李勇莉，趙秀蘭，張寧，董學易，班新超，廖詩晗，劉鐵菊

（天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學教研室，天津300070）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。在我國，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率分別高居女性惡性腫瘤的首位和第5 位[1]。雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor-receptor 2，HER-2）均為陰性的三陰性乳腺癌是乳腺癌的一種特殊亞型，約15%～20%乳腺癌患者屬于此類型[2]。三陰性乳腺癌較其他類型的乳腺癌發(fā)病年齡更早，更易復發(fā)和發(fā)生遠處轉移，預后最差[3]。富含精氨酸/絲氨酸卷曲螺旋2（arginine/serine-rich coiledcoil 2，RSRC2），又稱為食道癌抑制生長蛋白，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因。它位于12q24，基因表達產(chǎn)物由434 個氨基酸組成[4]。RSRC2 在多種正常器官中廣泛表達，而在肺中的表達水平明顯高于胃、小腸、腎臟、肝臟等。研究表明，RSRC2 可影響細胞生長和增殖，但是它在腫瘤進展中如何發(fā)揮作用鮮有研究[5]。本研究旨在通過調控RSRC2 在三陰性乳腺癌細胞系中的表達，探究RSRC2 對三陰性乳腺癌生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、人腎上皮細胞系293T 均購自（美國）ATCC 公司。

1.1.2 實驗試劑 DMEM、Opti-MEM 培養(yǎng)基購自（美國）Neuronbe 公司，胎牛血清購自（美國）Gibco公司，質粒和慢病毒包裝試劑盒均購自（美國）Genecopoeia 公司：RSRC2 過表達質粒（EX-H8692-Lv201），RSRC2 過表達對照質粒（EX-NEG-Lv201），RSRC2 降表達質粒（HSH017340-31-LvRU6GP）,RSRC2 降表達對照質粒（CSHCTR001-LvRU6GP），慢病毒包裝試劑盒（HPK-LvTR-40）。Transwell 小室購自（美國）FALCON 公司，Matrigel 膠購自（美國）Invitrogen 公司。RSRC2 抗體（R36896）購自（美國）NOVUS 公司，GAPDH 抗體（Sc25778）購自（美國）Santa Cruz 公司，二抗購自（北京）中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、293T 細胞培養(yǎng)于添加有10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（100 U/mL 青霉素，100 U/mL 鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉染 培養(yǎng)293T 細胞，轉染前2 d 換成含10%熱滅活血清的DMEM 培養(yǎng)基，轉染時按照慢病毒包裝試劑盒說明書添加相關轉染試劑及RSRC2 過表達、降表達和空載體對照質粒，12～14 h后換成含5%熱滅活血清和1%雙抗的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后過濾細胞碎片，收集上清液。在6 孔板中用含56℃熱滅活血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)MDA-MB-231 細胞24 h，每孔中添加2 mL 病毒液和12 μL Polybrene，12～14 h 后替換成不含Polybrene 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，48h 后鏡下觀察轉染效率，嘌呤霉素進行藥篩，并建立穩(wěn)定轉染的MDA-MB-231 細胞系。

1.2.3 Western blot 將培養(yǎng)皿中的細胞裂解后提取其蛋白并測其蛋白濃度，將等量的各蛋白上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，于PVDF 膜濕轉90 min，pH 值為7.0 的5%脫脂牛奶中封閉1 h，加入適量的一抗，于搖床孵育1 h 后，4℃孵育過夜。次日于搖床1 h 恢復室溫，TBST 洗滌緩沖液洗膜3 次，添加對應的二抗，37℃搖床孵育2 h，再次用TBST 洗滌膜3 次，加入發(fā)光液后避光顯影，拍照保存。采用Image J 進行蛋白條帶灰度值分析。

1.2.4 Transwell 遷移侵襲實驗 遷移實驗不鋪Matrigel 膠，侵襲實驗需提前在小室上層鋪一層Matrigel膠。消化細胞，制備無血清的細胞懸液，調整細胞數(shù)至2×105個/mL，取200 μL 無血清細胞懸液添加至上室，500 μL 完全培養(yǎng)基添加至下室，遷移實驗培養(yǎng)12 h 后，侵襲實驗培養(yǎng)36 h，之后預冷甲醇固定20 min，結晶紫染色1 h，清水沖洗后，用棉簽擦拭未穿過的細胞，鏡下觀察，隨機選5 個視野拍照計數(shù)并分析。

