(a)OCT image of zebrafish head;(b)Histological image of zebrafish head;(c)Enlarged OCT image of the defect lesion;(d)Enlarged histological image of the defect lesion. The green dotted circle indicates the location of the damage repair area, and the blue arrow shows the location of damage repair after magnification

圖6 定量分析斑馬魚顱骨損傷修復(fù)過程Fig.6 Quantitative analysis of the repair process of skull injury in zebrafish

3 討論

斑馬魚與多數(shù)高等脊椎動物一樣，也存在軟骨內(nèi)骨化和膜內(nèi)骨化2種骨化方式[25]。其中，斑馬魚大部分的頭部骨骼是由軟骨內(nèi)骨化發(fā)育產(chǎn)生的，且骨缺損愈合也是通過此方式[26]。斑馬魚骨骼發(fā)育過程和調(diào)控機(jī)制與哺乳動物一樣高度保守，所以基于斑馬魚骨骼模型的研究對于人類疾病的探討和研究具有重大價值與意義。目前，各個學(xué)科已成功構(gòu)建了各自需要的斑馬魚骨骼疾病模型，特別是在骨骼再生能力方面的研究上。再生醫(yī)學(xué)是當(dāng)今科學(xué)研究的前沿和熱點(diǎn)，在世界范圍內(nèi)的發(fā)展日新月異，已成為最具轉(zhuǎn)化前景的研究領(lǐng)域之一，并極大地促進(jìn)了其它相關(guān)領(lǐng)域共同邁進(jìn)。為了應(yīng)對我國骨骼疾病診治的巨大需求，我們利用斑馬魚作為骨骼再生模型積極地開展骨骼再生的研究。目前，研究斑馬魚骨骼模型的方法有經(jīng)典的骨骼染色和醫(yī)學(xué)上的影像學(xué)檢測等手段。但現(xiàn)存的方法都存在自身的局限性，染色法極其繁瑣，耗時耗力。其他影像技術(shù)有些存在輻射損傷，有些只能對幼魚進(jìn)行成像，存在成魚成像受限等問題。

本研究利用OCT相干成像技術(shù)對斑馬魚顱骨損傷模型的再生過程進(jìn)行活體監(jiān)測。由于光學(xué)特征是生物組織的重要物理參數(shù)，而OCT以無創(chuàng)的高分辨率揭示生物組織的光散射特征，具有無損和無標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)。本課題組的前期研究證實了OCT相干成像技術(shù)能夠有效地穿透成年斑馬魚的顱骨，對完整的大腦進(jìn)行三維成像[27]。為了獲得斑馬魚顱骨的高分辨率圖像，本研究采用了基于840 nm的近紅外光的OCT系統(tǒng)進(jìn)行試驗，并結(jié)合病理切片H&E染色結(jié)果，最后獲得的OCT結(jié)果與病理結(jié)果完全吻合。由此可證實，OCT技術(shù)在骨骼方面的監(jiān)測完全具有可靠性。然而在成年斑馬魚的顱骨損傷再生過程的監(jiān)測中，我們發(fā)現(xiàn)斑馬魚顱骨修復(fù)在早期不明顯，甚至存在損傷區(qū)增大的現(xiàn)象，大概于2周左右出現(xiàn)明顯修復(fù)，后期再次出現(xiàn)修復(fù)緩慢的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象的發(fā)生是否與骨細(xì)胞的死亡及巨噬細(xì)胞的吞噬有關(guān)尚未清楚，在細(xì)胞生物學(xué)上具有一定的研究價值。而OCT技術(shù)的實時性、安全性和可靠性也決定了其在骨骼研究方面具有廣闊的應(yīng)用前景，特別是在重大惡性疾病的演化過程研究方面具有明顯的研究優(yōu)勢。

本論文介紹了一種基于自行研制的斑馬魚腦立體定位系統(tǒng)構(gòu)建成年斑馬魚顱骨損傷模型的方法以及一種基于OCT技術(shù)從活體水平動態(tài)觀測斑馬魚骨損傷再生的策略。結(jié)果表明，斑馬魚的顱骨損傷后可以在較短的時間內(nèi)再生，建模方式簡單，模型成功率高。且OCT技術(shù)能夠精準(zhǔn)地活體評估骨骼再生過程，獲得的OCT圖像質(zhì)量可以與病理結(jié)果相媲美。綜上所述，本論文開發(fā)的模型和OCT評估策略有較好的參考價值，有潛力推進(jìn)骨疾病相關(guān)研究取得更大進(jìn)展。