吳丹　劉斌　鄒瑜

中圖分類號 R285.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）05-0600-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.05.19

摘 要 目的：建立同時測定參芪健胃顆粒中綠原酸、芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨、檸檬苦素、川陳皮素、橘皮素、黨參炔苷含量的方法。方法：采用超高效液相色譜（UPLC）-Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜法。色譜柱為Hypersil Gold C18，流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫），流速為0.4 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為1 μL;采用加熱型電噴霧離子源，以正離子檢測模式，在質(zhì)荷比100～1 000 范圍內(nèi)進(jìn)行高分辨率全掃描。通過提取目標(biāo)化合物的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定量，測定2個廠家共3批樣品中8個成分的含量。結(jié)果：綠原酸、芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨、檸檬苦素、川陳皮素、橘皮素、黨參炔苷8個成分的檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.12～1.46、3.51～42.15、2.71～32.55、1.76～21.10、0.04～0.46、0.04～0.24、0.02～0.21、0.01～0.25 μg/mL（r≥0.999 0）;定量限分別為6.06、0.04、0.03、0.02、7.60、0.05、0.02、6.25 ng/mL;檢測限分別為3.03、0.01、0.01、0.01、3.80、0.01、0.01、2.50 ng/mL;精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性（24 h）試驗的RSD均小于5%（n=6）;平均加樣回收率為93.16%～97.78%（RSD≤5%，n=6）;3批樣品中8個成分的含量分別為12.62～13.20、265.01～472.26、234.20～278.90、173.10～255.74、2.32～2.83、2.37～3.58、0.79～1.22、0.91～1.78 μg/g。結(jié)論：本方法簡便、快速、準(zhǔn)確且重復(fù)性好、靈敏度高，可為參芪健胃顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜法;參芪健胃顆粒;含量測定

Simultaneous Determination of 8 Components Contents in Shenqi Jianwei Granules by UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry

WU Dan1，2，LIU Bin3，ZOU Yu1（1.Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control， School of Medicine， Wuhan University of Science and Technology， Wuhan 430065， China;2.School of Pharmacy， Guangzhou Medical University， Guangzhou 511436， China;3.Tianjin Best Peptide Pharmaceutical Technology Co.， Ltd.， Tianjin 300354， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To develop a method for simultaneous determination of chlorogenic acid， paeoniflorin， hesperidin， ammonium glycyrrhizate， limonin， nobiletin， tangeretin and lobetyolin in Shenqi jianwei granules. METHODS： UPLC-Q-Exactive quadrupole electrostatic field orbital hydrazine high resolution mass spectrometry method was adopted. The determination was performed on Hypersil Gold C18 column with a mobile phase consisted of acetonile-0.1% formic acid （gradient elution） at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was set at 35 ℃， the sample size was 1 μL. High resolution full scan experiments was performed over the range of m/z 100-1 000 in heating electro-spray lonization and positive mode to extract the accurate mass of analytes. The contents of 8 components were determined in 3 batches of samples from 2 manufacturers. RESULTS： The linear range of chlorogenic acid， paeoniflorin， hesperidin， ammonium glycyrrhizate， limonin， nobiletin， tangeretin and lobetyolin were 0.12-1.46， 3.51-42.15， 2.71-32.55， 1.76-21.10， 0.04-0.46， 0.04-0.24， 0.02-0.21 and 0.01-0.25 μg/mL， respectively （all r≥0.999 0）. The limits of quantitation were 6.06， 0.04， 0.03， 0.02， 7.60， 0.05， 0.02， 6.25 ng/mL， respectively. The limits of detection were 3.03， 0.01， 0.01， 0.01， 3.80， 0.01， 0.01， 2.50 ng/mL， respectively. RSDs of precision， reproducibility and stability （24 h） tests were all lower than 5% （n=6）. Average recoveries were 93.16%-97.78% （RSD≤5%，n=6）. The contents of 8 components in 3 batches of samples were 12.62-13.20， 265.01-472.26， 234.20-278.90， 173.10-255.74， 2.32-2.83， 2.37-3.58， 0.79-1.22， 0.91-1.78? ?μg/g， respectively. CONCLUSIONS： The established method is simple， convenient， rapid， accurate， highly reproducible and sensitive， which can be used for quality control of Shenqi jianwei granules.

2.4.2 線性關(guān)系及定量限、檢測限考察 取“2.3.1”項下混合對照品溶液，用甲醇逐級稀釋，得系列混合對照品溶液，其中各待測成分質(zhì)量濃度分別為綠原酸1.46、0.73、0.36、0.29、0.24、0.18、0.12 μg/mL，芍藥苷42.15、21.08、10.54、8.43、7.02、5.27、3.51 μg/mL，橙皮苷32.55、16.28、6.51、5.43、4.01、3.62、2.71 μg/mL，甘草酸銨21.10、10.55、5.28、4.22、3.52、2.64、1.76 μg/mL，檸檬苦素0.46、0.23、0.11、0.09、0.08、0.06、0.04 μg/mL，川陳皮素0.24、0.12、0.10、0.08、0.06、0.05、0.04 μg/mL，橘皮素0.214、0.071、0.043、0.036、0.026、0.024、0.018 μg/mL，黨參炔苷0.250、0.200、0.100、0.063、0.050、0.025、0.013 μg/mL。分別取各對照品溶液，按“2.1”“2.2”項下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算成分的回歸方程。結(jié)果，8個待測成分在檢測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r均大于0.999 0。選取信噪比為10時各待測成分質(zhì)量濃度作為定量限，信噪比為3時各待測成分質(zhì)量濃度作為檢測限。8個待測成分的線性關(guān)系及定量限、檢測限結(jié)果見表2。

