高健，史小雨，王倩

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，天津300070）

瘧疾（malaria）是一種古老的傳染病，主要由受瘧原蟲（Plasmodium）感染的雌性按蚊叮咬人體所致。根據(jù)《2018 年世界衛(wèi)生組織瘧疾報告》顯示，2017 年全球共發(fā)生2.19 億例瘧疾病例，雖較2010 年減少2 000 萬例，但與2016 年的2.17 億例相比卻有所回升，表明近年在減少全球瘧疾病例方面進展有限[1]。

反向遺傳學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于瘧原蟲基因功能研究，推動了瘧原蟲生物學(xué)及其與宿主相互作用的研究[2]?；谕粗亟M原理，可實現(xiàn)特定基因的敲除，從而研究瘧原蟲基因功能；還可在瘧原蟲基因組中表達標(biāo)簽蛋白，更直觀地探究瘧原蟲的感染過程。此外，由于目前可用于瘧原蟲基因組改造的耐藥篩選標(biāo)簽數(shù)量有限，阻礙了對同一瘧原蟲基因組的連續(xù)改造[3]。為了避免這一問題，可以將熒光蛋白用作篩選標(biāo)記，有利于快速直觀地篩選發(fā)生基因改變的瘧原蟲[4]。為了更直觀地探究特定基因在瘧原蟲發(fā)育及侵染過程中的作用，本研究構(gòu)建并篩選出胞漿中表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的伯氏瘧原蟲。利用瘧原蟲敲除載體pL0035，構(gòu)建pL0035-GFP 重組質(zhì)粒，在伯氏瘧原蟲（Plasmodium berghei, P. berghei） 常用基因組改造位點230p（PbANKA_0306000）中，基于雙交換（doublecrossover）的同源重組（homologous recombination，HR）原理，將GFP引入到瘧原蟲基因組中，構(gòu)建表達GFP 的瘧原蟲突變體并篩選單克隆突變株，為本實驗室后續(xù)探究特定基因在瘧原蟲發(fā)育和致病過程中的作用提供了必要工具。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和瘧原蟲株 感受態(tài)細胞Mach1-T1購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司，大腸桿菌載體pL0035 于本實驗室保存，伯氏瘧原蟲P. bergheiANKA 由羅格斯大學(xué)新澤西醫(yī)學(xué)院Purnima Bhanot教授贈予。

1.2 主要材料和試劑 限制性內(nèi)切酶SacⅡ、XhoⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、ApaⅠ及NEBuilder?HiFi DNA Assembly 試劑盒購自NEB 公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR 純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒均購自全式金生物技術(shù)有限公司。質(zhì)粒中提試劑盒購自Qiagen 公司。T4 DNA 連接酶購自Thermo Scientific 公司，乙胺嘧啶購自Sigma 公司，細胞核轉(zhuǎn)染試劑盒購自Lonza公司。

1.3 質(zhì)粒pL0035-GFP 的構(gòu)建

1.3.1 獲取目的片段 以野生型伯氏瘧230p基因的編碼區(qū)（1~6 864 bp）為模板分別合成同源重組上、下游同源臂Up HR arm（1 612~2 165 bp）和Down HR arm（3 315~4 232 bp）。用本實驗室保存的含有GFP、eEF1A promoter 和3′yop1/terminal sequence（ts）的質(zhì)粒擴增GFP（753 bp）、eEF1A（595 bp）和GFP/ts（754 bp），并引入相應(yīng)酶切位點（表1）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后切膠回收。

1.3.2 載體和目的片段連接 利用In-Fusion 無縫克隆的方法（條件為50°C，30 min）將Down HR arm插入經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅠ酶切的質(zhì)粒pL0035，得到pL0035-Down HR arm。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞Mach1-T1 中，在含有氨芐的固體培養(yǎng)基上37°C倒置培養(yǎng)12 h，挑取單克隆菌株后，在含氨芐的液體培養(yǎng)液中擴增并提取質(zhì)粒，酶切鑒定及DNA 測序確認Down HR arm 插入且序列正確。以GFP 和GFP/ts 為模板通過overlap PCR 擴增得到片段GFP-GFP/ts（1 477 bp），再將Up HR arm 和GFPGFP/ts 通過overlap PCR 擴增得到片段Up HR arm-GFP-GFP/ts（2 053 bp）。將經(jīng)SacⅡ酶切的pL0035-Down HR arm 質(zhì)粒和片段Up HR arm-GFP-GFP/ts，在T4 DNA 連接酶的作用下16°C 連接16 h，再將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞Mach1-T1 中進行氨芐篩選培養(yǎng)，挑取單克隆菌株并擴增提取質(zhì)粒，酶切鑒定及測序確認序列正確。XhoⅠ和EcoRⅠ酶切上述得到的質(zhì)粒和片段eEF1A，利用T4 DNA 連接酶將二者連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞，固態(tài)培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)后擴增單克隆菌株提質(zhì)粒，測序驗證，得到重組質(zhì)粒pL0035-GFP。大量制備重組質(zhì)粒，經(jīng)ApaⅠ和EcoRⅠ線性化后備用。

