唐詩琦，劉小玲，林 瑩，白聰豪，符 珍

(廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004)

辣木(Moringa)又稱“鼓槌樹”，原產(chǎn)于熱帶和南亞熱帶地區(qū)的印度北部[1]。19世紀末，我國云南省已經(jīng)引入種植辣木[2]。目前開發(fā)利用最多的是印度傳統(tǒng)辣木[3]，對其研究主要集中在動物飼料、凈水功能、化妝品添加劑、功能性食品、食用油等[4-6]。

辣木籽作為辣木相關(guān)衍生產(chǎn)物，其營養(yǎng)成分極其豐富，含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、礦物元素和膳食纖維[7-8]，被譽為“植物鉆石”。在東南亞國家，辣木籽作為民間傳統(tǒng)藥物用于預防和治療多種疾病，如心腦血管疾病、胃潰瘍和糖尿病等[9-11]。目前對辣木籽的研究多為醫(yī)學臨床應用[12]、辣木籽多糖的提取[13]、水酶法和甲醇法提取辣木籽中的油脂和蛋白質(zhì)[14]、辣木籽蛋白質(zhì)對水濁度的影響等[15-17]，但對分離提取辣木籽蛋白質(zhì)相關(guān)研究較少。段瓊芬等人[18]研究表明，辣木籽蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)高達37%，與大豆蛋白質(zhì)含量相接近，辣木籽蛋白質(zhì)提取利用范圍極大，常采用鹽溶提取法和水酶法對辣木籽蛋白質(zhì)進行提取研究[19-20]，但這2種提取方法對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及性質(zhì)影響較大，蛋白質(zhì)極易變性。

較現(xiàn)有提取辣木籽蛋白質(zhì)方法相比，本試驗采用超聲波輔助堿法提取辣木籽蛋白質(zhì),并采用響應面法對提取工藝優(yōu)化，降低蛋白質(zhì)變性程度；將提取的辣木籽粗蛋白質(zhì)進行初步純化，采用SDS-PAGE電泳技術(shù)分析其分子量分布范圍，以期為辣木籽蛋白質(zhì)的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣木籽,市售，粉碎后過80目篩；牛血清蛋白,BIOFROX公司；鹽酸體積分數(shù)36%～38%，優(yōu)級純；考馬斯亮藍G-250、氫氧化鈉、冰醋酸等,均為國產(chǎn)分析純。

722N可見分光光度計,上海儀電科學儀器股份有限公司；JAC-300N型數(shù)控超聲波清洗儀,山東省濟寧市奧波超聲電氣有限公司；SKD-2000凱氏定氮儀,上海沛歐分析儀器有限公司；SZF-06A脂肪測定儀,上海新嘉電子有限公司；CR21N高速冷凍離心機,日本Himac公司；FD-1D-50冷凍干燥機,北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；041BR95359電泳儀,BIO RAD公司；ChemiDoc MP System化學發(fā)光熒光成像系統(tǒng),BIO RAD公司；L-8900高速全自動氨基酸分析儀,日本Hitachi公司。

1.2 試驗方法

1.2.1基本成分的測定

測定辣木籽水分、蛋白質(zhì)、脂肪、黃酮和灰分。水分按照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中直接干燥法測定；蛋白質(zhì)按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法測定；脂肪按照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中索氏抽提法測定；黃酮按照NY/T 1295—2007《蕎麥及其制品中總黃酮含量的測定》測定；灰分按照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》中質(zhì)量法測定。

1.2.2牛血清蛋白標準曲線的制備

采用Bradford[21]的方法進行蛋白質(zhì)定量。取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 ml，濃度為0.1 mg/ml的蛋白質(zhì)標準溶液并補至1.00 ml，加入5.00 ml考馬斯亮藍。在波長為595 nm處測定吸光度值，繪制標準曲線。線性回歸方程y=3.649 1x+0.016，R2=0.996 1，線性關(guān)系較好。