1.2.5 劃痕實驗 適量的細胞接種至6 孔板，當細胞融合度達95%，用100 μL 槍頭劃一直線，PBS 沖洗劃掉的細胞，添加含1%FBS 和1%雙抗的低濃度血清的培養(yǎng)基，拍照后繼續(xù)在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在0、12、24 h 觀察愈合情況，并拍照保存。用Image J 軟件測各組的劃痕面積。

1.2.6 平板克隆形成實驗 消化實驗所用細胞，制備細胞懸液，調整細胞數(shù)至104個/ mL，吸取30 μL細胞懸液和2 mL DMEM 培養(yǎng)基到6 孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。PBS 沖洗3 遍，冷甲醇固定25 min，結晶紫染色25 min，自來水沖洗后晾干，觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用(±s表示，兩組間均數(shù)比較分析采用t檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Western blot 法驗證轉染效果 Western blot法檢測MDA-MB-231 細胞過表達RSRC2 及降表達RSRC2 后，RSRC2 在MDA-MB-231 細胞中的蛋白表達量的變化。結果顯示：過表達RSRC2 的MDA-MB-231 細胞中RSRC2 的蛋白表達量明顯高于對照組，降表達RSRC2 的MDA-MB-231 細胞中的RSRC2 的蛋白表達量較對照組明顯降低（均P＜0.05），見圖1。

圖1 Western blot 法檢測RSRC2 轉染后的蛋白表達變化Fig 1 Changes in the expression of RSRC2 protein

2.2 RSRC2 對乳腺癌細胞遷移侵襲能力的影響 Transwell 遷移侵襲實驗結果顯示：遷移實驗中，MDA-MB-231 細胞過表達RSRC2 后，與對照組相比，其細胞遷移數(shù)目減少，降表達RSRC2 后，與對照組相比，其細胞遷移數(shù)目明顯增強（均P＜0.05），見圖2。侵襲實驗中，MDA-MB-231 細胞過表達RSRC2 后，其穿過的細胞數(shù)較對照組減少，降表達RSRC2 后，其穿過的細胞數(shù)較對照組增加（均P＜0.001），見圖3。

圖2 RSRC2 對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231 遷移能力的影響（100×）Fig 2 Effect of RSRC2 on the migration of MDA-MB-231 cells（100×）

圖3 RSRC2 對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231 侵襲能力的影響（100×）Fig 3 Effect of RSRC2 on the invasion of MDA-MB-231 cells（100×）

劃痕實驗中，分別于0、12、24 h 進行觀察拍照，結果顯示，過表達RSRC2 后的MDA-MB-231 細胞較對照組愈合能力減弱，而降表達RSRC2 后，其結果相反（均P＜0.01），見圖4。

圖4 RSRC2 對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231 愈合能力的影響（40×）Fig 4 Effect of RSRC2 on the healing ability of MDA-MB-231 cells（40×）

2.3 RSRC2 對細胞增殖能力的影響 平板克隆形成實驗中，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d 后，終止培養(yǎng)，固定、染色、拍照，結果顯示RSRC2 過表達、降表達和對照組的細胞都能形成克隆，但是RSRC2 降表達組形成的克隆數(shù)目明顯多于對照組，而RSRC2 過表達組的結果正好與之相反，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖5。

圖5 RSRC2 對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231 增殖能力的影響Fig 5 Effect of RSRC2 on the proliferation of MDA-MB-231 cells

3 討論

乳腺癌具有異質性，其少見亞型三陰性乳腺癌具有獨特的病理、遺傳和臨床特征[6]。由于缺乏內(nèi)分泌治療及抗HER2 治療的有效靶點，至今仍未有針對性的標準的治療方案，在臨床上，化療仍是治療三陰性乳腺癌的主要手段[7]。由于三陰性乳腺癌的高度異質性，使癌細胞對紫杉醇等化療藥物易產(chǎn)生耐藥，部分三陰性乳腺癌患者預后不良，因此迫切需要尋找新的分子靶點，為三陰性乳腺癌治療提供可能的新思路[8-9]。

