關(guān)淑文, 王 毅, 郝佳波, 原曉龍, 陸 斌, 李賢忠

(1.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院,云南 昆明 650201；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224)

花椒屬蕓香科花椒屬植物，在世界上約有250種，其中我國占39種，14個(gè)變種，我國南北方均有種植[1].花椒果皮是我國重要的食用調(diào)料和中藥材.因具有獨(dú)特的香、麻味，且有除腥去膻的功效，被譽(yù)為我國的“八大味”之一；據(jù)《本草綱目》記載，花椒果皮可消食解郁、止瀉殺蟲、散寒除濕、補(bǔ)腎溫胃等，在我國具有悠久的使用歷史[2].常見的花椒種類有紅花椒(Zanthoxylumbungeanum)、青花椒(Zanthoxylumschinifolium)和竹葉花椒(Zanthoxylumarmatum)，其中竹葉花椒在總體上香氣成分含量最高[3].

竹葉花椒的香味源自于其揮發(fā)油，同時(shí)揮發(fā)油也是評價(jià)其品質(zhì)的主要指標(biāo).而揮發(fā)油中僅有少部分香氣活性成分對其香味具有貢獻(xiàn)，其主要包括醇類、酯類和烯萜類.醇類主要有C10H18O，酯類主要有C12H20O2，烯萜類主要有C10H16和C15H24兩種.其中C10H16和C15H24分別屬于單萜和倍半萜.倍半萜C15H24在竹葉花椒香氣成分中存在兩個(gè)同分異構(gòu)體，分別是大根香葉烯D和石竹烯，大根香葉烯D的香氣特點(diǎn)是花香，而石竹烯的香氣特點(diǎn)是丁香和松香[3].而單萜和倍半萜的主要合成途徑分別為甲基赤蘚醇(2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP/deoxyxylulose 5-phosphate, DXP)途徑和甲羥戊酸(mevalonic acid, MVA)途徑[4].

羥甲基戊二酰輔酶A合成酶(Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, HMGS)是甲羥戊酸途徑的關(guān)鍵酶.首先，乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶(AACT)將兩分子乙酰CoA(acetyl-CoA)催化形成乙酰乙酰CoA(acetoacetyl-CoA)， 1分子的乙酰CoA再與1分子的乙酰乙酰CoA在HMGS的催化下縮合生成羥甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)，其次HMG-CoA經(jīng)羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, HMGR)的催化生成MVA，此步為MVA途徑的限速反應(yīng).最后MVA經(jīng)過甲羥戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)和甲羥戊酸5-焦磷酸脫羧酶(MVD)的焦磷酸化和脫羧作用最終形成C5單位異戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)，而IPP是形成單萜、倍半萜等萜類化合物的通用前體[5-6].研究顯示，MVA途徑的代謝通路受HMGS和HMGR共同調(diào)節(jié).Ren et al[7]研究表明，在HMGS基因過量表達(dá)的靈芝中，三萜類化合物的含量比對照組高出15.1%～24.2%；Schaller et al[8]和Wang et al[9]研究表明，轉(zhuǎn)入橡膠樹HMGS基因的番茄和轉(zhuǎn)入芥菜HMGS基因的擬南芥的甾醇含量有所提高[4].絕大部分真核生物都存在甲羥戊酸代謝途徑，而作為MVA途徑的第2個(gè)催化酶，HMGS受到前人較多的研究.研究表明，HMGS存在由2種不同基因編碼的線粒體形式和細(xì)胞質(zhì)形式.其中線粒體形式的HMGS目前只在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)其催化作用產(chǎn)生的羥甲基戊二酰CoA是生成酮體的底物[10].

目前，HMGS基因已在茶樹[5]、白木香[11]、靈芝[7]、擬南芥[12]、橡膠樹[13]、丹參[14]等植物中被克隆得到，但目前尚未見到有從竹葉花椒中克隆得到ZaHMGS基因.本研究對ZaHMGS基因進(jìn)行克隆與分析，為日后深入探討羥甲基戊二酰輔酶A合成酶基因功能、倍半萜等萜烯類物質(zhì)生物合成的分子機(jī)理以及利用分子生物學(xué)手段選育優(yōu)良品種提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

于云南省林業(yè)與草原科學(xué)院樹木園(E102°44′42.57″, N25°08′50.67″)采集竹葉花椒嫁接樹和實(shí)生樹嫩梢上的葉和莖，并且采集實(shí)生樹大果(6月果)、幼果(5月果)、芽和根(根尖)，用液氮保存帶回實(shí)驗(yàn)室，放在-80 ℃冰箱中.

