譚永佳 高翠芳 陳學(xué)林

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

細(xì)葉亞菊(Ajaniatenuifolia(Jacq.) Tzvel.)為菊科(Asteraceae)亞菊屬(Ajania)的多年生草本植物。分布于我國甘肅、四川、西藏及青海，生于海拔2 000～4 580 m的山坡草地[1]。藏醫(yī)常用其來治療癰癤、腎病、肺病、蟲病、咽喉病、潰瘍病、炭疽病，藥用部位為該植物的地上部分[2]，主要藥用成分為綠原酸，用于抗腫瘤、抗菌消炎、抗心血管疾病、抗氧化降血糖[3～4]。近年來隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)葉亞菊在抗氧化、抗紫外輻射損傷、抗白色念菌方面有效，其乙醇提取物具有良好的抗氧化生物活性，其揮發(fā)油具有生化他感作用可分離出多種他感化合物，可對周邊植物的生長發(fā)育產(chǎn)生抑制作用，除此以外細(xì)葉亞菊揮發(fā)油還具有多種抗菌消毒、鎮(zhèn)咳平喘功能的大量香料[2,5～8]。細(xì)葉亞菊揮發(fā)油的主要成分為樟腦，桉葉油素，α-蒎烯，莰烯，(-)-4-萜品醇等[5,7]，均具有廣泛的應(yīng)用前景。α-蒎烯，(-)-4-萜品醇是一種香氣成分，可用于食用香精的調(diào)配[9～10]。已有文獻(xiàn)報(bào)道樟腦具有興奮，強(qiáng)心，消炎，鎮(zhèn)痛，抗菌，促滲等多種作用，可用于心臟衰弱，虛脫等疾病突發(fā)時(shí)的急救，也可用于關(guān)節(jié)痛，神經(jīng)疼痛及跌打損傷，還可作為經(jīng)皮給藥的促滲劑、趨避劑、抗?jié)M藥物等[11]。桉葉油素，α-蒎烯，莰烯，(-)-4-萜品醇是具有殺蟲作用的活性單體，可作為殺蟲劑使用[12～13]。研究發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育期的細(xì)葉亞菊揮發(fā)油的成分和含量有很大差異[5]，但關(guān)于不同海拔細(xì)葉亞菊揮發(fā)油成分及含量的比較研究未見報(bào)道。因此，本研究采集甘肅省不同地區(qū)海拔差異較大的5個(gè)均為花期的居群，用水蒸餾法提取揮發(fā)油，通過GC-MS分析成分和含量，探究在不同海拔區(qū)生長的細(xì)葉亞菊揮發(fā)油之間成分和含量的差異及海拔對揮發(fā)油成分的影響，為合理的開發(fā)甘肅省細(xì)葉亞菊資源提供理論依據(jù)。

1 材料

材料：2018年9月分別在碌曲縣郎木寺鎮(zhèn)(S1)、景泰壽鹿山(S2)、榆中興隆山(S3、S4)、平?jīng)隽P山(S5)采集細(xì)葉亞菊地上部分，經(jīng)西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳學(xué)林教授鑒定為亞菊屬植物細(xì)葉亞菊，海拔間隔為200～500 m，采集地點(diǎn)及海拔經(jīng)緯見表1。

表1 不同海拔地區(qū)樣品采集地點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)儀器：安捷倫7890B氣相色譜儀(美國安捷倫技術(shù)公司)與安捷倫5977A質(zhì)量檢測器(美國安捷倫技術(shù)公司)；電子天平FA2004B(上海精科物理光學(xué)儀器有限公司)；水蒸餾裝置；DRT-TW型調(diào)溫電熱套(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取

采集新鮮細(xì)葉亞菊植物地上部分，陰干2 d，剪碎，稱取100 g置于1 000 mL圓底燒瓶中，通過水蒸氣蒸餾法提取其中揮發(fā)油，蒸餾6 h后在油水分離器中得到油狀液體，冷卻0.5 h后讀取揮發(fā)油體積并收集于玻璃瓶內(nèi)，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 揮發(fā)油化學(xué)成分分析