表1 載體構(gòu)建引物序列Tab 1 Primer sequences of vector construction

1.4 瘧原蟲轉(zhuǎn)染 將實驗室凍存的伯氏瘧原蟲（P. bergheiANKA） 感染血液經(jīng)尾靜脈注射感染W(wǎng)istar 大鼠。尾尖取血制薄血片，Giemsa 染色后油鏡下觀察計數(shù)蟲血率。待蟲血率增長至3%~5%時，心臟取血（約5 mL），體外同步化培養(yǎng)16~23 h，直至80%左右的瘧原蟲發(fā)育為成熟裂殖體[5]。利用Nycodenz/PBS 密度梯度溶液分離純化裂殖體，置于冰上備用。取100 μL Nucleofector 溶液、10 μg 線性化重組質(zhì)粒pL0035-GFP 及30 μL 裂殖體輕柔混勻電擊，迅速經(jīng)尾靜脈注入BALB/c 小鼠。

1.5 重組瘧原蟲篩選與單克隆篩選 電轉(zhuǎn)染次日，如感染小鼠蟲血率為陽性，則在小鼠飲用水中加入乙胺嘧啶進行耐藥瘧原蟲篩選。發(fā)生重組的瘧原蟲帶有抗乙胺嘧啶的耐藥標(biāo)簽，可在給藥條件下存活，從而篩選出重組瘧原蟲，適時停藥。待蟲血率達5%后，心臟取血并純化瘧原蟲，提取瘧原蟲基因組DNA，PCR 鑒定基因型。采用有限稀釋法篩選單克隆蟲株。

1.6 表達GFP 的重組瘧原蟲的紅內(nèi)期成像與流式檢測 表達GFP 瘧原蟲感染小鼠，待蟲血率較高時，尾尖取少許血，PBS 清洗1 次，200 g 離心1 min 棄上清，加入20 μL DAPI 工作液避光孵育10 min，再用PBS 清洗1 次，去上清，加少許PBS 重懸，吸取10 μL液體至載玻片，加蓋蓋玻片，熒光顯微鏡觀察、拍攝。分別取20 μL 感染野生型和表達GFP 的瘧原蟲小鼠外周血，以5 mL PBS 稀釋，300 目濾布過濾后用流式細胞儀檢測綠色熒光。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建胞漿表達GFP 伯氏瘧原蟲的策略 本研究在伯氏瘧原蟲基因組230p處插入GFP，以產(chǎn)生表達GFP 的瘧原蟲突變株。將重組質(zhì)粒pL0035-GFP 導(dǎo)入瘧原蟲基因組，轉(zhuǎn)染后發(fā)生第1 次同源重組（圖1），230p基因部分編碼區(qū)（2 166~3 314 bp）被質(zhì)粒上的GFP及耐藥標(biāo)簽替換，獲得表達GFP 的耐乙胺嘧啶的重組瘧原蟲（陽性篩選）。為了后續(xù)在此瘧原蟲突變株上進一步進行基因改造，需借助第二次同源重組在上述突變瘧原蟲中刪除耐藥標(biāo)簽，同源臂為質(zhì)粒上的序列3′pbdhfr/ts。在5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）作用下，含有標(biāo)簽蛋白酵母雙功能胞嘧啶脫氨酶和尿苷基磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（yeast enzyme cytosine deaminase and uridyl phosphoribosyl transferase，yFCU）的重組瘧原蟲可將5-FC 轉(zhuǎn)化為毒性化合物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）而死亡；在5-FC 的壓力下發(fā)生第2 次同源重組的瘧原蟲（圖1），即耐藥標(biāo)簽DHRF-yFCU 被刪除的瘧原蟲可繼續(xù)存活，從而刪除耐藥標(biāo)簽（陰性篩選），獲得可用于再次基因改造的表達GFP 的瘧原蟲。

圖1 表達GFP 伯氏瘧原蟲的構(gòu)建策略Fig 1 Strategy of GFP-expressing P.berghei construction

2.2 重組質(zhì)粒pL0035-GFP 的構(gòu)建 重組質(zhì)粒的構(gòu)建分為3 個步驟（圖2）。第一步，GFP 與GFP/ts片段通過overlap PCR 連接得到GFP-GFP/ts 片段（1 507 bp），并在3′端引入SacⅡ酶切位點，PCR 產(chǎn)物膠回收測序正確（圖3A）。第二步，5′端引入SacⅡ酶切位點的Up HR arm 片段與GFP-GFP/ts 片段通過overlap PCR 連接得到Up HR arm-GFP-GFP/ts片段，同時在Up HR arm 與GFP 之間引入XhoⅠ和EcoRⅤ兩個酶切位點。片段Up HR arm-GFP-GFP/ts在SacⅡ酶切位點處插入質(zhì)粒pL0035-Down HR arm，經(jīng)SacⅡ酶切鑒定顯示插入片段大小正確（圖3B），質(zhì)粒測序證明插入片段序列無誤。第三步是借助上述引入的酶切位點XhoⅠ和EcoRⅤ將eEF1A promoter 插入Up HR arm 和GFP 之間，最終獲得pL0035-GFP 重組質(zhì)粒，經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅤ酶切鑒定片段大小正確（圖3C），測序無誤。

