郭云鵬, 王公嗣, 黃 勃

(海南大學海洋學院，海南 海口 570228)

紅樹蜆(PolymesodaerosaSolander)是一類主要生長于熱帶紅樹林潮間帶灘涂的一種大型雙殼貝類動物，在廣東、廣西和海南等地均有分布.紅樹蜆生長速度快，體型較大，環(huán)境適應性強，有食用價值，具有養(yǎng)殖潛力[1].雙殼類動物的經濟價值已越發(fā)受到重視，目前有關雙殼類動物生殖生物學的研究已有很多，然而對紅樹蜆繁殖生物學的研究只有少量報道.周浩郎等[2-3]研究了紅樹蜆性腺發(fā)育、生殖周期、自然分布和生長發(fā)育過程；張俊杰等[4]對紅樹蜆的人工養(yǎng)殖前景進行了研究.精子的超微結構是研究動物生殖發(fā)育的重要依據(jù).黃勃等[5]研究了我國海域耳鮑精子的超微結構；周小龍等[6]對簾文蛤精子的超微結構進行了觀察并且與其他雙殼類動物的精子結構做了比較；焦海峰等[7]研究了軟體動物精子的超微結構以及分類學意義.但至今為止, 國內外尚未見有關紅樹蜆精子超微結構的研究報道.本試驗對雄性紅樹蜆的精巢形態(tài)和發(fā)育過程進行了研究，同時對其精子的超微結構進行了詳細觀察，旨在為雙殼類動物的研究積累更多資料.

1 材料與方法

1.1 樣本采集

紅樹蜆于2018年6—10月在海口市鋪前鎮(zhèn)采集，每月采集30個個體，紅樹蜆平均殼寬(32.9±3.7) mm，平均殼高(47.5±2.5) mm，平均殼長(50.3±1.9) mm，在裝有人工海水的聚苯乙烯罐(980 mm×760 mm×680 mm)中暫養(yǎng)，每天喂食螺旋藻粉，3 d后選擇雄性個體開始試驗.海水鹽度、溫度和pH分別維持在22‰、24 ℃和7.8～8.0.

1.2 組織切片樣本的制備與觀察

快速取出精巢組織，剪成小塊，用Bouin′s固定液固定，梯度濃度乙醇脫水，石蠟包埋，制成5～7 μm厚度的切片，再用蘇木精—伊紅(HE) 染色，中性樹膠封片，DM1000型顯微鏡(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司)觀察.

1.3 透射電鏡樣本的制備與觀察

快速取出精巢組織，剪取1 mm3的小塊，用2.5%戊二醛緩沖液(4 ℃)固定過夜，1%鋨酸固定2 h，梯度濃度乙醇脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，LKB-Ⅱ型超薄切片機(瑞典LKB產品有限公司)切片，醋酸鈾檸檬酸鉛雙重染色，JEM-1010型透射電鏡(日本日立集團)觀察拍照.

2 結果與分析

2.1 紅樹蜆精巢的形態(tài)和發(fā)育分期

精細胞：細胞圓形，核質濃縮，染色最深，位于濾泡中央，細胞形態(tài)在形成精子時發(fā)生明顯變化，呈長錐形.

雄性紅樹蜆的生殖腺呈乳白色或乳黃色，位于足部上方，包裹著內臟團,由分枝狀生殖管和濾泡組成，精細胞的發(fā)生主要在濾泡內進行.濾泡由濾泡壁和濾泡腔兩部分組成，不同發(fā)育階段的生精細胞排列成層，精原細胞和精母細胞的分布靠近基膜，而精子細胞和精子的分布靠近管腔.光鏡下對精巢組織切面進行觀察，可觀察到不同發(fā)育階段的生精細胞(圖1).6—7月,精巢發(fā)育處于增殖和生長期，濾泡逐漸增大增多，間隙縮小.7—8月為成熟期，精巢體積大而飽滿，內有大量生精細胞.8—11月為排放期，此階段精巢持續(xù)排精，逐漸縮小，而后進入休止期.