色譜條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；注射器溫度為250℃；初始溫度60℃保持1 min，然后將柱溫以42℃·min-1升高至180℃并保持1 min；最后將柱溫以20℃·min-1升高至260℃并保持15 min。將樣品(1 μL，用正己烷稀釋)注入氣相色譜儀，分離比為1∶10。載氣：氦氣，流速為1.0 mL·min-1。質(zhì)譜條件：離子源溫度為230℃，光譜掃描范圍為20～550 m/z，掃描速度為2次/s。數(shù)據(jù)處理與質(zhì)譜檢索：用EI質(zhì)譜和保留數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)物或Wiley Mass.al Database(2001年版)中的化合物進(jìn)行比較，以鑒別化合物的成分。經(jīng)峰面積歸一法計(jì)算各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.3 揮發(fā)油的物理性質(zhì)

細(xì)葉亞菊經(jīng)水蒸氣蒸餾得到透明的油狀液體，具有濃郁香味。隨海拔從低到高，揮發(fā)油的顏色依次為深藍(lán)色、淺藍(lán)色、淺黃色、淺綠色、淡綠色。

2.4 揮發(fā)油得率與海拔高度的關(guān)系

植物精油的含量受多種因素影響。在一些其他的研究中，有的海拔高度和精油的產(chǎn)油率和產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)[14]；有的海拔高度和精油的產(chǎn)油率和產(chǎn)量呈正相關(guān)[15～16]。祁連圓柏?fù)]發(fā)油得率隨海拔高度的升高而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢[17]。本研究中5個(gè)海拔細(xì)葉亞菊揮發(fā)油得率依次為0.8%，0.7%，0.2%，1.0%，0.5%，含量隨海拔高度的升高總體呈先降低再升高再降低的趨勢。在張畢陽[5]的研究中，成長期6月與花果期9月的細(xì)葉亞菊所含揮發(fā)油分別為0.949%、0.619%，不同生長時(shí)期揮發(fā)油含量不同。本研究中細(xì)葉亞菊均為開花期采摘，但采集地區(qū)海拔不同，揮發(fā)油得率差異較大，最高為1%最低為0.2%。本實(shí)驗(yàn)5個(gè)揮發(fā)油得率與張畢陽的研究結(jié)果相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這種差異可能是由采集地海拔、日照、土壤、降雨量不同造成的，揮發(fā)油是植物次生代謝物質(zhì)，從生態(tài)角度來講環(huán)境因素可對植物次生代謝產(chǎn)生一定的影響，揮發(fā)油組分及含量會(huì)隨著環(huán)境變化而變化。

表2 揮發(fā)油的化學(xué)成分及相對含量

2.5 揮發(fā)油的成分分析

由表2可知5個(gè)海拔高度下細(xì)葉亞菊揮發(fā)油共鑒定出了49種化合物，各海拔分別鑒定出25，28，24，24，21種化合物。各海拔相同的成分有5種，5個(gè)海拔揮發(fā)油中有4個(gè)含有的組分有9種，3個(gè)含有的化合物有7種。5個(gè)海拔任意2個(gè)海拔揮發(fā)油成分的共有成分?jǐn)?shù)量的區(qū)間為10～16種。已有其他研究者在細(xì)葉亞菊揮發(fā)油中分別鑒定出了49、38種化合物[5,7]。這7個(gè)不同地域采集的細(xì)葉亞菊揮發(fā)油所鑒定的化合物相同的僅有4種，樟腦、α-蒎烯、(-)-4-萜品醇和桉葉油素，本實(shí)驗(yàn)所測得α-蒎烯、(-)-4-萜品醇的含量均低于甄潤德[7]所測含量，桉葉油素含量均高于其他人的研究結(jié)果，樟腦含量均高于張畢陽[5]所測含量。揮發(fā)油成分在不同海拔含量不同，且隨海拔升高部分成分含量變化沒有規(guī)律性，但隨著海拔高度的增加揮發(fā)油中的一些成分的含量，如檜烯、桃金娘烯醛、乙酸龍腦酯的含量逐漸下降，β-水芹烯的含量逐漸升高。一些成分在不同海拔含量差異較大，如冰片的含量最高值是最低值的16.8倍，α-水芹烯為23倍；樟腦為25.8倍?？梢钥闯黾?xì)葉亞菊揮發(fā)油成分和含量受環(huán)境因素的影響較大。揮發(fā)油成分及含量的這些差異可能是不同地區(qū)海拔下，光照、溫度、濕度不同造成的。

