李方舟，李 宇，張利坤，杜燁青，溫 飛，陳美杰，胡建宏*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

精子在保存過(guò)程中不斷代謝，會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子、過(guò)氧化物、ROS、NO等產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可使精子發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，嚴(yán)重影響精液保存質(zhì)量[1]。因此，稀釋液中常添加一些高效抗氧化劑，以抑制精子脂質(zhì)氧化程度，減少精子損傷。葡萄籽原花青素是植物來(lái)源中至今發(fā)現(xiàn)抗氧化性最高的物質(zhì)之一。劇紅梅等[2]報(bào)道稱，葡萄籽原花青素參與了磷酸與花生四烯酸的代謝過(guò)程、蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)，因而能夠降低細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度，從而減少細(xì)胞損傷；金文泉[3]研究表明，葡萄籽原花青素的抗氧化性可達(dá)VC的20倍、VE的50倍，可有效清除羥基自由基、超氧陰離子自由基。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)試劑 精液基礎(chǔ)稀釋液(詳見(jiàn)1.3.1稀釋液配制)、葡萄籽原花青素、碘化丙啶(PI)、羅丹明123、姬姆薩染液、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒。

1.1.2 精液樣品的采集 試驗(yàn)精液來(lái)源于西北農(nóng)林科技大學(xué)畜禽生態(tài)養(yǎng)殖場(chǎng)的西農(nóng)薩能奶山羊。公羊年齡2～3歲，體況良好且無(wú)生殖系統(tǒng)疾病。采精完畢后，先根據(jù)顏色、氣味選擇正常精液放入保溫杯中，1 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。37 ℃下顯微鏡鏡檢，選擇精子活率≥0.8 的精液用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組，四個(gè)試驗(yàn)處理組。空白組為基礎(chǔ)稀釋液，四個(gè)處理組在基礎(chǔ)稀釋液中分別添加濃度10、30、50、70 mg/L的葡萄籽原花青素。將空白組及各處理組稀釋液稀釋精液后于4 ℃冰箱低溫保存。于0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d檢測(cè)精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率；第0 d、1 d、3 d、5 d檢測(cè)精子線粒體活性；1 d、3 d、5 d檢測(cè)精子T-AOC、MDA。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 稀釋液配制 基礎(chǔ)稀釋液配制：葡萄糖1.15 g，D-果糖1.45 g，PVA 0.25 g，EDTA 0.23 g，檸檬酸鈉1.17 g，碳酸氫鈉0.125 g，100 mL雙蒸水溶解。青霉素10萬(wàn)IU，鏈霉素10萬(wàn)IU，卵黃20%現(xiàn)用現(xiàn)配。抗氧化劑添加：將基礎(chǔ)稀釋液分為5組，向每組稀釋液中分別添加濃度0、10、30、50、70 mg/L的葡萄籽原花青素，在37 ℃水浴鍋水浴30 min。水浴后室溫冷卻，放置4 ℃冰箱中低溫保存。

1.3.2 精液的稀釋 采精前將卵黃、抗生素分別加入各試驗(yàn)組稀釋液中，封好口，置于37 ℃水浴鍋中保溫。采精后，將檢查合格的精液平均分為5份，再分別按照精液：稀釋液=1∶8的比例同溫稀釋。采取逐漸稀釋法進(jìn)行(操作時(shí)須把稀釋液沿著管壁緩慢加入到各組精液中)，先用精液和稀釋液1∶1 稀釋(搖勻)，進(jìn)一步再做精液與混合液1∶3 稀釋(搖勻)，使精液和稀釋液比例最終達(dá)到1∶8。稀釋結(jié)束后檢測(cè)各組精液質(zhì)量指標(biāo)(0 d)，然后用厚毛巾包裹盛有稀釋后精液的離心管，放入4 ℃冰箱保存。保存過(guò)程中注意每隔12 h輕搖精液，防止精液沉積在離心管底部；每24 h從各試驗(yàn)組取樣檢測(cè)保存后相關(guān)指標(biāo)。

