李恩萍，史天云，王博，張欣萍

南陽市第一人民醫(yī)院婦科，河南 南陽473010

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，具有發(fā)病隱匿、進展快等特點，其中上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）約占90%。據(jù)統(tǒng)計，70%～80%的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期階段，5年生存率只有20%～30%，而早期卵巢癌的5年生存率達90%[1-2]。因此提高卵巢癌的早期診斷率，有利于爭取治療時機和改善預后。但針對EOC目前仍缺乏特異性的診斷和預測預后的分子標志物，糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）是目前應用最廣泛的卵巢癌血清標志物，但近年來發(fā)現(xiàn)其診斷特異度較低，部分良性疾病患者、月經(jīng)來潮時女性及妊娠期婦女也會出現(xiàn)CA125升高造成假陽性診斷的情況[3]。近期研究顯示，微小RNA（microRNA，miRNA）與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切關系，其中miRNA-200b、miRNA-21與多種腫瘤的發(fā)生相關[4-6]，然而其在卵巢癌診斷和預測預后中的價值尚待明確。本研究檢測血漿miRNA-200b、miRNA-21在EOC中的表達水平，并探討二者與EOC臨床特征的關系及對診斷和預測預后的價值，旨在為EOC的早期診斷和預后預測提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年3月至2015年10月南陽市第一人民醫(yī)院收治的80例行手術治療的EOC患者。納入標準：①符合國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）卵巢癌分類標準和世界衛(wèi)生組織（WHO）分級標準[7]，并經(jīng)病理檢查確診為EOC；②術前無放療和化療史。排除標準：①合并其他系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤；②合并嚴重心、肝、腎功能障礙；③不能配合完成本次研究。80例EOC患者，年齡30～78歲，平均（56.72±10.58）歲，設為EOC組。另選取同期年齡匹配的46例上皮性卵巢良性腫瘤患者作為良性組，48例健康女性作為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 檢測方法

1.2.1 主要試劑和儀器 實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）采用羅氏cobas z480全自動熒光定量PCR分析儀，miRNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司。

1.2.2 miRNA的提取 所有研究對象均抽取清晨空腹靜脈血5 ml，離心后分離血漿，-80℃保存待檢。向300 μl血漿樣本中加入1 ml總提取液，按照血液總miRNA快速提取試劑盒操作說明從血漿樣本中提取總RNA。

1.2.3 miRNA逆轉錄及qRT-PCR檢測miRNA逆轉錄使用U6作為實驗內參，miRNA逆轉錄反應體系：5 μl RNA模板，3 μlU6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15 μl 100 mmol/L dNTP（含 dTTP），1 μl逆轉錄酶（50 U/μl），1.5 μl 10×反轉錄緩沖液，0.19 μl RNase抑制劑（20 U/μl），4.16 U/μl無菌三蒸水。反應條件：16 ℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃保存，進行逆轉錄反應。qRT-PCR檢測使用U6作為實驗內參，反應體系 20 μl：1 μl TaqMan Small RNA Assay（20×）溶液，10 μl TaqMan? Universal PCR Master Mix Ⅱ（2×）溶液，1.33 μl反轉錄產(chǎn)物cDNA，7.67 μl DEPC水。擴增條件：95℃ 10 min一個循環(huán)，95℃15 s、60℃1 min進行40個循環(huán)，重復3次。采用2-ΔΔCt法計算miRNA的相對表達量。

1.2.4 血清CA125檢測 采用全自動電化學發(fā)光分析儀測定血漿CA125水平，操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3 隨訪

所有EOC患者術后隨訪觀察3年，以電話及門診方式進行，記錄患者隨訪期內的生存情況。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價診斷價值，曲線下面積（area under curve，AUC）比較采用Z檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組研究對象血漿miRNA-200 b、miRNA-21相對表達量的比較

EOC組血漿miRNA-200b、miRNA-21相對表達量均高于良性組和對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而良性組和對照組血漿miRNA-200b、miRNA-21相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 3組研究對象血漿miRNA-200 b、miRNA-21相對表達量的比較（±s）

