趙宏 王玉迎 趙良娟 宓捷波 趙化冰 張峰 馮峰 曾靜 王洪彬 董志珍

摘要采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的靶向分析技術(shù)，通過檢測食源性致病菌金黃色葡萄球菌水解生成的特征肽，實現(xiàn)食品中致病菌的高效檢測。針對文獻(xiàn)報道的金黃色葡萄球菌的9種候選特征肽，驗證了這些特征肽的靶向分析方法，考察和比較了分析效能。結(jié)果表明，基于多反應(yīng)監(jiān)測模式的靶向分析方法靈敏度高，更適于特征肽的檢測; 確定了每個特征肽最佳的碎片離子質(zhì)量，進(jìn)一步的生物樣品分析結(jié)果表明，I1（AYLAVPAAPK）、I2（DYNSPTLIGWVK）、I5（AGYTVNNTPK）和I6（SISSGYTSGR）更適合作為金黃色葡萄球菌的候選特征肽。本研究為大規(guī)模驗證候選特征肽的鑒定效果奠定了基礎(chǔ)，為特征肽檢測策略在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用提供了參考。

關(guān)鍵詞食源性致病菌; 金黃色葡萄球菌; 特征肽; 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

1引 言

食源性致病菌嚴(yán)重威脅人類健康與公共衛(wèi)生安全。食源性致病菌可以在宿主體內(nèi)繁殖，并表達(dá)毒力因子，進(jìn)而損傷機(jī)體健康。盡管公共衛(wèi)生水平在不斷提高，但時至今日食源性致病菌引起的疾病仍頻發(fā)[1，2]。建立準(zhǔn)確高效的檢驗檢疫方法，對于食源性致病菌危害的控制、食品安全監(jiān)管和保障人民身體健康極其重要。

金黃色葡萄球菌是一種典型的食源性致病菌，常用的檢測方法有凝固酶法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、熒光PCR法等。凝固酶方法基于致病性葡萄球菌產(chǎn)生的凝固酶與纖維蛋白原反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀實現(xiàn)檢測[3]，該方法存在靈敏度低、生物危險性大、成本高、制劑有限等缺點(diǎn)。酶聯(lián)免疫法可以通過金黃色葡萄球菌腸毒素與抗體的相互作用實現(xiàn)快速檢測[4]，該方法常由于檢測樣本中所含無關(guān)抗原，造成假陽性結(jié)果， 并且檢測成本偏高。 PCR方法[5，6]的特異性好，檢測速度快，然而這種基于靶標(biāo)的方法局限于特定的引物，被檢產(chǎn)品中的擴(kuò)增抑制因子也會干擾檢測結(jié)果。另外，遺傳突變等修飾的細(xì)菌可能產(chǎn)生假陽性或陰性結(jié)果。最近，Ward等[7]基于一次性絲網(wǎng)印刷碳電極的電化學(xué)阻抗傳感器實現(xiàn)了低濃度金黃色葡萄球菌的快速檢測，但該方法依賴于特定種屬的特征信號。因此，發(fā)展快速、準(zhǔn)確的檢測金黃色葡萄球菌的方法具有重要意義。

隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOF MS）已被廣泛用于菌種的快速鑒定[8，9]，其在分析速度和易用性方面具有優(yōu)勢，但仍然依賴于菌落的分離和樣品純度。高效液相色譜電噴霧三重四極桿質(zhì)譜（HPLCESI/QQQ MS）在多反應(yīng)檢測模式（MRM）下，由于對母離子和子離子的靶向選擇，可實現(xiàn)極低濃度目標(biāo)物的超高靈敏檢測和定量分析，該技術(shù)在食品檢疫中常被用于檢測農(nóng)藥殘留和非法添加等[10，11]。理論上，采用該技術(shù)對致病微生物中的特征多肽序列進(jìn)行檢測[12]，可實現(xiàn)致病微生物的靈敏檢測。KruhGarcia等[13]采用LCMS/MS對結(jié)核病人血清中活性結(jié)核菌的Mtb蛋白特征肽進(jìn)行靶向分析，揭示了可用于診斷結(jié)核病的潛在生物標(biāo)記物。Jamnongkan等[14]通過MRM模式比較膽管癌（CCA）患者和正常人的血清的差異肽，發(fā)現(xiàn)了4種可用于臨床預(yù)防及診斷的糖蛋白。Rees等[15]利用LCMS/MS的MRM模式檢測金黃色葡萄球菌噬菌體K，評價了金黃色葡萄球菌對克林霉素和頭孢西丁的抗藥性。Charretier等[15]采用靶向LCMS/MS檢測特征肽的方法，對臨床樣品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行菌種鑒定，并對抗生素抗性和毒力進(jìn)行了評估;通過文獻(xiàn)比對和軟件預(yù)測篩選出候選的特征肽，并對其使用效果進(jìn)行了考察，證明了通過靶向分析特征肽檢測金黃色葡萄球菌的可行性。但是，目前尚缺乏對上述策略進(jìn)行驗證和評估的研究報道。將該方法和策略拓展到食品中致病微生物的檢測具有重要意義。