1.2.3辣木籽蛋白質(zhì)提取工藝流程

新鮮辣木籽→粉碎→過篩(80目)→正己烷脫脂→晾干→脫脂辣木籽→提取→離心(8 000 r/min，4℃，20 min)→取上清液→二次提取→離心(8 000 r/min，4℃，15 min)→取上清液→合并2次粗提液→等電點沉淀→離心(8 000 r/min，4℃，15 min)→取沉淀，透析→冷凍干燥→辣木籽蛋白粉。

1.2.4辣木籽蛋白質(zhì)提取率的測定

采用1.2.2節(jié)中Bradford的方法，精密移取0.02 ml辣木籽蛋白質(zhì)提取液于試管中，補至1.00 ml，加入5.00 ml考馬斯亮藍溶液，于波長595 nm下測定吸光度值。由所測得的蛋白質(zhì)標準曲線計算辣木籽蛋白質(zhì)含量，其中蛋白質(zhì)總含量采用1.2.1節(jié)中凱氏定氮法測定脫脂后辣木籽蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為55.24%，根據(jù)公式(1)計算辣木籽蛋白質(zhì)提取率。

(1)

1.2.5單因素試驗

每組單因素試驗分別稱取2.00 g脫脂辣木籽粉末，并采用相同方法重復提取2次?？疾旃桃罕取H值、提取時間、提取溫度和超聲功率5個因素對辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響，并選擇最佳因素水平進行響應面試驗。

1.2.6響應面法優(yōu)化試驗

以提取辣木籽蛋白的單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，影響辣木籽蛋白質(zhì)提取率較大的pH值、提取時間、提取溫度、超聲功率為試驗因素，辣木籽蛋白質(zhì)提取率為響應值，建立四因素三水平以Box-Benhnken為原理的中心組合試驗。響應面法試驗因素水平編碼見表1。

表1 響應面法試驗因素水平編碼表

1.2.7辣木籽蛋白質(zhì)等電點測定

在辣木籽蛋白質(zhì)提取工藝最佳條件情況下測定辣木籽蛋白質(zhì)等電點。pH值處于蛋白質(zhì)等電點時，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀，其溶解度達到最低點并保持天然構(gòu)象[22]。取辣木籽蛋白質(zhì)粗提液25 ml，將粗提液pH值分別調(diào)至2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8，靜置2.0 h，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min、溫度4℃ 離心15 min，取上清液。采用1.2.4節(jié)中Bradford的方法測量上清液吸光度值，計算上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)，同時以空白試劑為參照。

將等電點沉淀后的蛋白質(zhì)粗提液離心，棄上清液，取沉淀透析36 h，將透析液冷凍干燥，得到辣木籽蛋白粉。辣木籽蛋白質(zhì)沉淀率根據(jù)公式(2)計算。其辣木籽蛋白純度按照1.2.1中凱氏定氮法測量。

(2)

1.2.8SDS-PAGE電泳

取適量辣木籽蛋白粉加入一定比例的尿素和5倍樣品緩沖液，使用12%分離膠和5%濃縮膠，Marker上樣量為5 μl，辣木籽蛋白上樣量為10 μl，濃縮膠和分離膠電壓分別為80 V和120 V。電泳結(jié)束后取出凝膠片，考馬斯亮藍G-250染色液染色1.0 h，脫色至條帶清晰后使用熒光成像系統(tǒng)對凝膠片圖像采集成像[23]。

1.2.9氨基酸組分測定及計算分析

取300 mg脫脂辣木籽粉末加入10.00 ml 6 mol/L HCl于水解管中冷凍10 min，取出后于110℃烘箱中水解22 h。水解完畢取出冷卻，過濾定容至50 ml。取1.00 ml濾液移入100 ml燒杯中，于60℃水浴蒸發(fā)干燥，加水1.00 ml重復干燥3次至酸揮發(fā)完全。加入0.02 mol/L HCl沖洗并定容至10 ml，以0.22 μm水系濾膜過濾至進樣瓶中待測。檢測樣品進樣量為20 μl，儀器運行壓力30 kPa，氮氣壓力0.06～0.1 MPa。樣品中的氨基酸含量依照標準GB 5009.124—2016計算。

1.3 試驗數(shù)據(jù)處理

以上試驗均重復測量3次，以保證試驗值的精確度。試驗分析采用統(tǒng)計分析軟件Design-expert8.0對數(shù)據(jù)進行響應面分析，SPSS20.0進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木籽基本組成成分分析