表1 3組研究對象血漿miRNA-200 b、miRNA-21相對表達量的比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與良性組比較，P＜0.05

組別對照組（n=48）良性組（n=46）EOC組（n=80）F值P值miRNA-200b 1.22±0.37 1.34±0.39 3.60±0.92a b 248.797 0.000 miRNA-21 1.07±0.26 1.19±0.28 2.41±0.47a b 252.322 0.000

2.2 血漿miRNA-200 b、miRNA-21檢測對EOC的診斷價值

應用ROC曲線確定miRNA-200b、miRNA-21診斷EOC的最佳截斷值，取約登指數(shù)最大時對應的miRNA-200b、miRNA-21水平作為臨界值，高于臨界值即診斷為陽性，聯(lián)合診斷時，任一項高于臨界值即診斷為陽性。結果顯示血漿miRNA-200b、miRNA-21診斷EOC的最佳截斷值分別為2.110、1.520，二者聯(lián)合診斷的AUC分別大于miRNA-200b單項診斷（Z=2.320，P=0.020）及miRNA-21單項診斷（Z=2.974，P=0.003），而miRNA-200b與miRNA-21單項診斷的AUC比較，差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.769，P=0.442）。（表2、圖1）

表2 血漿miRNA-200 b、miRNA-21及二者聯(lián)合檢測對EOC的診斷效能

圖1 血漿miRNA-200 b、miRNA-21及二者聯(lián)合檢測診斷EOC的ROC曲線

2.3 不同臨床特征的EOC患者血漿miRNA-200 b、miRNA-21相對表達量的比較

不同年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、病理類型的EOC患者血漿miRNA-200b、miRNA-21相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同臨床分期、CA125水平及有無淋巴結轉移的EOC患者血漿miRNA-200b、miRNA-21相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表3）

表3 不同臨床特征的EOC患者血漿miRNA-200 b、miRNA-21的相對表達量（ n=80）

2.4 血漿miRNA-200 b、miRNA-21檢測對EOC患者預后的預測價值

2.4.1 不同預后EOC患者血漿miRNA-200 b、miRNA-21相對表達量的比較 截至隨訪截止時間，80例EOC患者中，28例死亡，占35.0%。根據(jù)臨床結局，將EOC患者分為生存組與死亡組，死亡組患者血漿miRNA-200b、miRNA-21水平均明顯高于生存組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表4）

表4 生存組和死亡組EOC患者血漿miRNA-200 b、miRNA-21相對表達量的比較（±s）

表4 生存組和死亡組EOC患者血漿miRNA-200 b、miRNA-21相對表達量的比較（±s）

組別生存組（n=52）死亡組（n=28）2.86±0.66 4.97±1.04 2.17±0.41 2.86±0.58 t值P值miRNA-200b 9.732 0.000 miRNA-21 5.588 0.000

2.4.2 血漿miRNA-200 b、miRNA-21及二者聯(lián)合檢測對EOC患者預后預測的價值 應用ROC曲線確定miRNA-200b、miRNA-21預測EOC患者預后不良的最佳臨界值，取約登指數(shù)最大時對應的miRNA-200b、miRNA-21水平作為臨界值。結果顯示血漿miRNA-200b、miRNA-21預測EOC患者預后不良的最佳截斷值分別為3.680、2.410，二者聯(lián)合檢測的AUC分別大于miRNA-200b（Z=2.066，P=0.039）及 miRNA-21（Z=2.034，P=0.042）單獨檢測，而miRNA-200b與miRNA-21單獨檢測的AUC比較，差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.078，P=0.938）。（表5、圖2）