精原細胞：精原細胞貼近濾泡壁，體積大，呈圓形或橢圓形，胞體直徑約5 μm.胞質染色淺而均勻，核染色加深.

初級精母細胞：由精原細胞轉化而來，呈圓形，胞質較少，染色加深.與精原細胞相比更加靠近濾泡腔.

次級精母細胞：次級精母細胞與初級精母細胞鄰近，不易區(qū)分.胞質更少，染色深.

組織切片觀察結果顯示，精巢發(fā)育可分為以下5期.增殖期(圖2A)：性腺開始形成，濾泡腔增大，濾泡壁伸展，濾泡腔壁主要由精原細胞組成.生長期(圖2B)：性腺不斷增大，濾泡數(shù)量增多，濾泡空隙不斷縮小，腔內由精原細胞和精母細胞組成.成熟期(圖2C)：性腺飽滿，濾泡數(shù)量更多，濾泡腔更大;生殖上皮層增厚，濾泡壁可觀察到精母細胞和精細胞向腔內分層排列;精細胞的數(shù)量不斷增多，呈放射狀占據(jù)濾泡腔.排放期(圖2D)：排放后性腺顏色變淡，飽滿度下降;濾泡之間再次出現(xiàn)空隙，精原細胞重新出現(xiàn)，排放后期濾泡中的成熟精子基本排空，剩余精細胞稀疏分布.休止期(圖2E)：性腺萎縮，濾泡壁變厚，濾泡腔變空，有少量殘存的精母細胞和精細胞.

2.2 紅樹蜆精子的超微結構

2.2.1 頭部 紅樹蜆精子頭部呈細長錐形，長度6～8 μm，由位于頂端的頂體及后端的精核組成.透射電鏡下觀察顯示，頂體呈倒“V”字形，前部電子密度較大，頂體腔內電子密度較低.精核與頂體接觸部位有一核窩，精核核長4～5 μm，由頂端至中部逐漸變粗，最寬處約為1 μm，精核具有很高的電子密度，同時可觀察到不規(guī)則的染色較淺的核泡(圖3A～3C).

2.2.2 中段 中段由中心粒和線粒體組成，可觀測到由近端中心粒和遠端中心粒組合而成的中心粒復合結構.精核與近端中心粒接觸部位也有一核窩，兩者相互垂直，而遠端中心粒與精核長軸方向相同.橫切面超微結構顯示，精子線粒體呈圓球形，圍繞中心粒排列在同一平面上，數(shù)量為4個，雙層膜結構和嵴結構明顯(圖3D～3F).

2.2.3 尾部 尾部由鞭毛組成，靠近精核一端與遠端中心粒相接觸，橫切面圓形，直徑約0.4 μm，外層圍繞不規(guī)則質膜層，內部為軸絲，由微管組成.微管呈典型的“9+2”結構，兩根微管處于中央，四周圍繞9對微管.縱切面超微結構顯示，鞭毛壁及中心軸具有較高的電子密度(圖3G～3I).

3 討論

3.1 精巢發(fā)育過程

本研究觀察結果顯示：紅樹蜆增殖期精巢內以精原細胞為主，可見少量初級精母細胞；生長期和成熟期，精巢濾泡內含大量的精母細胞和精細胞；排放期后期，精巢中可見少量排精后留下來的精原細胞及增大的濾泡壁(圖2).目前對雙殼類動物性腺發(fā)育的研究，主要基于組織學的觀察結果，并結合生精細胞的數(shù)量、比例及分布狀況等特征進行分期[8-11].國內外大多數(shù)學者都將雙殼類動物性腺發(fā)育分為5個時期：增殖期、生長期、成熟期、排放期和休止期[12-16].本研究觀察結果顯示，雄性紅樹蜆性腺的發(fā)育過程同樣由上述5個時期組成.有研究表明，雙殼類瓣鰓綱動物的精巢大多都屬于濾泡型，濾泡內各期生精細胞均有生長，精原細胞位于濾泡壁上，不同階段的生精細胞逐漸向腔內分布[14,16]，本研究觀察結果顯示，紅樹蜆也存在類似現(xiàn)象，這或許說明紅樹蜆的繁殖類型為多次繁殖型.

