羅福麗，牛宇宸，胡秀彩，呂愛軍，通信作者，葉明皓，孫敬鋒

巴西龜弗氏檸檬酸桿菌病的臨床癥狀及組織病理觀察

羅福麗1，牛宇宸2，胡秀彩1，呂愛軍1，通信作者，葉明皓1，孫敬鋒1

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2. 天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300072）

為觀察巴西龜弗氏檸檬酸桿菌病的臨床癥狀及其組織病理學(xué)特征，采用人工感染試驗(yàn)、石蠟切片和HE染色方法進(jìn)行組織病理研究。結(jié)果表明，感染發(fā)病龜主要表現(xiàn)為眼結(jié)膜發(fā)炎、口鼻皮膚潰爛，解剖可見肺部發(fā)黑，腸道淡黃色，無內(nèi)容物、水樣黏液增多等臨床癥狀；組織病理學(xué)觀察顯示眼瞼上皮組織色素細(xì)胞增多，胃和腸上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，心臟心肌纖維間隙變寬、壞死且有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺臟肺泡細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞界限不清、肺泡壁毛細(xì)血管淤血，肝臟肝細(xì)胞壞死、中央靜脈淤血、肝細(xì)胞索紊亂，腎臟腎小管上皮細(xì)胞壞死，腎小球出血，肌肉肌纖維間隙有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。以上結(jié)果為闡明龜類弗氏檸檬酸桿菌病的致病機(jī)理提供一定參考。

巴西龜；弗氏檸檬酸桿菌病；組織病理

巴西龜（）又被稱為“紅耳龜”，原產(chǎn)于美國(guó)中部至墨西哥北部，在我國(guó)分布范圍非常廣泛，具有藥用、觀賞、食用等價(jià)值，而且該物種食性雜、疾病少，容易飼養(yǎng)，深得人們喜愛[1]。近年來，隨著巴西龜集約化養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，疾病頻繁發(fā)生，其中，細(xì)菌性疾病報(bào)道較多[2-5]。陶池有[2]研究表明患細(xì)菌性腸道出血癥的金錢龜（）有腸壁大量血斑、口鼻出血等臨床癥狀。吳季森等[3]報(bào)道龜摩根氏變形桿菌（）病主要表現(xiàn)為口腔、鼻孔有白沫流出。陶錦華等[4]報(bào)道感染肺炎克雷伯氏菌（）的黃喉擬水龜（）鼻、眼部位有較多分泌物，嚴(yán)重者雙目失明。最近，葉明皓等[5]從患病巴西龜眼部分離出雷氏普羅威登斯菌（），病龜有眼結(jié)膜充血、發(fā)炎等臨床癥狀。已有報(bào)道指出龜類細(xì)菌性疾病發(fā)生快、分布廣、危害大，給龜類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。

近幾年，關(guān)于龜鱉類弗氏檸檬酸桿菌（）病的細(xì)菌鑒定及病例報(bào)道備受關(guān)注[7-12]。國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道中華鱉（）感染弗氏檸檬酸桿菌病主要表現(xiàn)為敗血癥[7-8]，也有報(bào)道指出中華鱉腮腺炎繼發(fā)感染弗氏檸檬酸桿菌[9]。Chiacchio等[10]從巴西龜?shù)男怪城恢蟹蛛x出弗氏檸檬酸桿菌，結(jié)果表明該菌具有很強(qiáng)的致病性。國(guó)外學(xué)者已有對(duì)弗氏檸檬酸桿菌感染綠海龜（）導(dǎo)致血管炎、結(jié)腸炎等[11-12]的研究報(bào)道。但是，關(guān)于龜類弗氏檸檬酸桿菌病組織病理學(xué)及其致病機(jī)制的研究，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)人工感染巴西龜弗氏檸檬酸桿菌病的臨床癥狀、剖檢病變及組織病理學(xué)進(jìn)行觀察研究，以期為該病的致病機(jī)理提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試劑