建立候選特征肽的靶向分析方法，并考察和比較多種候選特征肽用于菌株鑒定的分析效能，對于基于特征肽檢測食源性致病菌的研究至關(guān)重要。本研究考察了非靶向分析方法對金黃色葡萄球菌的候選特征肽的檢測效果，建立了基于多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式的靶向分析方法，比較和評價了不同候選特征肽的檢測效能，為通過特征肽檢測食源性致病菌建立方法學(xué)基礎(chǔ)。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

UPLCQExactive 超高效液相色譜四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜 （美國賽默飛世爾科技公司）; Triple QuadTM 4500 UPLCMS/MS液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國SCIEX公司）; JY92IIDN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）; MilliQ Advantage A10超純水制備系統(tǒng)（美國密理博公司）。 乙腈（色譜純，天津康科德科技公司）; 甲酸（色譜純，德國Sigma公司）; NaCl和NH4HCO3（分析純，天津博歐特化工貿(mào)易有限公司）; 蛋白胨和酵母提取物（英國Oxoid公司）。

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 43300和ATCC 25923來自天津海關(guān)動植物與食品檢測中心。9條候選特征肽（純度≥98%），由南京杰肽生物科技有限公司合成，詳細(xì)信息見表1。

2.2實驗方法

2.2.1金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)金黃色葡萄球菌ATCC 43300和ATCC 25923采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（1% 蛋白胨，0.5% NaCl，0.3% 牛肉膏，2% 瓊脂），在37℃培養(yǎng)24 h。

2.2.2樣品前處理用接種環(huán)刮取培養(yǎng)皿上生長的菌落，懸浮在2 mL生理鹽水（0.85% NaCl）中。取1 mL， 以8000 r/min離心15 min，沉淀重懸于200 μL緩沖液（50 mmol/L NH4HCO3，pH 8.0）中，離心洗滌一次。將細(xì)菌重懸（100 μL 50 mmol/L NH4HCO3， 10 mmol/L DTT，pH 8.0），超聲破碎5 min。8000 r/min離心，取上清液，在室溫、避光條件下，使用25 mmol/L碘乙酰胺進(jìn)行烷基化。按蛋白量與胰蛋白酶質(zhì)量比25∶1添加胰蛋白酶，在50℃水浴消化15 min[16]。用0.5 μL甲酸酸化樣品終止胰蛋白酶消化。消化后的樣品直接分析，或在Symbolm@@20℃下儲存，待分析。

2.2.3非靶向蛋白質(zhì)組分析采用UPLCQ Exactive對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 43300和ATCC 25923進(jìn)行非靶向蛋白質(zhì)組鑒定分析，再通過Mascot軟件鑒定蛋白質(zhì)種類。

液相色譜條件： Vydax C18色譜柱（150 mm× 2.1 mm，5 μm）; 流速0.2 mL/min; 進(jìn)樣量10 μL; 流動相A為水，流動相B為乙腈，均含0.1 %甲酸。洗脫程序： 0～5 min，5% B; 5～30 min，5%～40% B; 30～40 min，95% B。

質(zhì)譜條件： 加熱電噴霧離子源（HESI）; 正離子模式; 采用全掃描模式，粒子范圍： m/z 300～1500; 分辨率70000; Ctrap最大容量（AGC target）： 100000; Ctrap最大注入時間： 100 ms; 鞘氣速度： 40 arb; 輔助氣流速： 3 arb; 噴霧電壓： 3.5 kV; 毛細(xì)管溫度： 300℃。