2.4.3 加樣回收率考察 取同一批次樣品（批號：20180434）1 g，精密稱定，平行稱取6份，分別精密加入與樣品中綠原酸、芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨、檸檬苦素、川陳皮素、橘皮素、黨參炔苷質(zhì)量相當(dāng)?shù)膶φ掌啡芤海础?.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”“2.2”項下條件進(jìn)樣檢測，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.4.4 精密度考察 取“2.3.1”項下同一混合對照品溶液，按“2.1”“2.2”項下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各待測成分的峰面積。結(jié)果，綠原酸、芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨、檸檬苦素、川陳皮素、橘皮素、黨參炔苷峰面積的RSD分別為2.26%、1.94%、2.08%、1.92%、2.95%、2.00%、1.40%、1.34%（n=6），均符合精密度試驗的要求。

2.4.5 重復(fù)性考察 取同一批次樣品（批號：20180434），共6份，按“2.3.2”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.1”“2.2”項下條件進(jìn)樣測定，記錄各待測成分峰面積，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其含量。結(jié)果，綠原酸、芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨、檸檬苦素、川陳皮素、橘皮素、黨參炔苷含量的RSD分別為1.51%、3.36%、2.63%、2.56%、4.01%、3.44%、3.91%、4.01%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性考察 取同一供試品（批號：20180434）溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時按“2.1”“2.2”項下條件進(jìn)樣測定，記錄各待測成分峰面積。結(jié)果，綠原酸、芍藥苷、橙皮苷、甘草酸銨、檸檬苦素、川陳皮素、橘皮素、黨參炔苷峰面積的RSD分別為1.22%、0.91%、2.11%、3.77%、4.09%、2.44%、3.43%、2.26%（n=6），表明供試品溶液在室溫條件下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品含量測定

目前，臨床上使用的參芪健胃顆粒主要來自2個廠家（即河南輔仁堂制藥有限公司和江蘇中興藥業(yè)有限公司），本文選取2個廠家共3批次的樣品進(jìn)行檢測。精密稱取3批參芪健胃顆粒樣品適量，按“2.3.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”“2.2”項下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各成分含量，平行3份，取平均值，結(jié)果見表4。

表4 參芪健胃顆粒中8個成分的含量結(jié)果（n=3，μg/g）

3 討論

3.1 分析方法的選擇

由于本文中檢測的部分成分（如川陳皮素、橘皮素）的含量較低，采用一般的HPLC法測定時因靈敏度有限，不能同時檢出;此外，含量較低的成分雖然可通過濃縮后再采用HPLC方法檢測，但增加了濃縮的步驟，使操作變得更繁瑣。本研究選用的UPLC-Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法具有檢測限低、靈敏度高等優(yōu)勢，樣品提取后無需經(jīng)過濃縮等處理，樣品處理過程更簡便。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

為提高電離效率，同時避免出現(xiàn)峰拖尾現(xiàn)象，本研究采用0.1%甲酸水溶液作為流動相。為提高8個成分的分離度，縮短分析時間，本研究嘗試采用不同的流動相組合來實現(xiàn)8個成分的完全分離。結(jié)果表明，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液體系進(jìn)行梯度洗脫，分析時間短（8個成分的保留時間均在10 min之內(nèi)），分離效果好，方法專屬性強。

3.3 掃描方式及定量離子的選擇

本文采用的質(zhì)譜儀可進(jìn)行全掃描，除可提供定性信息外，還可選取特征母離子作為定量離子，簡化了質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，提高了工作效率。故本研究在正離子檢測模式下，采用全掃描方式，在m/z 100～1 000范圍內(nèi)檢測對照品后，選擇響應(yīng)信號強的特征母離子作為定量離子，并與理論質(zhì)量數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果定量母離子與理論質(zhì)量數(shù)偏差均在1.5 ppm之內(nèi)。

3.4 提取方法的選擇

本研究采用70%甲醇作為提取溶劑，同時考察了超聲提取和加熱回流提取對提取率的影響。結(jié)果2種提取方式所得各成分的提取率相差不大。為簡化試驗操作，最終采用超聲提取的方式。

4 結(jié)語

本研究建立了UPLC-Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法對參芪健胃顆粒中8個成分進(jìn)行含量測定。結(jié)果顯示，不同廠家的樣品之間，8個成分的含量有一定的差異，可能與原藥材的來源或者生產(chǎn)過程有關(guān)。因該制劑現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀、鑒別和檢查項，無含量檢測項，故本文研究結(jié)果可補充完善已有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。綜上，本文建立的方法分析時間短、靈敏度高，可為參芪健胃顆粒的質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 張淼，楊沈秋，孫興華，等.參芪健胃顆粒治療慢性萎縮性胃炎的臨床研究[J].中國臨床藥理雜志，2016，32（16）：1460-1463.