健康巴西龜（體重約10.0 g）購自天津市某寵物龜養(yǎng)殖場(chǎng)，在室溫下飼養(yǎng)觀察7 d，健康無病后用于人工回感染試驗(yàn)。弗氏檸檬酸桿菌TC-1菌株，由天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院、天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從天津市某養(yǎng)殖場(chǎng)送檢患病巴西龜中分離、鑒定、保存。

1.2 人工回感染試驗(yàn)

參照康雪微等[13]的方法，隨機(jī)選取健康巴西龜作為試驗(yàn)動(dòng)物，分為感染組和對(duì)照組，每組10只，采用人工腹腔注射法對(duì)感染組龜注射TC-1菌液100 μL，其含菌量為2.4×108cfu/mL，對(duì)照組龜注射無菌生理鹽水100 μL。飼養(yǎng)溫度約為26±1℃，連續(xù)觀察28 d，記錄感染龜?shù)陌l(fā)病死亡情況。

1.3 臨床癥狀與剖檢觀察

對(duì)感染發(fā)病死亡的巴西龜進(jìn)行臨床癥狀及解剖觀察，無菌操作將龜裙邊緣剪開，打開背甲，觀察其內(nèi)臟器官的病變情況，記錄病龜?shù)闹饕R床癥狀和內(nèi)臟器官的病理變化特征。

1.4 組織切片制備與觀察

參照葉明皓等[5]的方法進(jìn)行，在無菌操作下取發(fā)病巴西龜?shù)母闻K、腎臟、心臟、腸道、眼瞼皮膚、胃、肺、肌肉組織小塊，放入無菌生理鹽水中浸泡5 min左右，再用波恩試液固定8～12 h。然后用70%酒精浸泡1.5 h，用1-6級(jí)的叔丁醇脫水各2 h，液蠟保存。使用石蠟切片技術(shù)，蘇木素-伊紅（H-E）染色，風(fēng)干后用正置熒光顯微鏡觀察、拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 人工感染巴西龜臨床癥狀

采用弗氏檸檬酸桿菌TC-1菌株進(jìn)行人工腹腔注射感染巴西龜試驗(yàn)，結(jié)果表明巴西龜在3 d后出現(xiàn)發(fā)病、死亡現(xiàn)象，在感染28 d時(shí)累計(jì)死亡率達(dá)60%；患病巴西龜?shù)呐R床癥狀主要表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、精神不振，食欲減退甚至停止攝食，個(gè)別龜肌肉松弛，眼睛結(jié)膜發(fā)炎、腫大、黏液增多、閉眼，口鼻皮膚潰爛、呼吸困難等，發(fā)病后期身體瘦弱衰竭而死（圖1A）；解剖病死龜體腔內(nèi)有惡臭氣味、腹水渾濁、肺臟發(fā)黑、腸道無內(nèi)容物、腸壁失去彈性、含有大量淡黃色黏液等癥狀（圖1B）。

圖1 人工感染發(fā)病巴西龜

注：A圖中感染發(fā)病龜眼結(jié)膜發(fā)炎（箭頭）；B圖中感染發(fā)病龜肺臟發(fā)黑

2.2 感染巴西龜組織病理變化

對(duì)感染巴西龜進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，可見胃組織黏膜上皮細(xì)胞脫落、壞死，疏松結(jié)締組織間有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2A）；腸道黏膜層上皮細(xì)胞嚴(yán)重變性、壞死、脫落，腸絨毛破裂，固有層的淋巴組織和毛細(xì)血管壞死，固有層和黏膜層結(jié)構(gòu)不完整，黏膜下層結(jié)締組織變性、壞死，內(nèi)環(huán)、外縱兩層平滑肌間隙增寬，漿膜與肌層間隙增寬（圖2B）；心臟組織中心肌纖維間隙增大、排列紊亂、斷裂、壞死、變性，纖維間有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2C）；肺臟中支氣管分支末端的囊狀結(jié)構(gòu)不清晰，單層肺泡細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞界限不清，肺泡壁毛細(xì)血管淤血（圖2D）；肝細(xì)胞間界限不清、細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞索紊亂，中央靜脈淤血（圖2E）；腎臟組織中腎小管上皮細(xì)胞壞死，腎小球出血（圖2F）；眼瞼上皮組織色素細(xì)胞增多，多邊形細(xì)胞減少，表皮層與真皮層的間隙增大（圖2G）；肌肉組織肌纖維間隙增大，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2H）。