Mascot軟件鑒定蛋白質(zhì)條件： 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫選擇SwissProt，蛋白酶種類選擇胰蛋白酶，最大漏切位點(diǎn)1個，固定修飾選擇Carbamidomethyl（C），可變修飾選擇Oxidation（M），分子量誤差： 1.2 Da; 電荷類型選擇1+，2+，3+。

2.2.4LCESI/QQQ的MRM模式靶向分析采用Triple QuadTM 4500 UPLCMS/MS系統(tǒng)對候選特征肽進(jìn)行MRM靶向分析。

色譜條件： Vydax C18色譜柱（150 mm×2.1 mm， 5 μm）; 流速0.3 mL/min; 進(jìn)樣量2 μL; 流動相A相為0.1 %甲酸溶液，B相為含0.1 %甲酸的乙腈溶液。洗脫程序為，0～3 min，2% B; 3～20 min， 2%～45.5% B。

質(zhì)譜條件： 采用正離子模式和MRM模式; Turbo V離子源霧化溫度： 550℃; 離子噴霧電壓： 5500 V; 幕簾氣流： 172.2 kPa; 碰撞氣流： 68.3 kPa; GS1（Ion source gas 1）霧化氣流： 413.7 kPa; GS2（Ion source gas 2）輔助氣流： 379.2 kPa; MRM分析方法詳見表1。

3結(jié)果與討論

理想的致病微生物特征肽，能夠嚴(yán)格區(qū)分目標(biāo)微生物菌株與其它種屬的微生物菌株。依靠單一肽很難滿足該要求，需要綜合使用多個特征肽進(jìn)行鑒定。本研究考察的金黃色葡萄球菌的9種候選特征肽I1～I(xiàn)9（表1），由計算機(jī)消化和預(yù)測而獲得[16]，來自文獻(xiàn)報道的金黃色葡萄球菌的7種特征蛋白質(zhì)。其中，I1和I2來源于金黃色葡萄球菌雙功能自溶素（Bifunctional autolysin）[17]，該蛋白在細(xì)胞分裂周期結(jié)束時切開連接子細(xì)胞的肽聚糖，對菌體增殖有重要意義; I3來源于毒力因子EsxA（Virulence factor EsxA）[18]，I5、I6來源于與毒力相關(guān)的葡萄球菌分泌抗原ssaA2（Staphylococcal secretory antigen ssaA2）[18]，其對宿主感染的建立起重要作用; I4來源于核糖體蛋白L20（50S ribosomal protein L20）[19]，該蛋白直接與23S核糖體RNA結(jié)合，是50S核糖體亞基體外組裝的必要條件，參與翻譯過程; I7來源于磷酸丙糖異構(gòu)酶[20]， 參與糖異生途徑，催化二羥基丙酮磷酸（DHAP）轉(zhuǎn)化為d甘油醛3磷酸（G3P）; I8來源于Probable tautomerase SA1195.1[21]; I9來源于UPF0457 protein SA1975.1[21]。

3.1金黃色葡萄球菌中候選特征肽的非靶向分析

本研究采用非靶向蛋白質(zhì)組分析方法檢測金黃色葡萄球菌的特征肽。非靶向蛋白質(zhì)組分析方法不需要針對特征肽建立和優(yōu)化特定的方法，易于實施，而且能夠獲得不限于特征肽的更豐富的多肽和蛋白質(zhì)種類信息[22，23]。在金黃色葡萄球菌兩個標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 43300和ATCC 25923樣品中分別鑒定到5種蛋白質(zhì)，其中，特征蛋白和特征多肽的鑒定結(jié)果如圖1所示。本研究成功鑒定出7種特征蛋白，但各自鑒定到的肽段種類數(shù)量不同（圖1A），特征蛋白ATL鑒定到的多肽數(shù)量最多，在ATCC 25923樣品中共鑒定出20種多肽。I1～I(xiàn)9中，只有4個特征肽（I2、I3、I7和I9）被成功鑒定到（圖1B）; 其它特征肽可能是因為含量較低，所以不能被鑒定到。非靶向蛋白質(zhì)組分析方法雖然獲得的信息較多，但是檢測靈敏度不高，需要開發(fā)靶向分析方法用于特征肽的高靈敏度和全覆蓋分析檢測。