1.4 精液質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 精子活率測(cè)定 輕搖精液混勻，用移液槍吸取精液 1 mL于離心管中，放入水浴鍋中緩慢升溫至37 ℃，37 ℃下再水浴1 min，然后吸取精液10 μL滴到載玻片(有37 ℃恒溫加熱板)上，制片，用顯微鏡觀察5個(gè)視野的精子直線運(yùn)動(dòng)狀況，各視野至少保證有200個(gè)精子，記錄數(shù)據(jù)。

1.4.2 質(zhì)膜完整率測(cè)定 用分析天平按照檸檬酸鈉濃度 7.35 g/L、果糖濃度13.5 g/L，準(zhǔn)確稱取檸檬酸鈉和果糖，然后溶于雙蒸水中，制成檸檬酸鈉-果糖低滲溶液。分別將各組稀釋后保存的精液1 mL，與9 mL 低滲液混合，置于37 ℃水浴鍋中水浴30 min，注意水浴期間需要輕晃試管，避免精子沉積。水浴結(jié)束后，吸取15 μL精液，滴于載玻片制片。顯微鏡下先于40倍下找到精子，后于400倍下觀察精子彎尾現(xiàn)象，計(jì)算彎尾率(觀察重復(fù)5次，每次不少于200個(gè)精子)。

1.4.3 頂體完整率測(cè)定 用姬姆薩染色法進(jìn)行精子頂體完整率檢測(cè)。從各試驗(yàn)組吸取精液30 μL，滴于載玻片上制片，使其風(fēng)干5 min；然后吸取福爾馬林溶液滴于風(fēng)干的精液上，并要完全覆蓋；30 min后將載玻片置于蒸餾水下，沖洗，再風(fēng)干；再吸取姬姆薩溶液滴對(duì)精子染色，2 h后用蒸餾水洗去多余浮色，再次風(fēng)干；最后將載玻片置于1000倍顯微鏡下鏡檢，觀察頂體狀態(tài)并計(jì)算精子頂體完整率，共觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野精子數(shù)不少于200個(gè)。

1.4.4 線粒體活性測(cè)定 將1 μL PI 貯存液和1 μL Rh123 貯存液混合放入試管，避光靜置10 min，將精液用等溫稀釋液稀釋，調(diào)整精子密度。然后移液槍吸取50 μL精子加入上述避光放置的PI + Rh123 混合液中，靜置30 min，吸取10 μL 滴于載玻片，置于熒光顯微鏡(400×)下觀察檢測(cè)，各試驗(yàn)組重復(fù)觀察五個(gè)視野，每個(gè)視野至少有200個(gè)精子。

1.4.5 T-AOC、MDA測(cè)定 T-AOC與MDA的檢測(cè)采用南京建成生物科公司的試劑盒進(jìn)行。按說(shuō)明書操作，分別測(cè)定空白對(duì)照組與不同濃度蘋果多酚試驗(yàn)組與不同濃度葡萄籽原花青素試驗(yàn)組的精液在1、3、5 d時(shí)的T-AOC和MDA值，記錄數(shù)值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所記錄數(shù)值用SPSS 22.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)算各試驗(yàn)組中數(shù)據(jù)的顯著性，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示，P<0.05代表差異顯著，P>0.05代表差異不顯著，每個(gè)試驗(yàn)組5個(gè)重復(fù)。T-AOC、MDA畫圖用origin軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄籽原花青素對(duì)低溫保存的山羊精子活率的影響

根據(jù)表1可知，葡萄籽原花青素濃度為10、30、50 mg/L的處理組均可不同程度提高山羊精子活率。濃度為30 mg/L的處理組中精子活率最高，在2、3、4、5 d時(shí)均顯著高于其余各組(P<0.05)。50 mg/L處理組次之，在3、4、5 d時(shí)均顯著高于除30 mg/L組外的其他組(P<0.05)。70 mg/L處理組效果最差，1、2、3、4 d均顯著低于其他處理組(P<0.05)。

表1 葡萄籽原花青素對(duì)低溫保存的山羊精子活率的影響

注：同行數(shù)據(jù)中小寫字母不同代表差異顯著(P<0.05)，相同代表差異不顯著(P>0.05))。下同。

Note:Different lowercase superscripts in the same row indicate significant difference(P<0.05),same letter superscripts in the same row indicate insignificant difference(P>0.05).The same blow.

