王芳 喬美星 喻敏

摘要：采用液體培養(yǎng)的方法，測(cè)定了5種抗菌素對(duì)豌豆根邊緣細(xì)胞培養(yǎng)液污染細(xì)菌的抑制和對(duì)邊緣細(xì)胞的降解作用。結(jié)果表明，5種抗菌素在50-4 000 mg/L的濃度梯度內(nèi)，對(duì)邊緣細(xì)胞培養(yǎng)液污染細(xì)菌均具有一定的抑制作用。其中，羅紅霉素、頭孢呋辛酯和恩諾沙星對(duì)污染細(xì)菌抑制率較適宜的濃度分別為2 000、1 000和1 000 mg/L，抑制率分別迭93.480-/0、58.70%和91.30%。青霉素、羅紅霉素、頭孢呋辛酯、慶大霉素和恩諾沙星分別在500、500、l 000、1 000和500 mg/L時(shí)對(duì)邊緣細(xì)胞的降解作用較緩慢，分別為63.89%、58.95%、60.80%、73.15%和58.95%，濃度增高，對(duì)邊緣細(xì)胞的影響會(huì)明顯增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：抗菌素;污染細(xì)菌;邊緣細(xì)胞;抑制作用

中圖分類號(hào)：TQ455.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（ 2020） 08-0080-03

D01：10.1408 8/j.cnki.issn0439- 8114.2020.08.018

在植物組織培養(yǎng)的污染危害中，最嚴(yán)重的是細(xì)菌污染[1]。染菌的試管苗很難生根[2]，即使生根，移栽成活率也很低，造成無法挽回的損失。細(xì)菌污染的消除一般是用抗生素[3]，抗生素可以直接加入到培養(yǎng)基中，也可以用抗生素浸泡外植體或噴灑外植體。

大多數(shù)植物的根尖每天都要代謝產(chǎn)生大量的邊緣細(xì)胞（Root border cells，簡(jiǎn)稱BC），這些邊緣細(xì)胞作為根表面和土壤間構(gòu)建的一個(gè)生物表界面，在減少或避免外界的生物與非生物脅迫，如真菌、細(xì)菌、線蟲的侵染和鋁毒的傷害中起著重要作用[4]。絕大多數(shù)物種都有邊緣細(xì)胞，且90%以上具有生物學(xué)活性，一條根系所產(chǎn)生的邊緣細(xì)胞數(shù)量因物種而異。此外，細(xì)胞活性受環(huán)境條件、染色及觀察時(shí)間等外界因素的影響較大。

邊緣細(xì)胞是從根冠表皮游離出來并聚集在根尖周圍的一群特殊細(xì)胞。關(guān)于邊緣細(xì)胞形成和釋放的調(diào)控機(jī)制以及在提高植物抗逆性，尤其是抗鋁毒方面的研究，已成為植物學(xué)研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)之一[5]。本試驗(yàn)就邊緣細(xì)胞的體外培養(yǎng)過程中細(xì)菌污染的抑制問題進(jìn)行了初步探討，旨在為邊緣細(xì)胞培養(yǎng)液的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

豌豆由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院土壤肥料實(shí)驗(yàn)室提供。

藥劑主要有青霉素、羅紅霉素、頭孢呋辛酯、恩諾沙星和慶大霉素。

儀器主要有三角燒瓶、試管、玻璃棒、酒精燈、電子顯微鏡、超凈工作臺(tái)。

1.2 方法

1.2.1 豌豆根邊緣細(xì)胞的培養(yǎng)選擇飽滿且大小均勻的豌豆種子用0.5%次氯酸鈉殺菌10 min，流水沖洗30 min，再用無菌水沖洗3次，然后在無菌水中浸泡12 h，使其吸脹。采用超聲霧化裝置在恒溫（23℃）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)豌豆幼苗[6.7]，待根長(zhǎng)至15 mm以上時(shí)分離邊緣細(xì)胞。