RSRC2 屬于富含精氨酸/絲氨酸家族中的成員，在多種腫瘤中呈低表達。研究顯示，RSRC2 過表達后可以顯著抑制食管癌細胞系TE8 的增殖能力[5]。在結腸癌中的研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子信號轉導抑制因子3（SOCS3）降表達細胞的增殖、遷移、侵襲等惡性生物學行為增強，同時伴有RSRC2 表達水平的降低[10]。SOCS3 屬于細胞因子信號轉導家族，它能抑制Janus 激酶（JAK）活性和其下游信號轉導及轉錄激活因子（STAT）蛋白的磷酸化，阻止JAK/STAT 信號通路的激活，進而抑制腫瘤細胞生長、增殖、侵襲和遷移[11-13]。因此，RSRC2 可能是SOCS3 下游效應因子。本研究通過平板克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，過表達、降表達及對照組的細胞均能形成克隆，但是形成克隆的數(shù)量存在差異：過表達組明顯少于對照組，而降表達組多于對照組。因此，本研究結果表明RSRC2在三陰性乳腺癌細胞中發(fā)揮了腫瘤抑制基因的作用，其表達能夠抑制腫瘤細胞的增殖。

另有研究發(fā)現(xiàn)，RSRC2 是調控CD40 的調節(jié)蛋白，人類B 細胞系BL2 中RSRC2 降表達后，CD40 的蛋白表達量相應的增加[14]。CD40 是Ⅰ型跨膜糖蛋白，在腫瘤侵襲、轉移及血管生成中發(fā)揮重要作用[15-17]。此外，文獻報道，RSRC2 在胰腺導管癌中的表達水平明顯低于正常胰腺組織，且與胰腺導管癌的臨床分期呈負相關[18]。RSRC2 表達量與食管癌浸潤深度、淋巴結轉移、血管浸潤呈顯著負相關，低表達RSRC2的患者預后差[5]。本課題組的前期研究通過免疫組化檢測了RSRC2 在三陰性乳腺癌中的表達情況，發(fā)現(xiàn)癌組織中RSRC2 的表達量明顯低于癌旁組織。RSRC2 蛋白水平的高低與生存率呈正相關，RSRC2 表達陽性患者生存時間長[19]。本研究通過遷移、侵襲實驗及劃痕實驗發(fā)現(xiàn)降表達RSRC2 后，三陰性乳腺癌細胞的侵襲、遷移能力增強，這些體外實驗結果說明了RSRC2 能夠抑制三陰性乳腺癌細胞的遷移及侵襲等惡性生物學行為，從而在三陰性乳腺癌的進展中發(fā)揮重要作用。

DNA 甲基化是一種重要的表觀遺傳調控機制。大量研究已經(jīng)證實，異常的DNA 甲基化通過沉默抑癌基因的表達而增強腫瘤細胞的惡性行為，因此它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[20]。Kurehara 等[5]提出RSRC2 潛在下調機制是RSRC2 的高甲基化。Hernandez-Vargas 等[21]通過KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞中參與JAK/STAT 信號通路的基因表達降低與顯著的高甲基化有關。Dong 等[10]研究表明，SOCS3 調節(jié)RSRC2 的表達，且兩者表達水平呈正相關，而SOCS3 通過抑制JAK/STAT 信號通路而在腫瘤進展中發(fā)揮抑制作用。由此，筆者猜測RSRC2的高甲基化引起其表達下調，下調的RSRC2 通過激活JAK/STAT 信號通路，從而在三陰性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中起作用。

綜上所述，RSRC2 在三陰性乳腺癌組織中呈現(xiàn)低表達，降低RSRC2 表達后，三陰性乳腺癌細胞的惡性生物學行為隨之增強，表明RSRC2 在三陰性乳腺癌的進展中可能起腫瘤抑制基因的作用，其抑制作用的發(fā)揮可能是通過抑制JAK/STAT 信號通路的激活來實現(xiàn)的。接下來，筆者將進行大量的體內(nèi)外實驗驗證RSRC2 通過抑制JAK/STAT 信號通路激活而發(fā)揮抑制作用這一猜想的正確性，旨在為三陰性乳腺癌治療提供一些新依據(jù)。