3.2 精子的超微結構

海洋軟體動物精子的形態(tài)多樣，主要區(qū)別在于精子頭部精核、頂體部分的結構和所占比例.紅樹蜆精子的精核呈細長錐形，這與已報道的大部分雙殼類動物精子的形狀有很大不同，大部分軟體動物精子的頭部呈圓棒狀，而簾文蛤的精核呈狹繭形，太平洋牡蠣呈鈍圓型，香螺則呈線型[5-6,17-23].另外，紅樹蜆精核長6～8 μm，在頭部中占據(jù)很大比例(圖3B)，而其他軟體動物的精核長度大都為1.5～3.0 μm，如角蠑螺精子核部的長度為2.5～2.6 μm[20]，魁蚶精核長1.5 μm[19].存在這種差別的原因可能與紅樹蜆的系統(tǒng)演化及種屬差異有關[21]，精核的形態(tài)是區(qū)分種與種的重要標志之一，這一發(fā)現(xiàn)或可為蜆科種類的鑒別提供依據(jù).本研究還觀察到，紅樹蜆精核區(qū)域有不規(guī)則囊泡分布，直徑為0.05～0.30 μm(圖3C).Xia et al[24]認為，囊泡結構的出現(xiàn)反映精子受到了損傷；而孫慧玲等[25]認為，囊泡與精子內部的能量運輸過程有關，屬正常結構；本研究觀察結果顯示，絕大部分紅樹蜆精子都可發(fā)現(xiàn)囊泡結構的存在；周小龍等[6]對24種已報道的雙殼類動物精子結構研究也指出，大多數(shù)雙殼類動物的精子中均有囊泡.因此，可以認為囊泡的產生是一種自然現(xiàn)象.

雙殼類動物精子的頂體多呈倒“V”字形，而青蛤精子的頂體呈帽狀,櫛孔扇貝精子的頂體則呈奶嘴形[6].本研究觀察結果顯示，紅樹蜆精子的頂體亦呈倒“V”字形，長度約為核的1/5，寬度與精核基本一致，頂體內有內含物質(圖3A).研究表明，頂體的內含物質可能與協(xié)助精子入卵過程有關[7].軟體動物不同種間精子頂體的特征差異較大，如貽貝精子的頂體部分明顯突出，且長度為精核的兩倍[18]，縊蟶的頂體具有長管狀頂體柄[6]，而褶紋冠蚌的精子無頂體[7].紅樹蜆精子的頂體結構與其他貝類之間的區(qū)別是分析種間關系的一類重要依據(jù).

線粒體為精子提供了運動的能量，是衡量精子運動能力的重要指標.中心體被認為能夠加強鞭毛與核部的連接，從而輔助精子的運動.本研究觀察結果顯示，紅樹蜆精子線粒體個數(shù)為4個，同樣存在中心體結構(圖3D～3F)，與其他貝類精子中段的結構相似[17-20].不同種個體之間線粒體數(shù)量的不同反映了種間特異性的存在，同時說明了不同物種在生殖進化中的地位[21].雙殼類動物精子的鞭毛結構有多種類型[7].同大多數(shù)雙殼類動物的精子一樣，紅樹蜆精子為單鞭毛型，鞭毛的主要結構為軸絲，有典型的“9+2”二聯(lián)微管結構(圖3G～3I).

4 結論

本試驗對雄性紅樹蜆精巢的發(fā)育過程及不同階段生精細胞的特征進行了組織學研究，總結了不同發(fā)育時期精巢的結構特點;同時利用透射電鏡對精子的超微結構進行了觀察，并與其他雙殼類動物精子做了比較.本研究為進一步探究紅樹蜆的繁殖過程提供參考.