HiFiDNA聚合酶、MARK訂購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物(ZaHMGS1F、ZaHMGS1R、TZaHMGSF、TZaHMGSR)、Loading Buffer、載體(pUMT)、T4連接酶、感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)、M13Mix訂購于生工生物工程(上海)股份有限公司；RNA提取試劑盒(Qiagen)；質(zhì)粒提取試劑盒(康為世紀(jì))；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara Super RT試劑盒).

1.2 RNA提取與cDNA合成

將竹葉花椒實(shí)生樹和嫁接樹的各器官：葉、莖、大果、幼果、芽和根分別放到液氮中研磨為粉末后，采用植物RNA提取試劑盒提取竹葉花椒總RNA，其操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，RNA質(zhì)量檢測使用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳完成，檢測RNA濃度則使用NanoDropTM 2000.選擇較完整，濃度適宜的RNA，根據(jù)制造商的說明，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒以1 μg總RNA進(jìn)行cDNA合成，并置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?其余的RNA置于-80℃冰箱中.

1.3 ZaHMGS基因的克隆

采用克里曼丁桔(Citrusclementina，登錄號:XP_006440512.1)的HMGS基因?yàn)槟０澹镜谺LAST搜索竹葉花椒的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到竹葉花椒的羥甲基戊二酰輔酶A合成酶基因(ZaHMGS)序列，以該序列為依據(jù),設(shè)計(jì)特異引物(ZaHMGS1F:5′-ATGGCAAAGAATGTTGGAAT-3′;ZaHMGS1R:5′-TTAGTGACCATTTGCAAGTG-3′).分別用竹葉花椒嫁接樹和實(shí)生樹嫩梢以及實(shí)生樹的大果、幼果、芽和根的cDNA為模板，ZaHMGS1F和ZaHMGS1R為引物，以HiFiDNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增得到ZaHMGS全基因片段.經(jīng)過電泳檢測后將目的片段連接到pUMT載體上，經(jīng)PCR檢測，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因測序.

1.4 ZaHMGS基因蛋白序列分析

使用NCBI上的ORF Finder分析獲得的竹葉花椒羥甲基戊二酰輔酶A合成酶基因(ZaHMGS)的cDNA序列，得到蛋白氨基酸序列，并用ProParam預(yù)測其蛋白的理化性質(zhì)；用SignalP 4.1 server預(yù)測該蛋白有無信號肽；通過NCBI對羥甲基戊二酰輔酶A合成酶基因的蛋白氨基酸序列進(jìn)行序列搜索，選擇與ZaHMGS蛋白序列同源性較高的植物羥甲基戊二酰輔酶A合成酶蛋白序列，利用DNAMAN將其與竹葉花椒HMGS蛋白序列進(jìn)行相似度比對，最后利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.5 基因的轉(zhuǎn)錄模式分析

成功合成cDNA第1條鏈后，以TZaHMGSF(5′-CAAGATTGCATGGCCTTTTG-3′)和TZaHMGSR(5′-TTCTCAAGGAGGTTAGCAAC-3′)作為特異引物，且以ubiquitins(NCBI登錄號:MK953729)作為內(nèi)參基因，經(jīng)熒光定量PCR檢測竹葉花椒ZaHMGS基因在嫁接樹的莖和葉以及實(shí)生樹的莖、葉、大果、幼果、芽和根中的具體表達(dá)情況.用SYBR Green(invitrogen)檢測特異引物的PCR產(chǎn)物.25 uL反應(yīng)體系的可選參數(shù)如下：2×SYBR綠色主混合物12.5 μL，上下游引物(10 μm·L-1)0.5 μL，模板(cDNA)1 μL，ddH2O 10.5 μL.使用PCR熱循環(huán)儀(ABI 7300;應(yīng)用生物系統(tǒng),Foster City, CA, USA).PCR反應(yīng)程序：變性程序(95 ℃, 10 min)，放大定量程序重復(fù)45次(95 ℃, 15 s; 57 ℃, 10 s; 72 ℃, 15 s;單次熒光測量)，熔化曲線程序(60 ℃至95 ℃, 加熱速度0.1 ℃, 連續(xù)熒光測量)，最后冷卻至40 ℃.以延伸因子1-alpha (EF1a)基因作為基因正常表達(dá)的內(nèi)部調(diào)控因子，通過qPCR分析每個(gè)樣品的至少2個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)和每個(gè)生物學(xué)重復(fù)的3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以確保再現(xiàn)性和可靠性.用比較Ct值法計(jì)算相對基因表達(dá)量f，其中f=2-△△Ct，△△Ct=(試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)基因組的Ct值-試驗(yàn)組參考基因的Ct值)-(對照組目標(biāo)基因的Ct值-對照組參考基因的Ct值).