2.2 葡萄籽原花青素對(duì)低溫保存的山羊精子質(zhì)膜完整率的影響

根據(jù)表2可知，葡萄籽原花青素濃度為10、30、50、70 mg/L的處理組中山羊精子質(zhì)膜體完整率均大于空白對(duì)照組。其中30 mg/L處理組精子質(zhì)膜完整率最高，其在保存后2、3、4、5 d顯著高于50 mg/L處理組之外的其余各組(P<0.05)。

2.3 葡萄籽原花青素對(duì)低溫保存的山羊精子頂體完整率的影響

由表3可知，在3、4、5 d時(shí)葡萄籽原花青素濃度為10、30、50、70 mg/L的處理組中精子頂體完整率均顯著大于空白對(duì)照組(P<0.05)。其中30 mg/L處理組對(duì)精子頂體完整率提高的效果最好，其在保存中后期(3、4、5 d)顯著高于其余各組(P<0.05)。

表2 葡萄籽原花青素對(duì)低溫保存的山羊精子質(zhì)膜完整率的影響

表3 葡萄籽原花青素對(duì)低溫保存的山羊精子頂體完整率的影響

2.4 葡萄籽原花青素對(duì)低溫保存的山羊精子線粒體活性的影響

根據(jù)表4可知，葡萄籽原花青素濃度為10、30、50、70 mg/L的處理組中精子線粒體活性都較對(duì)照組有所提升。其中30 mg/L處理組中精子線粒體活性最好，在3、5 d時(shí)均顯著高于其余各組(P<0.05)。50 mg/L 處理組次之，5 d時(shí)顯著高于除30 mg/L外其他各組(P<0.05)。

2.5 蘋果多酚與葡萄籽原花青素對(duì)低溫保存的山羊精子T-AOC的影響

葡萄籽原花青素濃度30 mg/L處理組的精子T-AOC最高，在保存期間均顯著高于其余各組(P<0.05)，50 mg/L處理組次之，T-AOC在保存期間顯著高于除30 mg/L之外各試驗(yàn)組(P<0.05)。其他各組之間在保存3、5 d時(shí)均有顯著差異，精子T-AOC含量由高到低為50 mg/L>10 mg/L>70 mg/L>0 mg/L。

2.6 蘋果多酚與葡萄籽原花青素對(duì)低溫保存的山羊精液MDA含量的影響

葡萄籽原花青素濃度10、30、50、70 mg/L處理組的精液MDA含量，在保存期間均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)其中30 mg/L處理組的精液MDA含量最低，在保存期間均顯著低于其余各組(P<0.05)。

表4 葡萄籽原花青素對(duì)低溫保存的山羊精子線粒體活性的影響

圖2 葡萄籽原花青素對(duì)低溫保存的山羊精液MDA含量的影響

3 討 論

在低溫保存過(guò)程中，精子會(huì)隨著保存時(shí)間的逐漸變長(zhǎng)而產(chǎn)生大量的自由基。自由基是一種能獨(dú)立存在的活潑的化學(xué)實(shí)體，常見(jiàn)的有超氧陰離子自由基、羥自由基、一氧化氮自由基等[4]。在機(jī)體內(nèi)，自由基對(duì)生物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞程序性死亡、細(xì)胞分化分裂等具有重要作用。但活性氧自由基一旦過(guò)量時(shí)，則會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激，損傷細(xì)胞蛋白與細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，還會(huì)導(dǎo)致基因突變，加速細(xì)胞死亡[5]。生物膜中脂質(zhì)部分包含有大量不飽和脂肪酸，自由基對(duì)不飽和脂肪酸上的氫有很強(qiáng)的攻擊性；另外，一些金屬離子如Fe2+等會(huì)促進(jìn)氧化作用，這些因素使得細(xì)胞膜很容易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[6]。因此，精液保存過(guò)程中，當(dāng)ROS大量積累超過(guò)一定濃度后，會(huì)攻擊含有大量不飽和脂肪酸的精子膜，使精子發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。同時(shí)，ROS 也會(huì)攻擊頂體膜，使頂體酶提前釋放而不能進(jìn)行頂體反應(yīng)，降低受精率，嚴(yán)重影響精子保存質(zhì)量[7-8]。