表5 血漿miRNA-200 b、miRNA-21及二者聯(lián)合檢測預測EOC患者預后的效能

圖2 血漿miRNA-200 b、miRNA-21及二者聯(lián)合檢測預測EOC患者預后的ROC曲線

3 討論

miRNA是一類短的內源性非編碼單鏈RNA，由19～25個核苷酸組成，能通過與目標RNA互補配對干擾正常mRNA的合成，從而達到調控靶基因的目的。miRNA作為近年來生物醫(yī)學研究領域的熱點之一，在諸多研究中顯示出作為腫瘤調控因子和治療靶標的潛能[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)miR-NA通過多種途徑參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程，包括調控原癌基因或抑癌基因表達，介導腫瘤血管生成、上皮-間充質轉化以及免疫逃逸等[9-10]。此外，外周血miRNA不易被降解，能有效反映腫瘤組織中miRNA表達水平，且微量miRNA提取技術的不斷發(fā)展使外周血miRNA含量的檢測逐漸常規(guī)化，也使miRNA作為腫瘤診斷的實用生物標志物成為可能。多項研究報道了miRNA-200b及miRNA-21在惡性腫瘤中存在異常表達，Kan等[11]發(fā)現(xiàn)miRNA-200b在上皮性卵巢癌組織中表達水平明顯高于正常卵巢組織。在對胃癌患者的研究中，姜雷等[12]指出miRNA-21在血漿中的表達水平升高可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。亦有研究報道m(xù)iRNA-21在卵巢癌患者血清中呈高表達[13]。本研究中，EOC組患者血漿miRNA-200b、miRNA-21相對表達量較良性組和對照組均明顯上調，與上述研究一致，且隨著EOC患者臨床分期進展，其表達水平也呈現(xiàn)升高趨勢，提示miRNA-200b和miRNA-21可能通過發(fā)揮原癌基因作用促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展。

此外，通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血漿miRNA-200b和miRNA-21對EOC具有較好的診斷效能，根據(jù)約登指數(shù)最大時，計算的最佳截斷值分別為2.110、1.520。卵巢癌惡性程度高，早期診斷對于提高患者遠期生存率具有重要意義，降低漏診率是臨床診斷時的重中之重，應用miRNA-200b、miRNA-21聯(lián)合診斷時，診斷效能明顯提高。Meng等[14]研究指出卵巢癌患者miRNA-200b水平呈高表達，且其表達水平與CA125密切相關，本研究中EOC患者血漿miRNA-200b、miRNA-21表達水平均與CA125水平有關。Xu等[13]在一項研究中指出EOC患者血清miRNA-21水平高于健康對照組，同時miRNA-21水平越高，對應FIGO分期更高，腫瘤分級更高，以及總生存期更短。本研究對不同臨床特征的EOC患者血漿miRNA-200b、miRNA-21水平進行分析發(fā)現(xiàn)，血漿miRNA-200b和miRNA-21水平與患者年齡、病理類型、絕經(jīng)狀態(tài)無關，而與淋巴結轉移、臨床分期有關，提示二者在EOC預測中有重要意義，有潛力作為EOC患者預后的分子標志物，結果與上述研究結論一致。通過比較不同臨床結局患者血漿miRNA-200b、miRNA-21水平發(fā)現(xiàn)，死亡組患者miRNA-200b、miRNA-21水平均明顯高于生存組，提示血漿miRNA-200b、miRNA-21表達水平高者預后差。通過ROC曲線進一步分析，確定血漿miRNA-200b、miRNA-21預測EOC患者預后不良的最佳截斷值分別為3.680、2.410，二者對EOC患者預后均具有較好的預測價值，且聯(lián)合應用時，預測能力明顯提升。另有研究[15]報道，miRNA-21還可能與卵巢癌對順鉑的耐藥相關，通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miRNA-21在順鉑耐藥卵巢癌中的表達水平較順鉑敏感的卵巢癌升高，這一結果或許能為臨床卵巢癌化療藥物的應用提供依據(jù)。隨著miRNA在上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制越來越明確，其在EOC中的應用價值也會越來越清晰。

綜上所述，本研究結果表明血漿miRNA-200b、miRNA-21水平具有較好的EOC診斷和預后預測價值，可作為EOC早期診斷和EOC患者預后預測的分子標志物，二者聯(lián)合應用能提高診斷及預后預測能力。