圖2 質(zhì)粒pL0035-GFP 的構(gòu)建示意圖Fig 2 Schematic diagram of pL0035-GFP

圖3 質(zhì)粒pL0035-GFP 的PCR 鑒定Fig 3 PCR identification of pL0035-GFP

2.3 伯氏瘧原蟲轉(zhuǎn)染后重組子的鑒定 轉(zhuǎn)染后經(jīng)乙胺嘧啶藥物篩選獲得重組瘧原蟲。經(jīng)單克隆篩選后共獲得4 個蟲株A1、B4、C2 和C4，提取瘧原蟲基因DNA 進行PCR 鑒定基因型，A1、B4、C2 和C4 均有重組條帶而無野生型條帶（圖4），為單克隆的重組子（基因型鑒定引物見表2）。

圖4 PCR 鑒定瘧原蟲轉(zhuǎn)染重組子Fig 4 Recombinant Plasmodium verified by PCR

2.4 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pL0035-GFP 的瘧原蟲在紅內(nèi)期表達GFP 單克隆重組瘧原蟲DAPI 染核后熒光顯微鏡觀察，可見瘧原蟲胞漿顯示綠色熒光（圖5）。流式細胞術(shù)也可檢測到重組瘧原蟲的綠色熒光信號（圖6）。上述結(jié)果均提示表達GFP 的伯氏瘧原蟲構(gòu)建成功。

表2 PCR 鑒定瘧原蟲轉(zhuǎn)染重組子基因型引物序列Tab 2 PCR primers of genotype identification of integrated parasites

圖6 流式細胞術(shù)檢測重組瘧原蟲的綠色熒光信號Fig 6 Green fluorescent signal of recombinant Plasmodium detected by flow cytometry

圖5 熒光顯微鏡觀察重組瘧原蟲表達GFPFig 5 Expression of GFP in recombinant Plasmodium observed by fluorescence

3 討論

瘧疾是由瘧原蟲感染引起的寄生蟲病，主要傳播媒介是按蚊[6]。瘧原蟲的生活史復(fù)雜，其與宿主之間的相互作用是瘧原蟲在哺乳動物和按蚊體內(nèi)寄生的基礎(chǔ)[6-8]。為了研究宿主-瘧原蟲間相互作用，基因修飾技術(shù)發(fā)揮了巨大的作用，包括對特定基因修改、刪除和插入?；谕粗亟M原理的基因敲除技術(shù)在研究瘧原蟲特定蛋白功能方面發(fā)揮了重要的作用。此外，在改造特定基因序列的基礎(chǔ)上，還可引入各種標(biāo)簽蛋白，特別是各種熒光蛋白，如將綠色熒光蛋白或生物熒光素酶（Luciferase）引入其基因組中，從而實現(xiàn)體內(nèi)和體外實時追蹤瘧原蟲及其與宿主之間的相互作用[9-10]。在研究特定蛋白的定位、轉(zhuǎn)運及其與宿主間的相互作用等方面均起重要作用[11]。目前，綠色熒光蛋白應(yīng)用較為廣泛，除了可與特定蛋白融合表達研究該蛋白的定位等功能，還可以在瘧原蟲體內(nèi)穩(wěn)定持續(xù)表達，用于追蹤瘧原蟲在各個階段的寄生情況，例如用GFP 標(biāo)記環(huán)子孢子蛋白可用于研究哺乳動物肝細胞和按蚊體內(nèi)瘧原蟲-宿主間相互作用[12]；對于胞漿穩(wěn)定持續(xù)表達GFP 的瘧原蟲，可以直觀地觀察瘧原蟲發(fā)育和侵染的整個過程[13-15]。

本研究構(gòu)建胞漿中表達GFP 的伯氏瘧原蟲。230p（PbANKA_0306000）是瘧原蟲基因組常用的一個改造位點，破壞瘧原蟲的230p不會產(chǎn)生任何表型[16]。因此，在230p基因處插入并表達GFP。本研究篩選獲得的重組瘧原蟲可持續(xù)表達GFP，且不含耐藥標(biāo)簽，可用于后續(xù)研究特定蛋白功能時再次進行基因改造，并可直觀的觀察瘧原蟲的侵染過程。此外，還可通過流式細胞術(shù)等方法檢測重組瘧原蟲感染小鼠的蟲血率并進行感染紅細胞的分選；還可以根據(jù)熒光強度對瘧原蟲不同發(fā)育階段進行分期，如滋養(yǎng)體、裂殖體和裂殖子等階段，在模式識別軟件的分析下實現(xiàn)自動化計數(shù)和分類。綜上，本研究獲得的胞漿表達GFP 的伯氏瘧原蟲為后續(xù)研究瘧原蟲特定蛋白功能及其致病機制提供了一個有力的工具。