5個(gè)海拔的揮發(fā)油均含有單萜類、含氧單萜類、倍單萜類成分，除了最高海拔(3 540 m)其他4個(gè)海拔揮發(fā)油均含有含氧倍單萜類成分，其中含氧單萜類成分占主要成分，主要為桉葉油素和樟腦。與其他海拔相比中海拔(2 804 m)和最高海拔的含氧單萜類成分含量較低，中海拔的單萜類成分、倍單萜類成分、含氧倍單萜類成分含量高于其他海拔，但這兩個(gè)海拔主要成分中的鄰-異丙基苯、4-(異丙基)-1-甲基環(huán)己-2-烯-1-醇、辣薄荷醇不屬于這4類成分。已有很多研究表明萜類成分有良好的應(yīng)用前景，如單萜的氣管擴(kuò)張和抗變態(tài)反應(yīng)作用及化感作用[18～19]，環(huán)狀含氧單萜良好的透皮吸收促進(jìn)作用[20]等。

本研究5個(gè)海拔相對含量2%以上的化合物分別有7、9、9、8、8種，占揮發(fā)油總量的83.76%、84.41%、77.55%、91.53%、84.07%。在其他測定細(xì)葉亞菊揮發(fā)油成分的研究中，甄潤德[7]鑒定的化合物相對含量在2%以上的化合物共有8種，占揮發(fā)油總量的82.782%，張畢陽[5]鑒定的化合物相對含量在2%以上的化合物共有11種，占揮發(fā)油總量的40.039%。這種差異可能是采摘地生態(tài)環(huán)境不同造成的。

由表3可知，共有成分在各海拔含量各異，α-蒎烯在中高海拔(3 026 m)含量最高，β-蒎烯和桉葉油素在最高海拔(3 540 m)含量最高，(-)-4-萜品醇在最低海拔(2 171 m)含量最高，樟腦在中低海拔(2 419 m)含量最高。共有成分相對含量之和各占其揮發(fā)油總量的49.85%、62.84%、28.13%、77.89%、48.06%，中高海拔含量最大值為中海拔最小值的2.7倍，含量差異較大，但最高海拔與最低海拔含量接近，中高海拔與中低海拔含量接近。

表3 不同海拔高度揮發(fā)油的共有成分

Table 3 Common constituents of volatile oils at different altitudes

海拔高度Altitude(m)共有化合物相對含量Common compound relative content(%)α-蒎烯α-Pineneβ-蒎烯β-Pinene桉葉油素Eucalyptol(-)-4-萜品醇(-)-Terpinen-4-ol樟腦Camphor合計(jì)Total(%)21710.470.6135.34.838.6449.8524191.390.4417.491.6341.8962.8428040.951.713.531.1310.8128.1330263.180.9531.13.1538.5177.8935401.462.2939.293.41.6248.06

由表4可知，5個(gè)海拔的主要成分分別有3、3、5、2、3種，總含量占揮發(fā)油總量的68.21%、65.51%、64.99%、69.61%、67.24%，其中相同的只有桉葉油素，鄰-異丙基苯是中海拔揮發(fā)油的獨(dú)有且含量最高的成分，辣薄荷醇為最高海拔揮發(fā)油的獨(dú)有成分。本研究5個(gè)不同揮發(fā)油中含量最高的化學(xué)物質(zhì)按海拔低到高依次為桉葉油素(35.3%)、樟腦(41.89%)、鄰-異丙基苯(24.75%)、樟腦(38.51%)、桉葉油素(39.29%)，其中最高海拔與最低海拔成分相同且含量接近，中高海拔與中低海拔成分相同且含量接近。對于這些揮發(fā)油的部分主要成分已有大量的研究表明其具有廣泛的應(yīng)用前景。桉葉油素具有良好的殺蟲活性，可用于殺蟲劑的配制[12]。α-水芹烯是一種香氣成分，且具有顯著的趨避活性，可用于食用香精及驅(qū)蟲劑的制備[21～22]。樟腦和-(-)α-側(cè)柏酮分別具有抗菌，消炎，鎮(zhèn)痛，強(qiáng)心等作用[11,23]，冰片可抗菌抗炎止痛、促進(jìn)血腦屏障開放、保護(hù)腦缺血[24]，在臨床上均具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

表4 揮發(fā)油中相對含量5%以上的化合物

Table 4 Chemical constituents with relative content over 5% among the volatile oils