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取和ZaHMGS基因克隆

利用植物總RNA提取試劑盒成功提取竹葉花椒嫁接樹和實(shí)生樹的總RNA后，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.以ZaHMGS1F和ZaHMGS1R作為特異引物，成功克隆得到竹葉花椒ZaHMGS基因(圖1).經(jīng)NCBI ORF Finder軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析顯示ZaHMGS基因具有長1 398 bp的完整的cDNA開放閱讀框(ORF)，編碼465個(gè)氨基酸(NCBI登錄號:MK953727).

2.2 竹葉花椒ZaHMGS基因蛋白序列分析

用在線程序NCBI ORF Finder預(yù)測ZaHMGS基因的開放閱讀框，ProParam預(yù)測其蛋白的理化性質(zhì).結(jié)果表明：該蛋白由465個(gè)氨基酸殘基組成，其分子量為51 359.42 u，理論等電點(diǎn)pI為5.93；在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)上對推斷得到的ZaHMGS蛋白序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其與已知功能的甜橙(sweet orange,Citrussinensis)、克里曼丁桔(clementine mandarin,Citrusclementina)、榴蓮(durian,Duriozibethinus)和可可(cocoa,Theobromacacao)的HMGS蛋白序列相似性較高，結(jié)果為：ZaHMGS蛋白序列與克里曼丁桔的CcHMGS蛋白序列相似性為92.57%；與甜橙的CsHMGS蛋白序列相似性為92.36%；與榴蓮的DzHMGS蛋白序列相似性為87.47%，與可可的TcHMGS蛋白序列相似性為87.05%.對竹葉花椒ZaHMGS蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，其存在由21個(gè)氨基酸組成的活性中心“GNTDIEGVDSTNACYGGTAAL”和5個(gè)被顏色標(biāo)示的參與底物催化的保守氨基酸，其中三角形標(biāo)示的2個(gè)還能影響酶的活性 (圖2).

將推導(dǎo)出來的ZaHMGS蛋白序列放在NCBI上進(jìn)行比對后，可得到其他植物的HMGS蛋白序列，用MEGA 7.0中自帶的Cluster W進(jìn)行蛋白序列多重比對，通過Neighbor-joining算法(自檢舉1 000次)繪制出竹葉花椒HMGS與其他植物HMGS的進(jìn)化樹(圖3).結(jié)果顯示竹葉花椒ZaHMGS蛋白與番木瓜(papaya,Caricapapaya)、甜橙、克里曼丁桔的HMGS蛋白聚為一類(圖3).

2.3 竹葉花椒ZaHMGS基因的轉(zhuǎn)錄模式分析

經(jīng)特異引物TZaHMGS1F和TZaHMGS1R檢測反轉(zhuǎn)錄得到的竹葉花椒cDNA，得到ZaHMGS基因在嫁接樹莖、嫁接樹葉、實(shí)生樹莖和實(shí)生樹葉中的具體表達(dá)情況以及ZaHMGS基因分別在實(shí)生樹根、莖、芽、幼果和大果中的具體表達(dá)情況(圖4)，結(jié)果顯示，ZaHMGS基因在嫁接樹葉、嫁接樹莖、實(shí)生樹葉和實(shí)生樹莖中的表達(dá)量無顯著性差異；在實(shí)生樹各器官的表達(dá)量從高到低分別為：幼果、芽、根、莖、大果.

3 討論

研究表明，不同植物存在著不同的HMGS基因拷貝數(shù)，不同拷貝之間也可能存在著不同的功能分化，其中只有1個(gè)拷貝的植物有杜仲、麻風(fēng)樹、蓖麻等，含有2個(gè)拷貝的植物有木薯、橡膠等，而芥菜含有4個(gè)拷貝基因[4,13].竹葉花椒ZaHMGS基因是否也存在多個(gè)拷貝有待進(jìn)一步研究.