3.2候選特征肽靶向分析方法的考察

利用HPLCESI/QQQ 質(zhì)譜的MRM分析模式，可對特定的母離子子離子對進(jìn)行選擇性檢測，進(jìn)而提高目標(biāo)物的檢測靈敏度。Skyline工具可以通過計算機(jī)模擬預(yù)測碎片離子， Charretier等[15]使用該工具為每個候選特征肽篩選了3個碎片離子， 用于MRM模式分析。為驗證其特征碎片離子的有效性，本研究對特征肽的碎片離子進(jìn)行了全掃描分析，發(fā)現(xiàn)部分特征肽的碎片離子不正確或者不合適，因此，在此基礎(chǔ)上對特征碎片離子進(jìn)行了調(diào)整。圖2展示了特征肽I1調(diào)整前后的特征碎片離子。由圖2A可知，碎片離子m/z 766.48和653.39響應(yīng)較高，而m/z 929.5并沒有響應(yīng)，說明該碎片離子不適合。圖2B為I1碎片離子的全掃描質(zhì)譜圖，在m/z值較大且響應(yīng)高的3個碎片離子m/z 766.48、653.39和58235，選用m/z 582.35作為碎片離子更合適。圖2C為選擇m/z 766.48、653.39和582.35作為特征碎片離子進(jìn)行MRM模式分析的質(zhì)譜圖，3個特征碎片離子都有較高的響應(yīng)。經(jīng)調(diào)整后，最終采用的候選特征肽碎片離子見表1。以候選特征肽I1的同位素標(biāo)記肽為內(nèi)標(biāo)，該內(nèi)標(biāo)肽IS位于羧基端的賴氨酸（K）增加了8 Da，所以導(dǎo)致y離子也都增加了8 Da，其MRM模式分析方法見表1。采用MRM模式靶向分析特征肽等量混合物（0.1 mg/mL）的色譜如圖3所示， 可見同一濃度下各個特征肽的響應(yīng)強(qiáng)度有差別，其中，I4和I1的響應(yīng)最強(qiáng)，而I8和I9的響應(yīng)較低。特征肽的質(zhì)譜響應(yīng)能力越強(qiáng)，在同等濃度下更容易被檢出，響應(yīng)能力很差的肽段不適于作為特征肽。由于不同肽在實際樣品中的豐度不同，候選肽作為特征肽是否適合，還取決于實際生物樣品中的檢出效能。

3.3金黃色葡萄球菌候選特征肽的靶向分析

采用所建立的候選特征肽的MRM靶向分析方法，分析兩種金黃色葡萄球菌菌株ATCC 43300和ATCC 25923胰蛋白酶水解樣品中的候選特征肽，結(jié)果見圖4。兩種菌株水解物中候選特征肽的響應(yīng)存在差異。在菌株ATCC25923水解樣品中，I1、I2、I5和I6的響應(yīng)強(qiáng)度較高，明顯高于在菌株ATCC 43300水解樣品中的響應(yīng)強(qiáng)度。候選特征肽I1～I(xiàn)6在菌株ATCC43300水解樣品中的響應(yīng)強(qiáng)度較高，適合作為特征肽使用。候選特征肽I7～I(xiàn)9在兩種菌株水解樣品中響應(yīng)強(qiáng)度都很低，甚至未檢出，顯然不太適合作為特征肽。候選特征肽的響應(yīng)雖然在兩種菌株樣品中存在差異，但都被檢出。

4結(jié) 論

本研究針對文獻(xiàn)報道的9種金黃色葡萄球菌特征肽進(jìn)行了深入研究， 比較了不同的分析模式以及分析效能的差異。結(jié)果表明， 非靶向質(zhì)譜分析方法盡管獲得的蛋白鑒定信息更多，但靈敏度不足以覆蓋大多數(shù)候選特征肽，高靈敏度的靶向質(zhì)譜分析方法依然是首選方案。通過對標(biāo)準(zhǔn)肽的碎裂分析，修正了部分碎片離子的選擇。 通過檢測兩株金黃色葡萄球菌樣品中的候選特征肽，初步表明I1、I2、I5和I6的檢出效能更好，更適合作為金黃色葡萄球菌的特征肽，而I7、I8和I9因響應(yīng)較低不適合作為特征肽。本研究初步考察了金黃色葡萄球菌的特征肽用于菌種鑒定的性能，下一步還需要擴(kuò)大金黃色葡萄球菌株的檢測數(shù)量，以提供更多、更可靠的信息。

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