1.2.2 藥劑的配制選取青霉素、羅紅霉素、頭孢呋辛酯、恩諾沙星、慶大霉素5種藥劑處理。供試藥劑均分別設(shè)置4 000、2 000、1 000、500、250、100和50mg/L 7種濃度，用無菌水定容至250 mL。

取邊緣細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL，分別加入以上藥劑一滴（ 1/20 mL）;以無菌水為對(duì)照，設(shè)2次重復(fù)，24 h后測(cè)定細(xì)菌含量，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞的數(shù)量和活性。

1.2.3 邊緣細(xì)胞的數(shù)目 預(yù)備試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在豌豆種子根長(zhǎng)為15 mm時(shí)，邊緣細(xì)胞數(shù)量最大。因而本試驗(yàn)挑選15 mm長(zhǎng)的根。每次均取根適量，剪取根尖3 mm，放人裝有1 000 μL無菌水的離心管中，10 000 r/min離心5 min，吸取上清液于另-1 000 μL離心管中，加無菌水稀釋備用。使用前搖均勻，使邊緣細(xì)胞及其黏液在水中充分展開再使用。用移液槍吸取10 μL含邊緣細(xì)胞的懸浮液于離心管中，再加入適量0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，充分混合后吸取2.5 μL的混合溶液在干凈的載玻片上劃線，并在電子顯微鏡下統(tǒng)計(jì)邊緣細(xì)胞數(shù)目，3次重復(fù)。

1.2.4 細(xì)菌抑制率和邊緣細(xì)胞降解率的計(jì)算

抑制率=（對(duì)照生長(zhǎng)量一相應(yīng)濃度生長(zhǎng)量）/對(duì)照生長(zhǎng)量xl00%

降解率=（處理前邊緣細(xì)胞總數(shù)一相應(yīng)濃度處理后邊緣細(xì)胞數(shù)）/處理前邊緣細(xì)胞總數(shù)xl00%

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel、SAS有關(guān)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度供試抗菌素對(duì)邊緣細(xì)胞的降解作用

由圖1可見，青霉素在50-4 000 mg/L的濃度梯度內(nèi)對(duì)邊緣細(xì)胞的降解率為45.37%-75.31%，在50-1 000 mg/L的濃度范圍內(nèi)降解率增加明顯，500 mg/L時(shí)降解率為63.89%，1 000 mg/L時(shí)降解率增加至73.15%，兩者之間差異較明顯。這說明500mg/L青霉素對(duì)于邊緣細(xì)胞的降解作用較緩慢，隨著濃度增高對(duì)于邊緣細(xì)胞的影響明顯增強(qiáng)。

由圖2可見，羅紅霉素在50-4 000 mg/L的濃度梯度內(nèi)對(duì)于邊緣細(xì)胞的降解率為50.62%-77.47%，在50-1 000 mg/L的濃度范圍內(nèi)降解率增加明顯，500 mg/L時(shí)降解率為58.95%，1 000 mg/L時(shí)降解率增加至68.21%，兩者之間差異較明顯。這說明500mg/L羅紅霉素對(duì)于邊緣細(xì)胞的降解作用較緩慢，隨著其濃度增高，對(duì)于邊緣細(xì)胞的影響明顯增強(qiáng)。

由圖3可知，頭孢呋辛酯在50-4 000 mg/L的濃度梯度內(nèi)對(duì)邊緣細(xì)胞的降解率為43.52%-70.06%。在50-2 000 mg/L的濃度范圍內(nèi)降解率增加明顯，1 000mg/L時(shí)降解率為60.80%，2 000mg/L時(shí)降解率增加至68.21%，兩者之間差異較明顯。這說明1 000mg/L頭孢呋辛酯對(duì)邊緣細(xì)胞的降解作用較緩慢，隨著其濃度增高，對(duì)邊緣細(xì)胞的影響明顯增強(qiáng)。