辣木籽基本成分如表2所示，其中辣木籽蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為35.48%±0.16%。常鑫[24]測得我國70種大豆蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為34.46%～45.13%，平均值為40.17%，李若姝等人[25]測得我國黑龍江和吉林兩省53種大豆蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)平均值為40.57%。由此可知，辣木籽蛋白質(zhì)含量較高，與大豆蛋白質(zhì)含量相接近，有極大的研究價值。

表2 辣木籽基本成分含量

2.2 單因素試驗

2.2.1固液比對辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響

在提取溫度45℃，提取時間45 min，pH 8.5，超聲功率180 W，固液比分別在1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35的條件下提取辣木籽蛋白，結(jié)果如圖1所示。固液比1∶15～1∶35時辣木籽蛋白質(zhì)提取率隨溶劑量的增大呈先增大后減小趨勢，并且在固液比為1∶25時蛋白質(zhì)提取率達到最大值42.92%±0.9%。這是因為當溶劑較少時，辣木籽與溶劑接觸面積較小結(jié)合不充分，辣木籽蛋白質(zhì)不能充分溶出[26]。固液比在1∶20～1∶30時無顯著性差異，均在42%左右，為了減小后續(xù)分離純化的不便，選擇1∶25作為辣木籽蛋白質(zhì)提取的最佳固液比，并且不作為響應面優(yōu)化試驗的條件因素之一。

圖1 固液比對辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.2pH值對辣木籽蛋白提取率的影響

在固液比1∶25，提取溫度45℃，提取時間45 min，超聲功率180 W，pH值分別在6、7、8、9、10的條件下提取辣木籽蛋白質(zhì)，結(jié)果如圖2所示。pH值在6.0～10.0時，辣木籽蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，且當pH值為8.0時提取率最高為43.34%±0.76%。隨著pH值的增大，反應體系中蛋白質(zhì)分子攜帶的同種符號的凈電荷增加并相互排斥，阻止了單個分子的聚集，因此溶解度增大[27]。但過高的pH值會影響辣木籽蛋白質(zhì)聚集，促進發(fā)生美拉德反應[28]，并且pH值的變化使蛋白質(zhì)提取率波動范圍較大。綜上所述，選擇最佳提取pH 8.0，以有效的提取辣木籽蛋白質(zhì)。

圖2 pH值對辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.3提取時間對辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響

在固液比1∶25，提取溫度45℃，pH 8.5，超聲功率180 W，提取時間分別在25、30、35、40、45、50、55 min的條件下提取辣木籽蛋白質(zhì)，結(jié)果如圖3所示。提取時間在25～45 min時，辣木籽蛋白質(zhì)提取率隨著超聲時間增大而增大，增加趨勢較陡；提取時間在45～55 min時，辣木籽蛋白質(zhì)提取率隨著超聲時間增大而減小，降低趨勢較緩慢。若提取時間較短，辣木籽與溶劑沒有進行充分接觸，辣木籽細胞破裂程度較小，導致辣木籽蛋白質(zhì)不能充分溶出。提取時間過長會破壞維持辣木籽蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力[29]，使原來已析出的蛋白質(zhì)分子與結(jié)合的水分子分離，最終導致蛋白質(zhì)含量降低。

圖3 提取時間對辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.4提取溫度對辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響

在固液比1∶25，提取時間45 min，pH 8.5，超聲功率180 W，提取溫度分別在35、40、45、50、55℃的條件下提取辣木籽蛋白質(zhì)，結(jié)果如圖4所示。提取溫度對辣木籽蛋白質(zhì)提取率影響較提取時間小，蛋白質(zhì)提取率波動范圍在40%～45%。辣木籽蛋白質(zhì)提取率隨著提取溫度的升高先上升后下降。這是因為隨著溫度的逐步升高，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得以伸展，在適宜溫度下可有效的提取辣木籽蛋白質(zhì)。但溫度過高會破壞蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，使辣木籽蛋白質(zhì)變性，改變其營養(yǎng)特性，降低辣木籽蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值[30]。顯著性差異分析表明組間存在顯著性差異，綜合考慮選擇45℃為最佳提取溫度。