圖2 感染巴西龜組織病理染色觀察

注：A圖中胃黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落（向左箭頭），右下角為其放大圖；B圖中腸道黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落（向下箭頭），結(jié)締組織變性（向右箭頭），平滑肌間隙增寬、壞死（向上箭頭），固有層的淋巴組織和毛細(xì)血管壞死（向左箭頭），右下角為其放大圖；C圖中心臟心肌纖維變性、壞死（向右箭頭），心肌纖維間隙有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（向左箭頭）；D圖中肺臟肺泡細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的界限不清（向上箭頭），肺泡壁毛細(xì)血管淤血（向右箭頭）；E圖中肝臟肝細(xì)胞部分壞死（向右箭頭），中央靜脈淤血（向左箭頭）；F圖中腎臟腎小球壞死（向右箭頭）、出血（向左箭頭）；G圖中眼瞼上皮組織色素細(xì)胞增多（向右箭頭），多邊形細(xì)胞減少（向左箭頭），右下角為其放大圖，部分表皮層與真皮層的間隙增寬（向上箭頭）；H圖中肌肉肌纖維間隙增寬（向右箭頭），大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（向左箭頭）

3 討論

弗氏檸檬酸桿菌是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）檸檬酸桿菌屬（）的代表菌，是一種條件致病菌，該菌是動(dòng)物和人腸道內(nèi)的正常菌群，普遍分布于土壤、水、食物等自然環(huán)境中[14]。該菌作為“人-獸-魚”共患病的病原菌，不僅對(duì)人類健康造成一定的威脅，導(dǎo)致腹瀉、食物中毒、繼發(fā)感染等[15-17]，而且對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物也有很強(qiáng)的致病性，弗氏檸檬酸桿菌曾引起中華鱉、中華絨螯蟹（）和紅螯螯蝦（）致病，主要癥狀表現(xiàn)為出血、敗血癥 等[18-20]。該菌引起的疾病感染率和死亡率高，極大降低了龜鱉養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，是該行業(yè)當(dāng)前急需解決的新型問題之一。

研究表明，龜鱉類弗氏檸檬酸桿菌病主要表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、精神不振、不攝食，眼結(jié)膜發(fā)炎，腮腺發(fā)炎腫大，腹甲出血、背甲糜爛，肝臟呈土黃色或肝臟腫大，腎臟腫大、充血、發(fā)炎，腸道出血、有血色腹水、氣味腥臭、黏膜脫落等臨床癥狀[7-9]。本研究中，感染弗氏檸檬酸桿菌的患病巴西龜主要臨床癥狀與上述研究相似，且病龜還表現(xiàn)為肺臟發(fā)黑、腸道淡黃色，病情嚴(yán)重時(shí)，口鼻皮膚潰爛等。