原花青素是普遍存在于植物中的一類有強(qiáng)大清除自由基能力的物質(zhì)，而葡萄籽是原花青素的較好來(lái)源[9]。本試驗(yàn)通過(guò)向低溫保存稀釋液中添加葡萄籽原花青素，檢測(cè)保存過(guò)程中精子各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)，結(jié)果顯示山羊精液品質(zhì)得到顯著提高，這表明葡萄籽原花青對(duì)低溫保存的山羊精子具有保護(hù)作用，這可能與葡萄籽原花青素的結(jié)構(gòu)及其保護(hù)機(jī)理有關(guān)。一方面，葡萄籽原花青素屬于斷鏈型抗氧化劑，在反應(yīng)鏈進(jìn)行過(guò)程中，其結(jié)構(gòu)中的酚羥基會(huì)在氧化后釋放，優(yōu)先與自由基進(jìn)行結(jié)合，使自由基惰化而終止反應(yīng)，減少脂質(zhì)受損[10]；另一方面，葡萄籽原花青素可與有金屬螯和，從而減少氧化反應(yīng)發(fā)生[11]。孫蕓等[12]在評(píng)價(jià)葡萄籽原花青素的抗氧化效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，其抗氧化效果比VC、VE強(qiáng)數(shù)倍。郭英等[13]在大鼠離體組織中做葡萄籽原花青素抗氧化性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠組織中MDA含量明顯下降。另有研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素可有效提高細(xì)胞中SOD、CAT活性[14-15]。Busserolles等[16]在大鼠飼養(yǎng)中飼喂了葡萄籽原花青素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠的血漿中T-AOC明顯增強(qiáng)。上述研究均與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

本試驗(yàn)中，葡萄籽原花青素的最適添加濃度為30 mg/L。孫艷青[17]在豬凍精保存中探索葡萄籽原花青素的添加濃度，結(jié)果表明葡萄籽原花青素最佳添加濃度為40 mg/L。劉斌[18]在豬精液常溫保存中添加不同濃度葡萄籽原花青素，結(jié)果最適濃度為50 mg/L。上述研究雖然都證實(shí)葡萄籽原花青素對(duì)精子保存有著顯著的改善作用，但最適添加濃度與本研究均有所不同，發(fā)生這一現(xiàn)象的原因可能在于，一是保存方式與稀釋液成分的不同。本試驗(yàn)中，精液的保存方式分別為常溫保存、低溫保存、冷凍保存。其中常溫保存稀釋液中添加的成分相對(duì)較少，也缺少抗凍保護(hù)劑[19]。低溫保存會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生一定的冷打擊，稀釋液成分中也含有其他保護(hù)物質(zhì)，對(duì)精子同樣會(huì)產(chǎn)生影響。而精液冷凍保存過(guò)程最為復(fù)雜，除了常規(guī)稀釋外，還需離心去漿、冷凍、升溫等多項(xiàng)操作，同時(shí)稀釋液成分也更加復(fù)雜，常包含多種抗凍保護(hù)劑[20]。不同的保存方式與稀釋液配方均會(huì)對(duì)精液保存產(chǎn)生很大的影響，因而造成結(jié)果不統(tǒng)一。二是本試驗(yàn)與其余二者研究對(duì)象不同，而不同動(dòng)物精液受不同抗氧化劑的影響不同，因此導(dǎo)致最適添加量略有差異。

4 結(jié) 論

在基礎(chǔ)液中添加一定濃度的葡萄籽原花青素，可以有效提高山羊精液低溫保效果，其適宜添加濃度為30 mg/L。