由圖4可知，慶大霉素在50-4 000mg/L的濃度梯度內(nèi)對(duì)邊緣細(xì)胞的降解率為62.96%-90.74%。在50-2 000mg/L的濃度范圍內(nèi)降解率增加明顯，1 000mg/L時(shí)降解率為73.15%，2 000 mg/L時(shí)降解率最高，達(dá)90.74%，兩者之間差異較明顯。這說明1 000 mg/L慶大霉素對(duì)邊緣細(xì)胞的降解作用較緩慢，隨著其濃度增高，對(duì)于邊緣細(xì)胞的影響明顯增強(qiáng)。

由圖5可知，恩諾沙星在50-4 000 mg/L的濃度梯度內(nèi)對(duì)邊緣細(xì)胞的降解率為36.11% -81.48%。在50-1 000mg/L的濃度范圍內(nèi)降解率增加明顯，500mg/L時(shí)降解率為66.98%，1 000 mg/L時(shí)降解率達(dá)72.22%，兩者之間差異較明顯，2 000 mg/L時(shí)降解率最高，達(dá)81.48%。這說明500 mg/L恩諾沙星對(duì)邊緣細(xì)胞的降解作用較緩慢，隨著其濃度增高，對(duì)于邊緣細(xì)胞的影響明顯增強(qiáng)。

2.2 不同濃度抗菌素對(duì)污染細(xì)菌的抑制作用

由表1可知，青霉素在50-4 000mg/L的濃度梯度內(nèi)對(duì)邊緣細(xì)胞培養(yǎng)液污染細(xì)菌的抑制率為0-73.91%。在50-1 000mg/L時(shí)，青霉素抑制率增加幅度較大，在500、1 000和2 000mg/L時(shí)，其抑制率均達(dá)40%以上，分別為43.48%、45.65%和47.83%，在4 000mg/L時(shí)，抑制率增加到73.91%，說明青霉素使用濃度提高，對(duì)于污染細(xì)菌的抑制率有明顯的增強(qiáng)。

羅紅霉素在50-4 000mg/L的濃度梯度內(nèi)對(duì)邊緣細(xì)胞培養(yǎng)液污染細(xì)菌的抑制率為17.39%-95.65%。在50-2 000mg/L時(shí)抑制率增加幅度較大，1 000mg/L時(shí)達(dá)67.39%.2 000 mg/L時(shí)抑制率達(dá)93.48%，兩者之間差異明顯，說明羅紅霉素在2 000 mg/L時(shí)，對(duì)于污染細(xì)菌的抑制作用有較明顯的增強(qiáng)。

頭孢呋辛酯在50-4 000mg/L的濃度梯度內(nèi)對(duì)邊緣細(xì)胞培養(yǎng)液污染細(xì)菌的抑制率為34.78%-80.43%。在50-1 000mg/L時(shí)，抑制率增加幅度較大，50 mg/L時(shí)抑制率為34.78%，1 000mg/L時(shí)則為58.70%，兩者之間差異明顯，說明頭孢呋辛酯在1 000mg/L時(shí)對(duì)污染細(xì)菌的抑制作用有較明顯的增強(qiáng)。

慶大霉素在50-4 000mg/L的濃度梯度內(nèi)對(duì)邊緣細(xì)胞培養(yǎng)液污染細(xì)菌的抑制率為84.78%-100%，各處理濃度抑制率均相對(duì)較高。

恩諾沙星在50-4 000mg/L的濃度梯度內(nèi)對(duì)邊緣細(xì)胞培養(yǎng)液污染細(xì)菌的抑制率為76.09%-93.48%。在50-1 000mg/L時(shí)，抑制率增加幅度較大，500mg/L時(shí)抑制率為71.74%，1 000 mg/L時(shí)則為91.30%，兩者之間差異明顯，說明恩諾沙星在1 000mg/L時(shí)對(duì)污染細(xì)菌的抑制作用有較明顯的增強(qiáng)。