龜鱉類檸檬酸桿菌病的發(fā)病原因多為條件性致病[21-22]。章劍等[21]發(fā)現(xiàn)檸檬酸桿菌導(dǎo)致多種池龜敗血性皮膚潰瘍病的發(fā)生可能與生活環(huán)境差、皮膚破損等飼養(yǎng)管理有關(guān)。Jackson等[22]認(rèn)為沙雷鐵氏菌（）、檸檬酸桿菌繼發(fā)感染可能參與潰瘍病的發(fā)病過程。關(guān)于龜鱉類弗氏檸檬酸桿菌病組織病理學(xué)方面的研究，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。Fernandez等[23]報(bào)道新生柯氏喙鯨（）感染弗氏檸檬酸桿菌敗血癥，其肺臟的組織病理顯示肺組織淤血，支氣管上皮細(xì)胞壞死、脫落等癥狀。梁利國(guó)[24]報(bào)道感染弗氏檸檬酸桿菌的三疣梭子蟹（）的組織病理學(xué)研究，結(jié)果顯示病蟹心肌纖維斷裂，肌肉組織變性、肌細(xì)胞溶解等。舒新華等[25]對(duì)費(fèi)氏檸檬酸桿菌感染烏鱧（）腹水病病理形態(tài)學(xué)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示胃和腸道都有黏膜上皮細(xì)胞脫落、固有層毛細(xì)血管充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。研究表明，柯氏喙鯨[23]、三疣梭子蟹[24]、烏鱧[25]、銀鯰魚（）[26]、珍珠魟（）[27]等水產(chǎn)動(dòng)物感染弗氏檸檬酸桿菌病以敗血癥為主要臨床癥狀，這與本試驗(yàn)觀察發(fā)病巴西龜癥狀和病理變化基本一致，主要表現(xiàn)為肺臟、腎臟、肝臟、肌肉等組織器官中都出現(xiàn)淤血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和出血現(xiàn)象。此外，病龜?shù)难鄄€上皮組織色素細(xì)胞增多，多邊形細(xì)胞減少，對(duì)應(yīng)的臨床癥狀是眼結(jié)膜發(fā)炎、渾濁，眼睛腫大、黏液增多、無法睜眼，這與龜鱉類的白眼病有類似癥狀[28]，值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究對(duì)人工感染巴西龜弗氏檸檬酸桿菌病的臨床觀察及其組織病理學(xué)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，感染發(fā)病龜主要表現(xiàn)為眼結(jié)膜發(fā)炎、肺部發(fā)黑、腸道淡黃色等臨床癥狀；進(jìn)行病龜組織病理學(xué)觀察顯示，眼瞼、胃、腸、心臟和肺臟等均有不同程度的組織病變。以上研究結(jié)果為闡明龜類弗氏檸檬酸桿菌病的致病機(jī)理提供了一定參考。

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Clinical signs and histochemical observation ofdisease in turtle（）

LUO Fu-li1, NIU Yu-chen2, HU Xiu-cai1, Lü Ai-jun1,Corresponding Author, YE Ming-hao1, SUN Jing-feng1

（1. Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2.School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China）

In order to observe the clinical signs and its histopathological characteristics ofdisease in turtle, Histopathology was studied by artificial infection test, paraffin section and HE staining. The results showed that the main clinical signs of the infected sick turtle were conjunctivitis of the eye, ulceration of the oral and nasal skin; anatomy showed that the lungs were black, the intestinal tract was yellowish, with no content, and the water-like mucus increased. Histopathological observation showed the increase of pigment cells in eyelid epithelium, degeneration, necrosis and exfoliation of gastric and intestinal epithelial cells. The myocardial fibrils were widened, necrotic, and infiltrated with numerous inflammatory cells in the heart tissue. The boundary between pulmonary alveolar cells and vascular endothelial cells was unclear, and the alveolar wall had capillary congestion with Liver cell necrosis, central venous congestion, hepatic cord disorder, renal tubular epithelial cell necrosis, and glomerular hemorrhage. There was a large amount of inflammatory cell infiltration in muscle fiber space. The above results can provide some reference for elucidating the pathogenic mechanism ofdisease of turtle.

;disease; tissue pathology

1008-5394（2020）02-0044-04

10.19640/j.cnki.jtau.2020.02.010

S947.9

A

2019-05-23

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201810061036）；天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（18JCYBJC29900）；天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（ITTFRS2017009）；天津農(nóng)學(xué)院綜投平臺(tái)項(xiàng)目（J01009030638）；天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（TJAE201803）

羅福麗（1995-），女，碩士在讀，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物微生物與免疫學(xué)研究。E-mail：1838684865@qq.com。

呂愛軍（1973-），男，教授，博士，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物微生物與免疫學(xué)研究。E-mail：lajand@126.com。

責(zé)任編輯：張愛婷