海拔高度Altitude(m)化合物Compound相對含量Relative quantity(%)合計(jì)Total(%)2171桉葉油素 Eucalyptol35.30樟腦 Camphor8.6468.21冰片 (-)-Borneol24.272419桉葉油素 Eucalyptol17.49(-)-α-側(cè)柏酮 (-)-α-Thujone6.1365.51樟腦 Camphor41.892804α-水芹烯 α-Phellandrene9.44鄰-異丙基苯 o-Cymene24.75桉葉油素 Eucalyptol13.5364.99樟腦 Camphor10.81大牛兒烯D Germacrene D6.463026桉葉油素 Eucalyptol31.10樟腦 Camphor38.5169.613540桉葉油素 Eucalyptol39.294-(異丙基)-1-甲基環(huán)己-2-烯-1-醇ρ-Menth-2-en-1-ol17.2767.24辣薄荷醇 Cis-piperitol10.68

2.6 相關(guān)性分析

運(yùn)用SPSS 22.0軟件對5個(gè)揮發(fā)油中共有成分作含量與海拔高度的相關(guān)性分析，α-蒎烯含量與海拔高度的相關(guān)系數(shù)為-0.008，P=0.995>0.05；β-蒎烯含量與海拔高度的相關(guān)系數(shù)為0.730，P=0.479>0.05；桉葉油素含量與海拔高度的相關(guān)系數(shù)為0.923，P=0.252>0.05；(-)-4-萜品醇含量與海拔高度的相關(guān)系數(shù)為0.952，P=0.199>0.05，樟腦含量與海拔高度的相關(guān)系數(shù)為-0.548，P=0.631>0.05。說明這5種成分的含量與海拔高度并無顯著相關(guān)性。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中細(xì)葉亞菊揮發(fā)油的顏色、產(chǎn)率、組分及其含量在不同種源之間差異顯著。5個(gè)海拔揮發(fā)油共鑒定出了49種化合物，各海拔分別鑒定出25，28，24，24，21種化合物，這5個(gè)海拔植物揮發(fā)油主要成分相同的只有桉葉油素，且只有5個(gè)共有成分分別為樟腦、α-蒎烯、β-蒎烯、桉葉油素、(-)-4-萜品醇，含量有較大差異。揮發(fā)油提取率在0.2%～1.0%。揮發(fā)油成分除了最高海拔不含有含氧倍單萜類成分，其他海拔揮發(fā)油成分均含有單萜類、含氧單萜類、倍單萜類成分、含氧倍單萜類成分，其中含氧單萜成分含量最大，主要成分為桉葉油素和樟腦。在最低海拔、中低海拔、中高海拔中這些成分占揮發(fā)油總量的絕大部分(89.27%～92.89%)，而中海拔和最高海拔這些成分占揮發(fā)油總量比其他海拔少(57.74%、61.84%)。揮發(fā)油成分為次級代謝產(chǎn)物，它受到酶和基因以及初級代謝調(diào)節(jié)[25]，有很多研究表明光照、溫度、土壤、水分和性質(zhì)等環(huán)境因素可對植物揮發(fā)油的組分跟含量造成一定的影響[26～29]。濕度也是影響植物揮發(fā)油成分及含量的重要因子[30]。這些差異可能是由這些生態(tài)因素造成的。

本文揮發(fā)油從含量來看，海拔對共有成分含量無規(guī)律性影響。中低海拔和中高海拔地域細(xì)葉亞菊揮發(fā)油共有成分含量之和相近且含量較高，其地區(qū)采集的兩種植物揮發(fā)油成分中含量最高的均為樟腦；最低海拔和最高海拔次之，其地區(qū)采集的兩種植物揮發(fā)油成分中含量最高的均為桉葉油素；中海拔地域共有成分含量最低，其含量最高的成分為鄰-異丙基苯，且為獨(dú)有成分，但研究結(jié)果并沒有顯示出細(xì)葉亞菊揮發(fā)油的共有成分的含量與海拔之間有顯著的相關(guān)性。細(xì)葉亞菊揮發(fā)油的成分及含量受環(huán)境影響較大，本文研究發(fā)現(xiàn)海拔與共有成分含量之間的相關(guān)性并不顯著，具體影響因素及海拔高度與成分含量之間的規(guī)律還需進(jìn)一步的研究。本文通過研究不同海拔地區(qū)的細(xì)葉亞菊揮發(fā)油的成分和含量的差異，以及揮發(fā)油中共有成分含量與海拔的相關(guān)性，為以后細(xì)葉亞菊的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供參考。