3 小結(jié)與討論

供試的5種抗菌素在50-4 000mg/L的濃度梯度內(nèi)，對(duì)邊緣細(xì)胞均有一定程度的降解作用。其中，青霉素在50-1 000 mg/L的濃度范圍內(nèi)降解率增加明顯，50 mg/L時(shí)降解率為45.37%，4 000 mg/L時(shí)降解率最大，為75.31%。羅紅霉素在50-1 000mg/L的濃度范圍內(nèi)降解率增加明顯，500mg/L時(shí)降解率為58.95%，1 000mg/L時(shí)降解率達(dá)68.21%。頭孢呋辛酯在50-2 000mg/L的濃度范圍內(nèi)降解率增加明顯，1 000mg/L時(shí)降解率為60.80%，2 000mg/L時(shí)降解率增加至68.21%。慶大霉素在50-2 000mg/L的濃度范圍內(nèi)降解率增加明顯，1 000mg/L時(shí)降解率為73.15%，2 000 mg/L時(shí)解率增至最大，為90.74%。恩諾沙星在50-1 000mg/L的濃度范圍內(nèi)降解率增加明顯，250mg/L時(shí)降解率為58.95%，500mg/L時(shí)降解率增加至66.98%，兩者之間差異較明顯。說明青霉素、羅紅霉素、頭孢呋辛酯、慶大霉素和恩諾分別在500、500、1 000、1 000和250mg/L時(shí)對(duì)邊緣細(xì)胞的降解作用較緩慢，隨著其濃度增高，對(duì)于邊緣細(xì)胞的影響會(huì)明顯增強(qiáng)。

5種抗菌素在50-4 000 mg/L的濃度梯度內(nèi)對(duì)邊緣細(xì)胞培養(yǎng)液污染細(xì)菌均具有一定的抑制作用。其中，羅紅霉素在50-2 000mg/L時(shí)抑制率增加幅度較大，1 000mg/L時(shí)抑制率達(dá)67.39%，2 000 mg/L時(shí)達(dá)93.48%。頭孢呋辛酯在50-1 000mg/L時(shí)抑制率增加幅度較大，500 mg/L時(shí)抑制率為54.35%，1 000mg/L時(shí)則為58.70%。恩諾沙星在50-1 000mg/L時(shí)抑制率增加幅度較大，500mg/L時(shí)抑制率為71.74%，1 000 mg/L時(shí)則為91.30%，兩者之間差異明顯，說明羅紅霉素、頭孢呋辛酯和恩諾沙星對(duì)于污染細(xì)菌抑制率較適宜的選擇濃度分別為2 000、1 000和1 000 mg/L。青霉素和慶大霉素隨著使用濃度的提高，抑制率則明顯增強(qiáng)。

由于抗生素的大量頻繁使用，細(xì)菌抗藥性問題引起人們的關(guān)注。在抗生素的使用過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生了具有忍耐性的抗性菌株，使得抗生素能殺死細(xì)菌的有效劑量在不斷提高。越來越多的試驗(yàn)證明，環(huán)境致病菌耐藥性的增加和擴(kuò)散將會(huì)對(duì)人類的公共健康構(gòu)成潛在威脅。根邊緣細(xì)胞是從根冠表皮游離出聚集在根尖周圍的一群特殊細(xì)胞，發(fā)育受遺傳調(diào)控，在逆境中具有多種生物學(xué)功能。Hawes等[4]將這類細(xì)胞稱為根邊緣細(xì)胞，強(qiáng)調(diào)這類細(xì)胞位于根表面與土壤之間、有生物活性的生物邊界層。邊緣細(xì)胞于根冠產(chǎn)生后，發(fā)揮多方面的功能，如影響根際微生態(tài)系統(tǒng)、抑制病源菌侵入、減少根系的機(jī)械阻力、保護(hù)根尖等。表明抗菌素在抑制細(xì)菌的同時(shí)，也對(duì)正常的邊緣細(xì)胞有降解作用，被處理后的邊緣細(xì)胞總數(shù)均比處理前少。

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作者簡(jiǎn)介：王芳（1964-），女，山東萊陽人，副教授，碩士，主要從事植物真菌病害研究，（電話）18689286491（電子信箱）1940480985@qq.com。