異戊烯焦磷酸和二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallylpyrophosphate, DMAPP)都是萜類物質(zhì)的通用前體.植物通過MVE途徑和MEP/DXP途徑合成IPP和DMAPP，其中MVE途徑以3個(gè)乙酰CoA作為底物，在細(xì)胞質(zhì)中主要合成倍半萜、三萜以及多萜；MEP/DXP途徑以丙酮酸(pyruvate)和3-磷酸甘油醛(glyceraldehyde 3-phosphate, G-3-P)作為底物，在質(zhì)體中主要合成單萜、二萜以及四萜.不同的生物種類和合成產(chǎn)物的亞細(xì)胞位置決定了IPP和DMAPP的合成途徑.由1分子DMAPP和1分子IPP縮合生成的橙花基焦磷酸(neryl diphosphate, NPP)或牻牛兒基焦磷酸(greanyl diphosphate, GPP)在單萜合酶的催化下可生成不同的單萜，而由1分子DMAPP和2分子IPP縮合生成的法呢基焦磷酸(fanesyl diphosphate, FPP)在倍半萜合酶的催化下生成不同的倍半萜[15].

HMGS是MVA途徑的關(guān)鍵酶，HMGS基因表達(dá)量的變化可影響萜類的合成[13].從熒光定量PCR結(jié)果可以看出，嫁接并不影響ZaHMGS在葉和莖中的表達(dá)量，且葉和莖之間的表達(dá)量并無顯著性差異；而Kai et al[16]對曼地亞紅豆杉的研究顯示，TmHMGS在針葉和莖中的表達(dá)水平相類似，這與本研究結(jié)果相一致.ZaHMGS在芽和幼果等生長旺盛部位的表達(dá)量較高， 而Liu et al[17]研究表明， 植物三七的基因PnHMGS1在花中的表達(dá)量比根、莖、葉高.鄒智等[18]在對蓖麻的研究中顯示，RcHMGS在Ⅱ/Ⅲ期胚乳和花中的表達(dá)豐度較Ⅴ/Ⅵ期胚乳、種子和葉高.以此同時(shí)，Besser et al[19]研究表明，HMGS和HMGR基因在番茄腺毛細(xì)胞中大量表達(dá)，并且產(chǎn)生多種次生代謝物，以此抵抗病原體和害蟲.萜類物質(zhì)參與了植物的防御作用，而幼嫩部位相對成熟部位缺少強(qiáng)有力的表皮、膠質(zhì)層等屏障來抵御外來病原體的浸染，因此推測幼嫩部位相對成熟部位需要更多的萜類物質(zhì)參與化學(xué)防御，而這些萜類物質(zhì)中，又包含有檸檬烯、α-蒎烯、γ-萜品烯、β-石竹烯、檜烯等具有香味的成分[3].但是，陳林波等[5]研究表明，茶樹ScHMGS基因在成熟葉片中的表達(dá)量較嫩葉高.朱畇昊等[20]研究表明，冬凌草組培苗IrHMGS基因在根和葉的表達(dá)量較愈傷組織、莖和組培苗花高.結(jié)合前人研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGS基因在不同植物中的表達(dá)不同.雖然HMGS表達(dá)量的提高可促進(jìn)萜類合成量的升高，但萜類的合成受合成途徑中多種酶的共同調(diào)節(jié)，Suwanmancee et al[21]研究表明，橡膠產(chǎn)量提高的幅度不如HMGS基因表達(dá)量和HMGS酶的活性提高的幅度大.所以植物萜類合成很可能還受到負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的調(diào)節(jié)作用，ZaHMGS表達(dá)量的升高對應(yīng)萜類合成量提高的幅度還有待進(jìn)一步研究.

提高植物萜類產(chǎn)量是熱門研究課題，近年來人們對萜類代謝途徑及其調(diào)控機(jī)理的研究不斷深入，同時(shí)青蒿酸和類胡蘿卜素代謝工程也取得突破性進(jìn)展，使得代謝工程逐漸成為提高萜類產(chǎn)量最有潛力的途徑之一[22].通過代謝工程提高植物萜類產(chǎn)量的分子調(diào)控方法有多種，第一是可提高限速酶的酶活性或表達(dá)水平以提高植物萜類產(chǎn)量，如HMGS、HMGR等；第二是阻止代謝通路的中間產(chǎn)物流向競爭路線；第三是阻止反饋調(diào)節(jié)機(jī)制對代謝產(chǎn)物合成的抑制，如使用酶的抑制劑等；第四是減少目的產(chǎn)物的分解[19,23].本研究對竹葉花椒羥甲基戊二酰輔酶A合成酶基因進(jìn)行克隆與分析，為日后深入研究其在竹葉花椒中受調(diào)控的機(jī)理及功能提供依據(jù)，以便更好地利用代謝工程手段提高竹葉花椒揮發(fā)性萜類物質(zhì)的含量，對提高果皮品質(zhì)具有重要意義.