[ 2 ] 王燕.參芪健胃顆粒治療胃痛的療效觀察[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2012，15（7）：1081.

[ 3 ] 吳春霞，賈曦.參芪健胃顆粒治療消化性潰瘍39例臨床觀察[J].醫(yī)學(xué)信息，2010，23（11）：4376-4377.

[ 4 ] 牛曉靜，魯靜，端曉穎，等. HPLC同時測定健脾舒胃凝膠中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸銨5種成分含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（2）：77-79.

[ 5 ] 張桂平，王東旭.HPLC-PDA法同時測定大黃蟄蟲丸中6種成分含量[J].中國藥房，2019，30（1）：54-58.

[ 6 ] 魏瑩，李文東，楊武亮. HPLC法測定不同貯存年限廣陳皮藥材中主要活性成分的含量[J].中國藥房，2016，27（15）：2131-2134.

[ 7 ] 安欣欣，李媛媛，戰(zhàn)妍妃，等.基于UPLC-Q-Exactive和HPLC對蒲公英總黃酮部位成分分析及主成分的含量測定[J].中國新藥與臨床藥理，2019，30（1）：99-105.

[ 8 ] 張憲，李岳.高效液相色譜法測定肝精補血素口服液中黨參炔苷含量[J].中國藥業(yè)，2019，28（12）：32-34.

[ 9 ] 衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第十冊[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，1995：103-104.

[10] 勾曉丹，姜麗華，張瑩瑩，等. HPLC法測定參芪健胃顆粒中阿魏酸含量[J].中國民族民間醫(yī)藥，2015，24（15）：17-18.

[11] 馬曉靜，崔業(yè)波，陳美逸.參芪健胃顆粒中芍藥苷、橙皮苷和甘草酸銨的含量測定[J].中國藥物評價，2016，33（5）：412-416.

[12] 余樹珍，張紅梅，陸春燕.高效液相色譜法測定參芪健胃顆粒中芍藥苷的含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（3）：601-602.

[13] 勾曉丹，鄭琰，劉淑華.雙波長HPLC法同時測定參芪健胃顆粒中芍藥苷和阿魏酸的含量[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2016，22（10）：53-54.

[14] SCHELTEMA RA，HAUSCHILD JP，LANGE O，et al. The Q exactive HF，a benchtop mass spectrometer with a pre-filter，high-performance quadrupole and an ultra-high- field orbitrap analyzer[J]. Mol Cell Proteomics，2014，13 （12）：3698-3708.

[15] 劉蕓，丁濤，費曉慶，等.高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨率質(zhì)譜檢測蜂蜜中的 4-甲基咪唑和2-甲基咪唑[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2014，5（10）：2979-2986.

[16] MICHALSKI A，DAMOC E，HAUSCHILD JP，et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive，a high- performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer[J]. Mol Cell Proteomics，2011，10（9）：M111.

[17] WANG SP，LIU L，WANG LL，et al. Simultaneous determination of six hydrophilic components in rat plasma after oral administration of Jitai tablet by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry：application to a pharmacokinetic study[J]. J Chromatogr B，2013.DOI：10.1016/j.jchromb.2012.11.019.

[18] 陳達(dá)煒，高潔，呂冰，等.超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法快速篩查土豆中的多種農(nóng)藥殘留[J].分析化學(xué)，2014，42（4）：579-584.

[19] HELFER? AG，MICHELY JA，WEBER AA，et al. Orbitrap technology for comprehensive metabolite-based liquid chromatographic high resolution-tandem mass spectrometric urine drug screening：exemplified for cardiovascular drugs[J]. Analytica Chimica Acta，2015.DOI：10.1016/j.aca.2015.08.018

[20] 董紅嬌，陳曉虎，曾銳，等. UPLC-Q-Exactive 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用快速分析民族藥小大黃的化學(xué)成分[J].中草藥，2016，47（14）：2428-2435.

[21] FORNELLI L，DURBIN KR，F(xiàn)ELLERS RT，et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer[J]. J Proteome Res，2017，16（2）：609-618.

[22] 張璐，張亞莉，何強，等.超高液相色譜/線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速篩查土壤中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量[J].分析實驗室，2017，36（1）：60-65.

[23] 胡英還，許文倩，秦雪梅，等. UHPLC-Q-Exactive軌道阱高分辨質(zhì)譜在線快速識別黃芪建中湯的化學(xué)成分[J].藥學(xué)學(xué)報，2017，52（6）：964-970.

[24] 李云飛，殷紅，楊凌春，等.超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速測定食品中6種甜味劑[J].環(huán)境化學(xué)，2016，35（8）：1737-1740.

[25] 王長生，董紅嬌，包雅婷，等. UPLC-Q-Exactive 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用快速分析粗莖秦艽化學(xué)成分[J].中草藥，2016，47（18）：3715-3180.

（收稿日期：2019-09-03 修回日期：2019-10-21）

（編輯：劉 萍）