圖4 提取溫度對辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.5超聲功率對辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響

在固液比1∶25，提取溫度45℃，提取時間45 min，pH 8.5，超聲功率分別為60、120、180、240、300W的條件下提取辣木籽蛋白質(zhì)，結(jié)果如圖5所示。隨著超聲功率的增大，辣木籽蛋白質(zhì)提取率先上升后下降，超聲功率在120 W時蛋白質(zhì)提取率時為45.35%±0.88%。超聲功率為60～120 W時提取率明顯上升，因為超聲波能夠影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和周圍基團分布，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，并且超聲波能產(chǎn)生空化效應，增強辣木籽蛋白質(zhì)間的能量傳遞，增加析出蛋白質(zhì)濃度[31]。在120～300 W時提取率下降，這是因為隨著超聲功率增大，部分蛋白質(zhì)分子能量傳遞成倍增大，相互作用力增大，導致空間結(jié)構(gòu)被破壞，提取率降低。

圖5 提取功率對辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響

2.3 響應面法試驗

2.3.1響應面法試驗方案及結(jié)果

在響應面試驗中以蛋白質(zhì)提取率為響應值，pH值(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、超聲功率(D)為自變量，采用Box-Benhnken設計對辣木籽蛋白質(zhì)提取工藝進行優(yōu)化，試驗方案與結(jié)果見表3。

表3 響應面法試驗設計及蛋白質(zhì)提取率

2.3.2響應面模型的建立與分析

根據(jù)Design-expert8.0對響應面模型進行擬合分析，得到二元回歸方程：Y=45.21-0.24A-0.28B-0.26C+0.33D+0.25AB-0.35AC+0.57AD+1.46BC-0.47BD-0.62CD-0.66A2-3.00B2-1.81C2-1.35D2。由回歸方程可知，A、B、C和D一次項系數(shù)的絕對值大小排列為D>B>C>A，則判斷出各因素影響辣木籽蛋白提取率順序為：超聲功率>提取時間>提取溫度>pH值。

對響應面回歸模型進行方差分析，結(jié)果如表4所示。由表4可知，模型P<0.000 1，表明試驗模型極顯著，試驗方法可靠；失擬項P=0.426 7(>0.05)，表明失擬項不顯著，未知因素對試驗影響較小。相關(guān)系數(shù)R2=0.960 6，模型預測值與真實試驗值在試驗范圍內(nèi)擬合度較好。BC、B2、C2、D2極顯著，D、AD、CD、A2顯著，表明提取功率對辣木籽蛋白提取率產(chǎn)生影響較大，其余因素及因素交互作用均不顯著。

表4 回歸模型方差分析

注：**為極顯著(P<0.01)，*為顯著(P<0.05)。

2.3.3響應曲面圖分析

響應曲面圖反映了不同試驗因素的交互作用對辣木籽蛋白質(zhì)提取率的影響[32]，詳見圖6。由圖6(a)可知，提取時間比pH值曲面變化陡峭，曲面變化越陡峭說明對辣木籽蛋白質(zhì)提取率影響越顯著，并且觀察等高線形狀為橢圓形表明兩因素的交互作用比較明顯。同理，在圖6(b～f)中，提取時間比提取溫度對辣木籽蛋白提取率影響顯著，提取溫度比pH值對辣木籽蛋白質(zhì)提取率影響顯著，該結(jié)果與表4結(jié)果相同。a、d、e、f的等高線較b、c等高線更為密集，提取功率和提取時間較其他因素對辣木籽蛋白質(zhì)提取率影響更加明顯，其中d的等高線趨近于圓形，表明提取溫度與提取時間之間交互作用最小，其他各因素間交互作用較大。

(a)提取時間與pH值

(b)提取溫度與pH值

(c)超聲功率與pH值

(d)提取溫度與提取時間

(e)提取功率與提取時間

(f)超聲功率與提取溫度

2.3.4驗證試驗

為了進一步確定提取辣木籽蛋白質(zhì)的最佳工藝條件，利用Design-expert 8.0繼續(xù)分析，預測在pH 7.95、提取時間44.54 min、提取溫度44.39℃、超聲功率154.27 W的條件下，辣木籽蛋白質(zhì)提取率達到最大值為45.275%?；谠囼灄l件的考量，確定響應面優(yōu)化試驗條件為pH 8.0、提取時間45 min、提取溫度44℃、超聲功率150 W，進行3次平行試驗以確保準確性。在該條件下辣木籽蛋白質(zhì)實際提取率為(4.03±0.71)%，與預測值無顯著性差異。因此響應面法優(yōu)化辣木籽蛋白質(zhì)的提取條件具有可行性。

2.4 辣木籽蛋白等電點測定結(jié)果分析

以辣木籽蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為縱坐標，pH值為橫坐標，繪制辣木籽蛋白質(zhì)含量與pH值關(guān)系圖。由圖7可知，辣木籽蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在pH 2.8～4.8時，先減少后增加，在pH值為3.4時，酸沉后上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度最低為2.64 mg/ml，沉淀率為54.27%。采用等電點沉淀后得到辣木籽蛋白質(zhì)的純度為91.31%。

圖7 辣木籽蛋白質(zhì)等電點測定

2.5 SDS-PAGE電泳分析

對照Marker來表達辣木籽蛋白質(zhì)亞基分子量分布范圍。圖8表明辣木籽蛋白質(zhì)分子量在14.4～180.0 kDa，主要含有16.0、25.0和45.0 kDa三個亞基，整體無明顯雜帶。非變性的辣木籽蛋白質(zhì)在電泳過程中可以保持辣木籽蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)和活性不變[33]。加入β-巰基乙醇后，辣木籽蛋白質(zhì)亞基分開或消失，存在3條亞基條帶，說明辣木籽蛋白質(zhì)中含有二硫鍵。二硫鍵斷裂后形成的亞基分子量較未加β-巰基乙醇時減小，在0～14.4、22.0和31.0～43.0 kDa均有分布。

2.6 氨基酸組成分析

辣木籽蛋白質(zhì)各氨基酸組分含量及占總氨基酸比例詳見表5。通過對辣木籽氨基酸的檢測分析發(fā)現(xiàn)，辣木籽蛋白質(zhì)中含有18種氨基酸，總量達到38.383 g/(100 g)。辣木籽蛋白質(zhì)氨基酸組分中含有7種必需氨基酸，總量達到9.839 g/(100 g)，占總氨基酸含量的25.63%。谷氨酸可促進人體新陳代謝，在辣木籽所有氨基酸組分中含量最高，達到9.031 g/(100 g)。該結(jié)論與楊東順等[34]研究結(jié)果相似。

泳道1：未加β-巰基乙醇的非還原SDS-PAGE電泳泳道2：加入β-巰基乙醇的還原SDS-PAGE電泳圖8 辣木籽蛋白電泳圖譜

表5 辣木籽氨基酸組分含量及占總氨基酸比例分析表

3 結(jié)論

(1)辣木籽的脂肪質(zhì)量分數(shù)為41.14%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為35.48%，水分為5.56%，黃酮質(zhì)量分數(shù)為0.094%，灰分質(zhì)量分數(shù)為5.12%。

(2)超聲波輔助堿法提取辣木籽蛋白的最佳工藝為：pH 8.0、提取時間45 min、提取溫度44℃、超聲功率150W，所得辣木籽蛋白質(zhì)提取率達到44.03%，各因素影響辣木籽蛋白提取率的順序為：超聲功率>提取時間>提取溫度>pH值。

(3)辣木籽蛋白質(zhì)等電點為3.4，在等電點條件下沉淀辣木籽蛋白質(zhì)得到蛋白質(zhì)沉淀率為54.27%，純度達到91.31%；SDS-PAGE電泳分析表明辣木籽蛋白質(zhì)主要含有3個亞基，其分子量分別為16.0、25.0和45.0 kDa。

(4)氨基酸分析表明辣木籽中含有18種氨基酸，有7種人體必需氨基酸，占總氨基酸含量的25.63%。谷氨酸含量最高達到9.031 g/(100g)，占比23.53%。辣木籽蛋白質(zhì)作為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)資源，具有極大開發(fā)潛力